铁皮石斛1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶基因的克隆与表达分析

目的从铁皮石斛Dendrobium officinale中克隆1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶[1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphatereductase,HDR]基因,并分析其在铁皮石斛不同组织中的表达差异以及不同信号分子诱导下的表达模式。方法采用RT-PCR和RACE等方法获得铁皮石斛HDR基因(Do HDR)全长,利用DNAMAN和MEGA6.0对其他物种的HDR基因编码的氨基酸序列进行同源性分析和进化关系分析,使用实时荧光定量分析HDR基因的表达模式。结果成功获得Do HDR基因,Gen Bank登录号为KC344827,全长1 658 bp,编码460个氨基酸,与其他科属植物的同源性达到80%以上。Do HDR基因在铁皮石斛叶片中表达量最高,从高到低依次是根、茎、原球茎;且受到脱落酸(abscisic acid,ABA)、水杨酸(salicylic acid,SA)信号分子的诱导。结论从铁皮石斛中获得Do HDR基因,为进一步阐明铁皮石斛萜类化合物合成途径中该基因的重要作用奠定了理论基础。     

NO对石斛类原球茎生长及继代培养的影响

为提高组织培养的药用石斛生物碱含量,利用一氧化氮(NO)的供体硝普钠(SNP)处理霍山杂交石斛液体悬浮培养的类原球茎。结果表明,NO对类原球茎生长有一定的抑制作用,但有利于生物碱的积累。NO处理的类原球茎在生物碱积累高峰期45 d前,发生活性氧迸发,过氧化氢抗氧化酶(CAT)活性提高明显。类原球茎继代培养表明,不经NO诱导的S0、S00、S0003代类原球茎的蛋白质SDS电泳条带和POD同工酶条带基本一致,NO处理使蛋白质条带和POD同工酶条带出现差异性。NO处理后类原球茎生物碱含量的提高不能在继代培养中得到保持。     

铁皮石斛倍半萜合成酶基因的克隆与表达分析

目的克隆铁皮石斛Dendrobium officinale倍半萜合成酶(sesquiterpene synthase,SES)基因,分析其在铁皮石斛不同组织中的表达差异以及在信号分子茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)诱导下的表达模式。方法采用RACE技术克隆铁皮石斛SES(DoSES)cDNA全长,利用相关软件和在线网站对其进行生物信息学分析,并使用实时荧光定量PCR技术分析DoSES的表达模式。结果获得的DoSES cDNA序列(Gen Bank登录号为KX278311)全长1 890 bp,含有1个1 659 bp的完整开放阅读框(ORF),编码552个氨基酸的多肽链,与其他科属植物的同源性达到60%左右。DoSES基因在铁皮石斛茎中表达量最高,从高到低依次是叶、花、原球茎、根;且受到Me JA的诱导。结论克隆了铁皮石斛DoSES基因,为进一步研究调控铁皮石斛萜类代谢奠定了理论基础。     

铁皮石斛转录因子基因DoWRKY1的克隆与表达分析

WRKY转录因子是植物中发现的新型转录调控因子,在调控植物生长发育和代谢等生理过程中发挥重要作用。该研究采用RT-PCR和RACE技术从铁皮石斛Dendrobium officinale中克隆得到一个新的WRKY转录因子基因cDNA全长,命名为DoWRKY1,提交GenBank获得登录号KF716131。生物信息学分析表明,该基因全长cDNA为1 704 bp,其中开放阅读框 (ORF) 1 629 bp,编码1条由542个氨基酸组成的多肽,具有2个WRKY保守结构域,属于WRKY家族第Ⅰ类转录因子。酵母单杂交表明,DoWRKY1可以激活下游报告基因 (His3,Ade2) 的表达,具有转录激活功能,属于转录激活子。半定量RT-PCR显示,DoWRKY1在根、茎、叶和类原球茎中均有表达。qRT-PCR分析表明,DoWRKY1响应茉莉酸甲酯 (MeJA) 和壳聚糖 (chitosan) 诱导,分别在2 h和1 h,表达量达到最高峰。研究结果为进一步研究其在铁皮石斛次生代谢过程的调控功能奠定基础。     

石斛属几种植物遗传关系的SRAP和RAPD 比较分析

目的 利用 SRAP 和 RAPD 两种分子标记技术对9份石斛种质进行遗传多样性研究。方法 用 40 对 SRAP 引物组合和 36 个 RAPD 引物分别对供试石斛的基因组 DNA 进行扩增。结果 SRAP 引物组合共扩增条带 1 977 条,多态性比率为 90.2%,遗传相似系数 GS 值变化范围为 0.330 2～0.789 2。RAPD 引物共扩增出 281 条带,多态性比率为 87.1%,GS 值变化范围为 0.494 2～0.773 1。利用两种标记得到的聚类结果存在一定的差异,SRAP 聚类结果与传统的基于形态特征建立的分类结果比较一致,较好地体现了供试品种的亲缘关系、地域特性。在 9 个石斛供试种间,SRAP 的标记指数 MI 值 (16.46) 是 RAPD 标记 MI 值 (3.67) 的 4.5 倍,表明 SRAP 具有更大的标记效率。结论 两种标记皆可有效应用于该属植物种质资源的遗传多样性分析。而 SRAP 标记在石斛的遗传多样性与亲缘关系的研究中,则表现出了极大的优越性。     

铁皮石斛HDS基因的克隆与初步表达分析

目的从铁皮石斛Dendrobium officinale中克隆4-羟基-3-甲基-2-E-丁烯基-1-焦磷酸合成酶(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-yl diphosphate synthase,HDS)基因,在大肠杆菌中诱导融合蛋白,并探究该基因在铁皮石斛不同组织中的表达规律。方法采用RT-PCR和RACE等方法获取铁皮石斛HDS(Do HDS)的c DNA全长,利用相关软件和在线网站进行生物信息学分析,使用Real-Time PCR分析Do HDS在不同组织的表达特征,构建原核表达载体p ET-28a(+)-Do HDS,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。结果成功获得Do HDS的c DNA全长序列,Gen Bank登录号为KJ161312,全长2 666 bp,ORF为2 238 bp,编码745个氨基酸。Do HDS在各组织中均有表达,在茎中表达量最高,为原球茎的5倍;SDS-PAGE结果显示诱导产物为1个相对分子质量(82 700)与理论值相符的融合蛋白。结论克隆了Do HDS的c DNA全长序列,探究其在不同组织中的表达模式,建立了原核表达体系,为后续研究Do HDS的功能提供了一定的理论基础。     

药用石斛遗传多样性的SRAP标记研究

目的:利用SRAP分子标记技术进行药用石斛的遗传多样性研究。方法:采用在本实验中优化的SRAP反应体系,应用NTSYS软件对9种供试石斛的SRAP-PCR结果进行分析。结果:从中筛选得到40对多态性引物组合,共产生1 782条多态性条带,平均每个引物组合产生44.55条多态性条带,显示了较高的多态性比率。聚类分析40对引物组合的扩增结果,供试材料分为2大类,Jaccard’s遗传相似系数在0.3302~0.7892。结论:SRAP技术可有效地应用于药用石斛的遗传多样性及亲缘关系的研究。     

石斛属几种植物遗传关系的SRAP和RAPD比较分析

目的 利用SRAP和RAPD两种分子标记技术对9份石斛种质进行遗传多样性研究.方法 用40对SRAP引物组合和36个RAPD引物分别对供试石斛的基因组DNA进行扩增.结果 SRAP引物组合共扩增条带1 977条,多态性比率为90.2%,遗传相似系数GS值变化范围为0.330 2～0.789 2.RAPD引物共扩增出281条带,多态性比率为87.1%,GS值变化范围为0.494 2～0.773 1.利用两种标记得到的聚类结果存在一定的差异,SRAP聚类结果与传统的基于形态特征建立的分类结果比较一致,较好地体现了供试品种的亲缘关系、地域特性.在9个石斛供试种间,SRAP的标记指数MI值(16.46)是RAPD标记MI值(3.67)的4.5倍,表明SRAP具有更大的标记效率.结论 两种标记皆可有效应用于该属植物种质资源的遗传多样性分析.而SRAP标记在石斛的遗传多样性与亲缘关系的研究中,则表现出了极大的优越性.