CRISPR1上游侧翼序列用于大肠埃希菌和志贺菌鉴定的效果评价

目的 探讨基于成簇规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）1上游侧翼序列对大肠埃希菌和志贺菌鉴定和评价效果。方法 通过BLAST重复序列识别并获得全基因组测序大肠埃希菌和志贺菌的CRISPRs和CRISPR相关基因（CRISPR-associated,cas）,并分析其种系;选取CRISPRs上、下游各500 bp侧翼序列,使用Clustal X进行序列比对;采用PCR方法扩增CRISPR1上游侧翼序列,以确定其对大肠埃希菌和志贺菌鉴定和评价效果。结果 73.4%（149/203）的大肠埃希菌存在I-E型CRISPR/Cas系统,包含了A、B1、D种系;8.4%（17/203）的大肠埃希菌存在I-F型CRISPR/Cas、17.2%（35/203）的大肠埃希菌不存在CRISPR/Cas,这2种大肠埃希菌均属于B2种系;9株志贺菌均存在I-E型CRISPR/Cas。在大肠埃希菌（B2种系外）、志贺菌CRISPR1上游和大肠埃希菌（B2种系）各存在61 bp侧翼序列,序列一致性为99%,且有种属特异性,PCR扩增此区域鉴定大肠埃希菌和志贺菌的灵敏度和特异度均>91%。结论 基于CRISPR1上游序列可用来鉴定大肠埃希菌和志贺菌,且具有很好的效果。     

基于不同方法的大肠埃希菌分型效果评价

目的 评价并验证成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPRs）、血清学和多位点测序分型（MLST）方法对大肠埃希菌分型的效果。方法 使用CRISPRsFinder分析大肠埃希菌全基因组序列的CRISPRs间隔序列,使用在线软件SeroTypeFinder和MLST获得血清型和序列型（ST）;采用PCR扩增并分析349株大肠埃希菌CRISPRs,使用CRISPRs间隔序列预测血清型和ST,并比较血清学和MLST分型结果。结果 将I-E型CRISPR/Cas、I-F型CRISPR/Cas和CRISPR3-4分别命名CT-Ⅰ、CT-Ⅱ和CT-Ⅲ。根据CRISPRs间隔序列构成和排列进一步进行分型,203株大肠埃希菌被分为79个CT型别,76个血清型和66个ST。CRISPRs分型的区分能力最强,辛普森指数为0.936。CRISPRs和血清学的关联程度最高,调整兰德指数为0.908。CRISPRs型能进一步区分相同血清或ST产志贺毒素的大肠埃希菌［O157∶H7（ST11）、O104∶H4（ST678）和O26∶H11（ST21）］菌株。扩增实验室菌株的CRISPR1、CRISPR2、CRISPR3、CRISPR4和CRISPR3-4,检出率分别为81.1%、94.5%、1.4%、1.4%和4.6%;根据CRISPRs间隔序列预测O157∶H7（ST11）和ST131准确率分别为95.0%和100.0%。结论 基于CRISPRs的大肠埃希菌的分子分型方法呈现较好的分型效果和临床应用效果,预期可以成为大肠埃希菌分型的重要分子标志物。     

基于CRISPR/Cas的大肠埃希菌分子标志物的监测研究

目的 探讨基于CRISPR/Cas的大肠埃希菌分子标志物的监测研究。方法 通过BLAST收集GenBank数据库中135株全基因组测序大肠埃希菌、203株鸟枪法测序大肠埃希菌的CRISPR/Cas和PCR扩增、测序获得本实验室保存361株大肠埃希菌（包括38株大肠埃希菌O157：H7）的CRISPR序列,应用CRISPR Finder在线软件分析CRISPR特征、DNAMAN软件进行间隔序列的比对,使用Clustal Ⅹ进行cas多序列比对和Mega 5.1软件构建系统进化树。结果 本研究以全新的视角对大肠埃希菌的CRISPR/Cas位置进行描述;结果显示,135株全基因组测序、203株鸟枪法测序和361株本实验室测序的大肠埃希菌中分别有77.04%、100.00%和75.62%的大肠埃希菌具有CRISPR1,分别有74.81%、100.00%和92.24%的大肠埃希菌具有CRISPR2,分别有11.85%、0和1.39%的大肠埃希菌具有CRISPR3和CRISPR4;GenBank数据库下载的全基因组测序的1株和本实验室测序的2株大肠埃希菌存在4个CRISPR位点;缺少cas的CRISPR1下游有插入序列存在。在699株大肠埃希菌中,8株O55：H7、180株O157：H7、8株O157：HNM、40株O104：H4、4株O145：H28有独特的CRISPR;间隔序列的缺失可发生在CRISPR中间;依据I-E和I-F的cas构建系统发育树,均可分为两类。结论 大肠埃希菌的CRISPR/Cas可能作为鉴定强毒株大肠埃希菌或者新型菌株的分子标志物。间隔序列的缺失或获得可能与噬菌体有关。     

志贺菌成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白基因cas1 和cas2 研究

目的 研究成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）相关蛋白基因cas1和cas2在志贺菌中的分布,并分析cas1和cas2基因突变与细菌耐药的关系。方法 采用PCR扩增196株志贺菌cas1和cas2基因。对3株志贺菌（Z23、2003135、2008113）的cas2、cas1（a）和cas1（b）基因进行测序,分析其突变与耐药之间的关系。结果 196株志贺菌均检出CRISPR相关蛋白基因cas1和cas2。测序结果显示,cas2 的一致性为 96.44%,cas1（a）的一致性为 97.61%,cas1（b）的一致性为96.97%。菌株 2003135 的 cas1（b）基因有 2 个突变位点：3177129 位点（C→G）及 3177126 位点（G→C）,Z23、2008113 对应位置没有突变。药敏结果显示菌株 2003135 的耐抗生素种类和耐抗生素数目均大于菌株Z23、2008113。结论 志贺菌中CRISPR基因广泛存在。cas1（b）基因突变菌株与未突变株比较,耐药性增强。cas1（b）基因突变可能是引起耐药程度不同的原因之一。     

志贺菌中成簇规律间隔短回文重复序列的分子分布特征

目的 探索志贺菌中成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)的分布。方法 共选择志贺菌分离株52株, 其中河南41株, 江西6株, 北京5株。利用PCR扩增志贺菌的4个CRISPR位点(S1、S2、S3、S4), 产物送测序, 分析CRISPR的重复序列和间隔序列。结果 志贺菌的4个CRISPR位点阳性率分别为33. 69%(S1)、50.00%(S2)、82.69%(S3)和73.08%(S4);S1和S3包括2种亚型, S2有3种亚型, S4包括4种亚型。2004年前分离的河南分离株中检出S1位点, 2004年后分离的菌株中均未检出该位点;S2、S3和S4在两组的分布没有差异。结论 志贺菌各CRISPR位点含有不同亚型, 河南分离株S1的分布与细菌分离时间有关, 而S2、S3 及S4和分离时间无关。     

广东省和广西壮族自治区部分地区2014-2016年宋内志贺菌病原学特征分析

目的 了解2014-2016年广东省和广西壮族自治区部分地区宋内志贺菌暴发分离株及散发分离株的病原学特征。方法 对2014-2016年广东省和广西壮族自治区柳州市分离的14株宋内志贺菌暴发菌株和6株散发菌株进行抗生素敏感性试验和PFGE分析,并选择其中6株代表菌株进行全基因组测序,与NCBI上获取的51株国内外宋内志贺菌的基因组进行遗传进化分析。结果 抗生素敏感性检测结果显示,试验菌株对氨苄西林、四环素、庆大霉素、复方新诺明和萘啶酸有较高的耐药性,对阿奇霉素、氯霉素和亚胺培南完全敏感。PFGE分子分型显示,不同地区不同来源的分离株之间PFGE指纹图谱有很高的相似度（93.2%）,基于全基因组的遗传进化分析显示,广东省和广西壮族自治区柳州市的宋内志贺菌分离株同处在一个进化分支上,与来自韩国的菌株亲缘关系最为接近。结论 广东省和广西壮族自治区部分地区分离的宋内志贺菌对常用抗生素具有较高的耐药性,对阿奇霉素、氯霉素和亚胺培南有较高的敏感性。试验菌株之间具有相似的PFGE指纹图谱,遗传进化关系相近。     

O26:H11及NM大肠埃希菌CRISPR的分子分布特征及其与stx噬菌体的关系

目的 探讨O26：H11及NM血清型大肠埃希菌中成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）的分子分布特征及其与stx噬菌体的关系。方法 135株O26：H11及NM血清型大肠埃希菌从NCBI数据库获取,利用CRT软件及CRISPR Finder提取CRISPR信息,并用Excel软件对间隔序列进行编号及分析CRISPR亚型,并分析CRISPR与stx噬菌体之间的关系。结果 135株O26：H11及NM血清型大肠埃希菌中均存在CRISPR结构,CRISPR1包括19个亚型,CRISPR 2.1包括22个亚型,CRISPR2.2包括1个亚型,CRISPR3-4包括1个亚型。stx噬菌体在CRISPR群组C中出现,stx⁺ 菌株比stx^-菌株拥有更多的间隔序列。结论 CRISPR位点在O26：H11或NM血清型大肠埃希菌中广泛存在,且存在着不同的亚型,stx噬菌体与CRISPR的分子分布特征有关,可能作为鉴定高毒菌株的分子靶标。     

一起由宋内志贺菌引起的寄宿学校细菌性痢疾暴发病原学和流行病学分析

目的 对安徽省阜阳市某寄宿学校感染性腹泻暴发开展流行病学调查与病原学分析,为有效控制和处置疫情提供科学依据。方法 根据病例流行病学特征对2017年9月13-15日发病病例溯源假设进行检验,采集患者和厨师粪便、肛拭子、水样和食堂食品等进行致病菌分离与检测,对可疑致病菌进行生化鉴定、毒力基因检测、药敏试验、PFGE和多位点序列分型。结果 浅水井供水范围内宿舍楼的罹患率（3.41%）高于深水井（0.98%）,差异有统计学意义（χ²=17.215,P<0.001）。从患者样品中分离到16株宋内志贺菌,均携带ipaH基因且不携带set1基因,其中7株携带sen基因和ial基因。16株宋内志贺菌对氨苄西林、四环素、复方新诺明、头孢唑啉、头孢噻肟、庆大霉素、萘啶酸、链霉素高度耐药,9株宋内志贺菌对多西环素耐药。16株宋内志贺菌的PFGE带型相似度为100.0%,ST型均为ST152。结论 本次细菌性痢疾暴发的病原为宋内志贺菌,浅水井水可能为感染来源。     

肺炎克雷伯菌中CRISPR调控耐药机制及其分布特征与分离地点的关系

  目的  了解呼吸道标本肺炎克雷伯菌中成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）对耐药的调控机制,并分析其CRISPR分布特征与分离地点的关系。  方法  收集并提取120株肺炎克雷伯菌的基因组DNA,通过扩增CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated）系统相关基因CRISPR 1、CRISPR 2来确定CRISPR阳性菌株。CRISPR阳性菌株的耐药表型用BD Phoenix-100细菌鉴定仪进行检测,利用CRISPR Target寻找间隔序列同源噬菌体或质粒,并在Center for Genomic Epidemiology上查找同源质粒或噬菌体的耐药信息并检测间隔序列所在菌株的耐药基因,分析两者携带耐药基因的关系。采用CRISPR Finder分析CRISPR并运用多序列比对分析间隔序列的一致性。  结果  CRISPR1、CRISPR2阳性率分别为12.50%和13.33%;间隔序列同源质粒与其所在菌株均携带共同的耐药基因,且菌株的耐药表型与其携带的耐药基因高度符合;相同地点菌株的CRISPR分布具有极高相似性。  结论  肺炎克雷伯菌通过将外来质粒的耐药基因片段整合到菌株的基因组中实现对菌株耐药性的调控;CRISPR中间隔序列的分布与菌株分离地点密切相关,为临床治疗和感染控制工作提供理论依据。     

广西壮族自治区1994-2013年伤寒流行病学特征及菌株耐药分析

目的 分析1994-2013年广西地区伤寒流行特征、菌株耐药特征及其变迁。方法 采用描述流行病学方法分析1994-2013年广西地区伤寒疫情报告资料,对分离自伤寒病例475株沙门菌,利用纸片扩散法及肉汤微量稀释法检测抗菌药物最小抑菌圈和抑菌浓度（MIC）,依据CLSI 2012版敏感判定标准,判定菌株的耐药情况。结果 20年间广西地区共报告伤寒病例57 928例,年均发病率为6.29/10万,病死率为0.03%。<20岁人群发病较高,发病无性别差异,病例以农民和学生为主,主要分布在广西北部地区,全年均有发病,发病高峰在5-10月。2001-2013年发生13起大的暴发疫情,传播方式以水型为主。475株菌对第三代头孢类抗生素头孢噻肟和氟喹诺酮类诺氟沙星的敏感率为100%,对四环素、氯霉素、氨苄西林、庆大霉素的敏感率约为98%,对环丙沙星的敏感率为89.89%;对链霉素、复方新诺明的敏感性较低,为67.73%和65.89%。发现1株环丙沙星耐药、47株环丙沙星敏感性降低的菌株。暴发株与散发株耐药情况无差别。有28株菌耐≥3种抗生素,首次发现1株同时对氨苄西林、氯霉素、链霉素、复方新诺明、四环素、萘啶酸（ACSSxT-NAL）耐药的多重耐药菌株。多耐药株多见于伤寒小范围暴发疫情。结论 广西地区伤寒发病水平仍较高,且菌株出现对临床常用的氟喹诺酮类药物敏感性降低及多重耐药现象,应加强疫情及耐药监测。     

In vitro activity of eight antibiotics againstSalmonella andShigella species

The minimum inhibitory concentrations (MICs) of ampicillin, chloramphenicol, trimetoprimsulfamethoxazole (TMP-SMX), ofloxacin, ciprofloxacin, pefloxacin, enoxacin and fleroxacin forSalmonella spp. (n=72) andShigella spp. (n=52) were established.S. typhi isolates were all susceptible to all of the antibiotics tested. In non-typhi salmonellae andShigella spp., resistance to ampicillin, chloramphenicol and TMP-SMX with various rates were encountered, but all isolates were susceptible to fluoroquinolones.     

新生儿重症监护室患儿肠道内定植的大肠埃希菌和肠球菌耐药分析

目的 了解新生儿重症监护室（NICU）患儿肠道菌定植和耐药情况,为临床用药及合理治疗提供依据。方法 2014年5月至2015年5月对北京妇幼保健院NICU新生儿采集的572份粪便样本进行肠道菌分离培养,采用VITEK-2系统进行菌株鉴定和抗生素敏感性检测,并对耐药情况进行统计分析。结果 分离得到328株大肠埃希菌和243株肠球菌。选取的199株大肠埃希菌对亚胺培南、厄他培南、阿米卡星、呋喃妥因较敏感（耐药率为0.50%~3.52%）;对氨苄西林、四环素、复方甲基异恶唑、头孢唑啉耐药率较高（耐药率为54.27%~84.92%）,未发现对美罗培南耐药菌株;产ESBL的菌株占45%;多重耐药情况统计结果显示对4类抗生素耐药性的菌株数量最多（34.6%）;有3株大肠埃希菌对7类抗生素表现耐药性。肠球菌对链阳霉素、呋喃妥因、链霉素较敏感（耐药率为0.41%~4.53%）;对氨苄西林、青霉素、环丙沙星、四环素、庆大霉素、红霉素耐药率较高（耐药率为70.78%~91.77%）,未发现对替加环素、万古霉素、利奈唑胺耐药的肠球菌;多重耐药情况统计结果显示,对5类抗生素表现耐药性的菌株数量最多（86.5%）。结论 NICU新生儿肠道定植的大肠埃希菌和肠球菌对抗生素耐药情况较严重,呈现多重耐药性,临床用药应结合药敏实验结果,合理选择抗菌药物。     

Surveillance of antibiotic resistance in South East Asia

Antibiotic resistance in Gram-negative bacteria, particularly Salmonella and Shigella, requires surveillance worldwide. This study describes results of surveys in Hong Kong, Bangkok and Kuala Lumpur. All strains were isolated in hospitals which have large community catchment areas in addition to specialised hospital units. The prevalence of resistant strains was high in all areas. Gram-negative bacteria such as Enterobacter associated with hospital infections were resistant to penicillins and cephalosporins, with gentamicin resistance ranging from about 20% in Kuala Lumpur and Hong Kong, to 35% in Bangkok. Ninety-seven percent of Shigella isolated in Thailand were resistant to ampicillin. About 10% of Salmonella were resistant to chloramphenicol in all three centres.     

2005-2019年中国538株脑膜炎奈瑟菌抗生素耐药性分析

目的:分析2005-2019年中国538株脑膜炎奈瑟菌抗生素耐药性特征。方法:收集中国2005-2019年30个省份538株脑膜炎奈瑟菌,参考临床和实验室标准化协会(CLSI)抗微生物药物敏感性试验执行标准,选用11种推荐抗生素,采用梯度扩散法检测脑膜炎奈瑟菌的抗生素敏感性。结果:538株脑膜炎奈瑟菌对阿奇霉素、美洛培南、氯霉素、利福平、头孢曲松等5种抗生素均敏感,无耐药菌株出现。对其他6种抗生素敏感性分别为:头孢噻肟(97.4%,524株)、氨苄西林(87.7%,472株)、青霉素(84.8%,456株)、米诺环素(95.2%,512株)、环丙沙星(24.9%,134株)、甲氧苄啶/磺胺甲基异噁唑(11.2%,60株)。结论:中国2005-2019年538株脑膜炎奈瑟菌对阿奇霉素、美洛培南、氯霉素、利福平、头孢曲松等5种抗生素均敏感,应关注对头孢噻肟、氨苄西林和青霉素等不敏感和耐药的菌株,不再推荐环丙沙星和磺胺甲基异噁唑作为临床救治和预防性服药首选药物。     

脑膜炎奈瑟菌病原学及药物敏感性分析 FREE

目的了解某省各市、县疾病预防控制中心2007-2008年分离的8株脑膜炎奈瑟菌的病原学特征及药物敏感性。方法经培养及生化鉴定后,对菌株进行血清学及聚合酶链反应（PCR）鉴定分群,最后采用最低抑菌浓度（MIC）琼脂稀释法进行药敏试验。结果8株脑膜炎奈瑟菌中有5株C群、1株B群、1株Y群及1株不可分群菌株。所有菌株对青霉素、氨苄西林、米诺环素、头孢曲松、头孢噻肟、美罗培南、利福平敏感,对复方磺胺甲口恶唑则全部耐药,对环丙沙星和左氧氟沙星各有4株耐药,对氯霉素和阿奇霉素各有1株耐药。结论8株脑膜炎奈瑟菌的流行株中以C群为主;青霉素、头孢曲松、头孢噻肟、美罗培南等可作为治疗流行性脑脊髓膜炎的一线药物,脑膜炎奈瑟菌对喹诺酮类及大环内酯类抗生素的耐药现象需引起重视。     

Resistance to antibiotics of Shigella strains isolated in Somalia

The resistance to antibiotics of 240 Shigella strains isolated in Somalia from 1973 to 1976 was studied. Many strains, particularly those of Shigella dysenteriae type 1, were found to be resistant to more than one drug. In view of their resistance to ampicillin, chloramphenicol, streptomycin, tetracycline, and sulfonamides, it is suggested that polymyxin B or M sulfate — which have proved to be effective in vivo — should be used for the treatment of clinically typical cases of bacillary dysentery.     

某院流感嗜血杆菌耐药性及其对氨苄西林耐药机制

目的了解流感嗜血杆菌对常用抗菌药物的耐药性及其对氨苄西林的耐药机制。方法采用纸片扩散法和头孢硝噻吩纸片法,对2012年1月1日—12月31日某院住院及门诊患者送检标本分离的流感嗜血杆菌耐药性和β-内酰胺酶进行检测,聚合酶链反应(PCR)法对耐氨苄西林菌株进行TEM型和ROB型β-内酰胺酶基因扩增。结果 100例流感嗜血杆菌感染患者,年龄段分布主要为1~10岁,占61.00%。流感嗜血杆菌对氨苄西林耐药率为35.00%(35株),对复方磺胺甲口恶唑耐药率高,达64.65%;对左氧氟沙星和阿奇霉素敏感率最高,分别为97.96%、96.84%,对环丙沙星、头孢噻肟、氯霉素、头孢呋辛和氨苄西林/舒巴坦敏感率均较高,依次为96.91%、92.78%、85.71%、77.89%和74.75%。100株流感嗜血杆菌中,21株β-内酰胺酶阳性,且均为氨苄西林耐药株。对35株耐氨苄西林菌株进行TEM和ROB基因检测,结果 22株TEM型阳性,未检出ROB阳性株。结论流感嗜血杆菌对复方磺胺甲口恶唑敏感率低,对其他常用抗菌药物敏感率高;流感嗜血杆菌对氨苄西林的主要耐药机制为产TEM型β-内酰胺酶。