高糖对视网膜Müller细胞VEGF,EPO和EPOR mRNA表达的影响

目的:观察高糖条件下VEGF mRNA,EPO mRNA和EPORmRNA在体外培养的Mller细胞中的表达情况。方法:胰蛋白酶将新生小鼠视网膜组织吹打消化后,制成单细胞悬液,体外培养Mller细胞,RT-PCR测定高糖条件下视网膜Mller细胞VEGF,EPO和EPOR基因的表达。结果:成功获得视网膜Mller细胞,传代后90%以上的细胞呈兔抗鼠谷氨酰胺合酶(GS)染色阳性。Mller细胞VEGF mRNA,EPO mRNA和EPOR mRNA在高糖条件下表达升高,且呈浓度依赖性(P<0.05),但糖浓度50mmol/L组较40mmol/L组差异无统计学意义,无明显时间依赖性。结论:Mller细胞在高糖条件下VEGF,EPO,EPOR的表达增加。     

高糖对人脐静脉内皮细胞促红细胞生成素受体表达的影响

目的探讨高糖条件下促红细胞生成素（EPO）受体mRNA及蛋自在人脐静脉内皮细胞（UVECs）的表达差异。方法体外常规培养人UVECs细胞株,实验组分别给予22mmol／L葡萄糖作用12、24、48、72h,5．5mmol／L葡萄糖组（生理糖浓度）设为正常对照组,5．5mmol／L葡萄糖＋16．5mmol／L甘露醇组为渗透压对照组。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）、免疫细胞化学法对高糖条件下人UVECsEPO受体mRNA和蛋白的表达进行检测。结果正常对照组和渗透压对照组相比,人UVECsEPO受体mRNA和蛋白表达差异均无统计学意义（P〉0．05）。人UVECs在22mmol／L高糖作用12、24、48、72h后,EPO受体mRNA和蛋白表达均显著高于正常对照组（P〈0．05）,且随着时间的延长,EPO受体mRNA和蛋白的表达均逐渐增加。结论高糖条件下人UVECsEPO受体mRNA和蛋白表达均增强,且呈时间依赖性。人UVECs在22mmol／L高糖条件下EPO受体mRNA及蛋白表达的增加与渗透压无关。     

视网膜脱离模型中外源性促红细胞生成素对其受体表达的影响

目的探讨外源性促红细胞生成素（EPO）对促红细胞生成素受体（EPOR）在脱离的视网膜中表达的影响。方法通过视网膜下腔注射质量分数1.4%透明质酸钠在60只SD大鼠的右眼建立视网膜脱离（RD）模型,12只正常SD大鼠为正常对照组。不同组RD模型眼（每组12只眼）玻璃体腔内分别注射PBS或100、200、400ng重组大鼠源性EPO。玻璃体注射后3d应用Westernblot法半定量检测各组SD大鼠脱离的视网膜中EPOR蛋白表达水平的变化并进行比较,应用免疫组织化学法定位检测脱离的视网膜中EPOR蛋白的表达。结果 Westernblot检测结果表明大鼠正常视网膜中EPOR表达量少,为0.28±0.02;造模后3d,EPOR在脱离的视网膜中表达量明显增加,为0.41±0.05,差异有统计学意义（P〈0.05）。RD＋PBS组、RD＋EPO100ng组、RD＋EPO200ng组和RD＋EPO400ng组EPOR蛋白的表达量分别为0.39±0.03、0.41±0.03、0.43±0.07、0.44±0.05,明显高于对照组,差异均有统计学意义（P〈0.05）,但RD＋PBS组、RD＋EPO100ng组、RD＋EPO200ng组和RD＋EPO400ng组间EPOR蛋白的表达差异均无统计学意义（P〉0.05）。RD组与RD＋不同剂量EPO组比较EPOR表达的差异无统计学意义（P〉0.05）。免疫组织化学检测结果证实EPOR蛋白表达于视网膜各层,RD＋不同剂量的EPO处理组EPOR表达均强于正常对照组。结论 RD发生后补充外源性EPO对EPOR的表达并无影响。     

高糖对人脐静脉内皮细胞促红细胞生成素表达的影响

目的:探讨高糖条件下促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)mRNA和蛋白在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的表达。方法:体外培养HUVECs,实验组分别给予22mmol/L葡萄糖作用6,12,24,48,72h,对照组1为生理糖浓度组(5.5mmol/L),对照组2为甘露醇组(与22mmol/L高糖组等渗)。运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HUVECs EPO mRNA的表达。采用免疫荧光细胞化学方法测定HUVECsEPO蛋白质的表达。结果:HUVECs在22mmol/L高糖刺激12,24,48h后,EPO mRNA和蛋白表达均显著高于对照组1(P<0.05),72h开始下降。结论:HUVECs在高糖条件下EPO mRNA和蛋白表达增强,且与时间相关。EPO表达增加有可能促进新生血管生成。     

薏苡仁油对高糖环境下人视网膜血管内皮细胞增殖和VEGF表达的影响

目的:研究不同浓度的薏苡仁油对体外高糖条件下培养的人视网膜血管内皮细胞(HRCECs)增殖及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法:将新鲜人眼球提取的HRCECs进行体外培养,最终用于实验的为生长良好的第3~4代细胞,实验分为空白对照组、低糖对照组、高糖对照组,高糖+不同浓度(50μL/mL,100μL/mL,200μL/mL)薏苡仁油组。不同浓度的薏苡仁油对体外培养的HRCECs增殖的抑制作用是通过用噻唑蓝比色法(MTT)检测。各分组HRCECs中VEGF的表达由免疫细胞化学法检测。结果:MTT比色法结果显示:不同浓度的薏苡仁油作用于体外培养的HRCECs 48h,其细胞增殖抑制与高糖对照组相比有显著性差异(P<0.05)。48h内呈浓度依赖性。而低糖对照组与高糖对照组差异无统计学差异(P>0.05)。免疫细胞化学检测法表明:用50,100,200μL/mL的薏苡仁油作用于高糖下HRCECs 48h,高糖+不同浓度薏苡仁油组与高糖对照组相比VEGF表达下降明显(P<0.05),将高糖+不同浓度薏苡仁油组之间进行两两比较亦具有统计学意义(P<0.05)。且呈浓度依赖性。高糖对照组与低糖对照组相比,VEGF表达明显(P<0.05)。结论:薏苡仁油可抑制高糖环境下HRCECs的增殖和VEGF的表达。     

胰岛素对正常糖和高糖浓度下牛视网膜微血管内皮细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的 探讨胰岛素、糖浓度及其两者的联合作用对牛视网膜微血管内皮(BRE)细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法 对照实验研究.采用选择性培养方法,培养BRE细胞,传代后分别在正常糖(5 mmol/L)或高糖(30 mmol/L)浓度下培养3 d,甘露醇平衡渗透压,血清饥饿12 h,给予或不给予100 nmol/L胰岛素作用24 h.实时荧光定量检测VEGF mRNA表达水平;人脐静脉血管内皮细胞增殖法、免疫荧光检测法、免疫印迹法检测VEGF蛋白表达水平.采用SPSS 12.0统计学软件对数据进行分析,胰岛素、糖浓度及其交互作用对BRE细胞的VEGF mRNA和VEGF蛋白表达水平的影响,采用2×2析因设计定量资料方差分析,以P<0.05作为差异有统计学意义.结果 胰岛素或高糖浓度可以显著提高BRE细胞的VEGFmRNA(F=5.67,9.04;均P<0.05)和VEGF蛋白(F=5.50,5.57;均P<0.05)表达水平,但胰岛素联合高糖浓度的作用较其单独作用减弱.结论 高糖浓度下可以降低胰岛素诱导的VEGF表达水平,因此,VEGF可能不是胰岛素治疗导致的糖尿病视网膜病变短期恶化的主要因素.     

促红细胞生成素在视网膜新生血管形成中的作用

促红细胞生成素（EPO）不仅为造血细胞因子，还具有血管生成素的活性，EPO／EPOR系统在体内组织中广泛表达，并参与体内众多生理和病理性血管生成过程。EPO在视网膜新生血管形成中起重要的作用，有望成为预防和治疗缺血性视网膜病变中新生血管化的全新的干预靶点，就EPO在视网膜新生血管形成中的作用进行综述。     

高浓度胰岛素对视网膜Müller细胞VEGF表达的影响

目的探讨在高浓度胰岛素条件下,体外培养的兔视网膜Muller细胞的血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)的变化.方法在不同浓度胰岛素条件下(4,8,12kU/L),体外培养兔视网膜Muiler细胞,采用免疫细胞化学法、原位杂交法,定性测定Muller细胞分泌VEGF的变化,采用ELISA方法,定量测定Muiler细胞分泌VEGF的变化.结果高浓度胰岛素能明显增强VEGF的表达(P<0.05).结论高浓度胰岛素可能通过刺激Miiller细胞编码VEGF基因的转录,进而增强VEGF蛋白的表达,而在糖尿病视网膜病变的新生血管生成中发挥重要作用.     

低氧诱导促红细胞生成素及其受体在人胚胎RPE细胞中的表达

目的研究促红细胞生成素（EPO）及其受体（EPOR）在人视网膜色素上皮（RPE）细胞化学低氧损伤中的表达及意义。方法原代培养人胚胎RPE细胞，应用不同浓度氯化钴造成RPE细胞化学缺氧，应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测RPE细胞增生活力变化，采用免疫组织化学法检测EPO和EPOR在RPE细胞中的表达，应用weslern blot法检测EPO和EPOR蛋白的表达变化。结果不同浓度的CoCl2均促进细胞生长。正常人胚胎RPE细胞检测到EPO和EPOR的弱表达，CoCl2处理组检测到EPO和EPOR的强表达。结论化学缺氧促进人胚胎RPE细胞的增生，EPO及其受体EPOR可能在这个过程中起重要作用。     

高糖对体外培养的视网膜Mǖller细胞活性的影响

背景视网膜Mǖiler细胞具有为视网膜组织提供营养、维持视网膜的正常结构等多种生理功能,研究发现Mǖiler细胞的病变会导致视网膜血管发生相应的改变。探讨高糖对视网膜Mǖiler细胞的影响对于糖尿病视网膜病变（DR）的发病机制研究具有重要意义。目的研究不同浓度的葡萄糖对体外培养的视网膜Mǖiler细胞活性的影响。方法取出生后10d清洁级SD大鼠的视网膜组织,用组织块培养法在含质量分数20％胎牛血清的DMEM培养液中体外原代培养Mǖiler细胞并传代,取第3代细胞用免疫组织化学法对细胞进行鉴定。将不同浓度（5．5、30．0、40．0mmol／L）的葡萄糖加入培养基中培养4d,MTT比色法测定各组波长570nm处Mǖller细胞的吸光度（A570）值,计算各组细胞的相对存活率;采用流式细胞仪检测各组Mǖller细胞的凋亡率。结果培养的细胞贴壁生长,呈长梭形;95％以上细胞神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）反应阳性。MTT比色法检测显示,正常葡萄糖组及30．0mmo／L、40．0mmol／L葡萄糖处理组Mǖller细胞A570值分别为0．24±0．01、0．21±0．03和0．20±0．02,总体差异有统计学意义（F=6．755,P〈0．05）。与正常葡萄糖组比较,30．0mmol／L、40．0mmol／L葡萄糖处理组A570值均明显降低,差异有统计学意义（q=0．645、0．486,P〈0．05）。流式细胞仪检测结果表明,正常葡萄糖组、30．0mmol／L和40．0mmol／L葡萄糖处理组Mǖller细胞凋亡率分别为（26．40±0．25）％、（30．19±0．16）％和（36．23±0．19）％,总体差异有统计学意义（F=294．530,P〈0．05）,与正常葡萄糖组比较,30．0mmol／L、40．0mmol／L葡萄糖组凋亡率均明显升高,差异有统计学意义（q=0．754、0．484,P〈0．05）。结论高浓度葡萄糖可抑制视网膜Mǖller细胞的生长并增加其凋亡率,葡萄糖的上述作用呈浓度依赖性。     

缺氧条件下高糖及高胰岛素对Mller细胞VEGF表达的影响

目的观察缺氧、高糖及高胰岛素对视网膜Muller细胞胞浆内血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法采用组织块悬浮贴壁法原代培养兔视网膜Miiller细胞,于正常和缺氧条件下分别分为对照组、高糖组、高浓度胰岛素组、高糖高浓度胰岛素组,通过AO／EB染色法观察不同缺氧时相Mtiller细胞的凋亡情况,免疫细胞化学染色测定各组Mailer细胞胞浆内VEGF的表达。结果免疫细胞化学技术测定结果显示缺氧条件下1、2、3d各实验组与对照组相比VEGF表达量增加差异均有统计学意义（P〈0．05）。缺氧2d、3d各实验组与正常条件下各实验组相比VEGF表达增加,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论缺氧条件下高糖及高胰岛素环境刺激Mtiller细胞VEGF表达作用增强。     

FK506对高糖培养视网膜Müller细胞血管内皮生长因子表达的抑制作用

背景 视网膜M＆#252;ller细胞可通过表达血管内皮生长因子（VEGF）参与糖尿病视网膜病变（DR）的病理过程.FK506可抑制实体肿瘤及实验性角膜新生血管中VEGF的表达,但其对视网膜M＆#252;ller细胞中VEGF的表达是否有抑制作用鲜见文献报道.目的 观察FK506对高糖培养的大鼠视网膜M＆#252;ller细胞表达血管内皮生长因子（VEGF）的影响.方法 将大鼠永生化视网膜Müller细胞系进行常规培养并将对数生长期的Müller细胞分别接种到96孔培养板中,分别在培养液中加入800.00、400.00、200.00、100.00、75.00、50.00、25.00、12.50和6.25 pg/ml FK506 100 μl/孔（细胞密度为1×10^4个/ml）,MTT比色法确定Müller细胞半数抑制浓度（IC50）的最适FK506质量浓度.将大鼠视网膜Müller细胞系分为正常对照组、FK506组、高糖组和高糖＋ FK506组,分别用高糖DMEM培养液（含50 mmol/L D-葡萄糖）和正常DMEM培养基（含5.5 mmol/L D-葡萄糖）进行培养,并分别在培养基中加入FK506,至质量浓度为75 pg/ml.ELISA法检测培养细胞上清液中VEGF的质量浓度;分别采用逆转录PCR（RT-PCR）和Western blot法检测各组大鼠视网膜Müller细胞中VEGF mRNA及其蛋白的相对表达量,分别以目的基因与内参β-actin吸光度（A）比值和灰度比值表示.结果 光学显微镜下正常对照组、FK506组、高糖组及高糖＋Fk506组培养12、24、48 h的大鼠视网膜Müller细胞均呈多角形,大小一致.致大鼠视网膜Müller细胞IC50的FK506质量浓度为75 pg/ml.正常对照组、FK506组、高糖组和高糖＋FK506组细胞上清中VEGF蛋白的质量浓度分别为（966.46±13.59） pg/ml、（1 059.42±67.43） pg/ml、（16 243.11±3 926.38）pg/ml和（9 467.25±1 525.56） pg/ml,总体差异有统计学意义（F=20.51,P=O.00）,其中高糖组细胞上清中VEGF的质量浓度明显高于正常对照组,差异有统计学意义（P=0.00）;高糖＋FK506组较高糖组细胞上清中VEGF的质     

促红细胞生成素与促红细胞生成素受体在大鼠脱离视网膜中的表达

目的 观察促红细胞生成素（EPO）和促红细胞生成素受体（EPOR）在大鼠脱离视网膜中的表达情况。方法48只雄性SD大鼠,随机分为正常对照组、视网膜脱离（RD）后1、3、6、12、24、48、72 h组,每组6只大鼠12只眼。视网膜下腔单次注射1.4%透明质酸钠致上半侧视网膜隆起建立RD模型,采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western blot）测定不同时间点EPO和EPOR的mRNA和蛋白水平的表达情况,同时采用免疫组织化学方法观察EPO和EPOR在视网膜中定位表达的情况。结果 EPO和EPOR的mRNA表达水 平在RD后均上调,均于RD后48 h达到高峰,分别于RD后6、12 h显著高于正常对照组,差异具有统计学意义（P＜0.05）;同样,EPO和EPOR的蛋白表达水平也在RD后均增高并在RD后48 h达到高峰,均于RD后3 h显著高于正常对照组,差异具有统计学意义（P＜0.05）。免疫组织化学结果显示正常视网膜自神经节细胞层至光感受器细胞的内外节均有EPO弱表达,RD后48 h视网膜相应部位呈强阳性表达;正常视网膜自神经节细胞层至光感受器细胞的内节均有EPOR表达,RD后48 h视网膜相应部位呈强阳性着染。结论 RD后大鼠视网膜EPO和EPOR表达均逐渐增强,48 h达到高峰;大鼠神经视网膜大部分层次能表达EPO和EPOR。     

缺氧对视网膜Müller细胞促红细胞生成素mRNA和蛋白表达的影响

目的 探讨缺氧条件下促红细胞生成素（EPO）mRNA及蛋白在体外培养的Müller细胞的表达情况。 方法 胰酶消化新生大鼠视网膜组织制成单细胞悬液，机械震荡、吹打法分离纯化视网膜Müller细胞，反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫细胞化学方法对缺氧条件下视网膜Müller细胞EPO基因和蛋白的表达进行测定。 结果 成功获得视网膜Müller细胞，传代后95%以上的细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色阳性。EPO蛋白的阳性染色位于视网膜Müller细胞的细胞浆及突起上。在正常的视网膜Müller细胞中仅见微弱的EPO mRNA和蛋白表达，而缺氧后表达明显上调，且呈时间依赖性。 结论 Müller细胞在缺氧条件下EPO mRNA和蛋白表达增强，EPO表达水平的升高可能是缺氧性视网膜病变的神经保护因素之一。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 196-199)     

TGF—β2干预的缺氧状态下补肾活血剂对Muller细胞及谷氨酰胺合成酶活性的影响

目的观察在缺氧和（或）转化生长因子-β2（TGF—β2）干预条件对体外培养的Muller细胞活力以及谷氨酰胺合成酶（GS）的影响。方法用出生7d的SD大鼠体外培养视网膜Muller细胞，将第2代细胞在含20％胎牛血清的DMEM中培养24h后，换用无血清的DMEM孵育24h。分组为：空白血清对照组（20％正常SD大鼠血清的DMEM）；TGF—β2组（20％正常SD大鼠血清的DMEM及终质量浓度为150ng／L的TGF—β2）；模拟缺氧组（20％正常SD大鼠血清的DMEM及终浓度1．0mmol／L的连二亚硫酸钠）；TGF—β2＋缺氧组（20％正常SD大鼠血清的DMEM液、终浓度1．0mmol／L的连二亚硫酸钠和终质量浓度为150ng／L的TGF—β2）；中药血清组（20％中药SD大鼠血清的DMEM）；中药血清＋TGF—β2＋缺氧组（20％中药SD大鼠血清的DMEM、终浓度1．0mmol／L的连二亚硫酸钠和终质量浓度为150ng／L的TGF—β2）。以透射电镜观察视网膜Muller细胞超微结构、以490型酶标仪测定细胞外液乳酸脱氢酶（LDH）释放量及GS活性。结果在缺氧条件下Muller细胞的超微结构发生明显的改变，如：细胞核变形，固缩；细胞器破坏；微绒毛内糖原明显增多。与正常对照组比较，TGF-β2干预组、缺氧组、TGF-β2＋缺氧组的LDH释放量均明显增加（P〈0．05），缺氧组、TGF—β2＋缺氧组的GS活性均明显下降（P〈0．01）；与缺氧组比较，TGF-β2＋缺氧组的LDH释放量明显增加、GS活性明显下降（P〈0．05、P〈0．01）。补肾活血中药血清能降低24h及48h时正常以及TGF—β2与缺氧同时存在条件下LDH的释放量（P〈0．05），增强12h时正常条件下以及12h和24h时TGF-β2与缺氧同时存在条件下GS的活性（P〈0．05、P〈0．01）。结论TGF—β2可加重缺氧条件下Muller细胞活力与GS活性的降低；补肾活血中药含药血清能增强视网膜Muller细胞活力及GS活性。