4株志贺菌无抗生素压力下连续传代90次的耐药表型及CRISPR/Cas系统变化

目的 分析无抗生素压力下连续传代90次的4株志贺菌耐药表型及成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）基因变化。方法 对临床分离的4株耐药谱不同的志贺菌进行无抗生素压力连续传代90次,传代结束后用琼脂稀释法检测传代前、后志贺菌最小抑菌浓度;用PCR对CRISPR位点进行扩增并测序,CRISPR Finder和Clustal X 2.1分析CRISPR位点的变化。结果 经无抗生素压力传代90次后,4株志贺菌对某些抗生素的敏感性有不同程度的增加：mel-sf1998024/zz对氨苄西林、头孢氨苄、头孢噻肟、氯霉素的耐药性降低,mel-s2014026/sx对诺氟沙星、甲氧苄啶的耐药性降低,mel-sf2004004/sx对氨苄西林、头孢呋辛、头孢噻肟、氯霉素、甲氧苄啶的耐药性降低,mel-sf2013004/bj对氯霉素的耐药性降低;志贺菌mel-sf1998024/zz和mel-sf2013004/bj经无抗生素压力传代后,CRISPR3位点3''的重复-间隔序列丢失,其中间隔序列匹配基因的编码产物是Cas蛋白。结论 志贺菌在无抗生素压力下,可降低或丢失对某些抗生素的耐药性。部分志贺菌CRISPR3位点的结构发生了变化,CRISPR3位点与cas基因可能存在共进化。     

O26:H11及NM大肠埃希菌CRISPR的分子分布特征及其与stx噬菌体的关系

目的 探讨O26：H11及NM血清型大肠埃希菌中成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）的分子分布特征及其与stx噬菌体的关系。方法 135株O26：H11及NM血清型大肠埃希菌从NCBI数据库获取,利用CRT软件及CRISPR Finder提取CRISPR信息,并用Excel软件对间隔序列进行编号及分析CRISPR亚型,并分析CRISPR与stx噬菌体之间的关系。结果 135株O26：H11及NM血清型大肠埃希菌中均存在CRISPR结构,CRISPR1包括19个亚型,CRISPR 2.1包括22个亚型,CRISPR2.2包括1个亚型,CRISPR3-4包括1个亚型。stx噬菌体在CRISPR群组C中出现,stx⁺ 菌株比stx^-菌株拥有更多的间隔序列。结论 CRISPR位点在O26：H11或NM血清型大肠埃希菌中广泛存在,且存在着不同的亚型,stx噬菌体与CRISPR的分子分布特征有关,可能作为鉴定高毒菌株的分子靶标。     

志贺菌成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白基因cas1 和cas2 研究

目的 研究成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）相关蛋白基因cas1和cas2在志贺菌中的分布,并分析cas1和cas2基因突变与细菌耐药的关系。方法 采用PCR扩增196株志贺菌cas1和cas2基因。对3株志贺菌（Z23、2003135、2008113）的cas2、cas1（a）和cas1（b）基因进行测序,分析其突变与耐药之间的关系。结果 196株志贺菌均检出CRISPR相关蛋白基因cas1和cas2。测序结果显示,cas2 的一致性为 96.44%,cas1（a）的一致性为 97.61%,cas1（b）的一致性为96.97%。菌株 2003135 的 cas1（b）基因有 2 个突变位点：3177129 位点（C→G）及 3177126 位点（G→C）,Z23、2008113 对应位置没有突变。药敏结果显示菌株 2003135 的耐抗生素种类和耐抗生素数目均大于菌株Z23、2008113。结论 志贺菌中CRISPR基因广泛存在。cas1（b）基因突变菌株与未突变株比较,耐药性增强。cas1（b）基因突变可能是引起耐药程度不同的原因之一。     

CRISPR1上游侧翼序列用于大肠埃希菌和志贺菌鉴定的效果评价

目的 探讨基于成簇规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）1上游侧翼序列对大肠埃希菌和志贺菌鉴定和评价效果。方法 通过BLAST重复序列识别并获得全基因组测序大肠埃希菌和志贺菌的CRISPRs和CRISPR相关基因（CRISPR-associated,cas）,并分析其种系;选取CRISPRs上、下游各500 bp侧翼序列,使用Clustal X进行序列比对;采用PCR方法扩增CRISPR1上游侧翼序列,以确定其对大肠埃希菌和志贺菌鉴定和评价效果。结果 73.4%（149/203）的大肠埃希菌存在I-E型CRISPR/Cas系统,包含了A、B1、D种系;8.4%（17/203）的大肠埃希菌存在I-F型CRISPR/Cas、17.2%（35/203）的大肠埃希菌不存在CRISPR/Cas,这2种大肠埃希菌均属于B2种系;9株志贺菌均存在I-E型CRISPR/Cas。在大肠埃希菌（B2种系外）、志贺菌CRISPR1上游和大肠埃希菌（B2种系）各存在61 bp侧翼序列,序列一致性为99%,且有种属特异性,PCR扩增此区域鉴定大肠埃希菌和志贺菌的灵敏度和特异度均>91%。结论 基于CRISPR1上游序列可用来鉴定大肠埃希菌和志贺菌,且具有很好的效果。     

基于不同方法的大肠埃希菌分型效果评价

目的 评价并验证成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPRs）、血清学和多位点测序分型（MLST）方法对大肠埃希菌分型的效果。方法 使用CRISPRsFinder分析大肠埃希菌全基因组序列的CRISPRs间隔序列,使用在线软件SeroTypeFinder和MLST获得血清型和序列型（ST）;采用PCR扩增并分析349株大肠埃希菌CRISPRs,使用CRISPRs间隔序列预测血清型和ST,并比较血清学和MLST分型结果。结果 将I-E型CRISPR/Cas、I-F型CRISPR/Cas和CRISPR3-4分别命名CT-Ⅰ、CT-Ⅱ和CT-Ⅲ。根据CRISPRs间隔序列构成和排列进一步进行分型,203株大肠埃希菌被分为79个CT型别,76个血清型和66个ST。CRISPRs分型的区分能力最强,辛普森指数为0.936。CRISPRs和血清学的关联程度最高,调整兰德指数为0.908。CRISPRs型能进一步区分相同血清或ST产志贺毒素的大肠埃希菌［O157∶H7（ST11）、O104∶H4（ST678）和O26∶H11（ST21）］菌株。扩增实验室菌株的CRISPR1、CRISPR2、CRISPR3、CRISPR4和CRISPR3-4,检出率分别为81.1%、94.5%、1.4%、1.4%和4.6%;根据CRISPRs间隔序列预测O157∶H7（ST11）和ST131准确率分别为95.0%和100.0%。结论 基于CRISPRs的大肠埃希菌的分子分型方法呈现较好的分型效果和临床应用效果,预期可以成为大肠埃希菌分型的重要分子标志物。     

基于CRISPR/Cas的大肠埃希菌分子标志物的监测研究

目的 探讨基于CRISPR/Cas的大肠埃希菌分子标志物的监测研究。方法 通过BLAST收集GenBank数据库中135株全基因组测序大肠埃希菌、203株鸟枪法测序大肠埃希菌的CRISPR/Cas和PCR扩增、测序获得本实验室保存361株大肠埃希菌（包括38株大肠埃希菌O157：H7）的CRISPR序列,应用CRISPR Finder在线软件分析CRISPR特征、DNAMAN软件进行间隔序列的比对,使用Clustal Ⅹ进行cas多序列比对和Mega 5.1软件构建系统进化树。结果 本研究以全新的视角对大肠埃希菌的CRISPR/Cas位置进行描述;结果显示,135株全基因组测序、203株鸟枪法测序和361株本实验室测序的大肠埃希菌中分别有77.04%、100.00%和75.62%的大肠埃希菌具有CRISPR1,分别有74.81%、100.00%和92.24%的大肠埃希菌具有CRISPR2,分别有11.85%、0和1.39%的大肠埃希菌具有CRISPR3和CRISPR4;GenBank数据库下载的全基因组测序的1株和本实验室测序的2株大肠埃希菌存在4个CRISPR位点;缺少cas的CRISPR1下游有插入序列存在。在699株大肠埃希菌中,8株O55：H7、180株O157：H7、8株O157：HNM、40株O104：H4、4株O145：H28有独特的CRISPR;间隔序列的缺失可发生在CRISPR中间;依据I-E和I-F的cas构建系统发育树,均可分为两类。结论 大肠埃希菌的CRISPR/Cas可能作为鉴定强毒株大肠埃希菌或者新型菌株的分子标志物。间隔序列的缺失或获得可能与噬菌体有关。     

甘肃省鼠疫耶尔森菌规律成簇间隔短回文重复序列位点多态性分析及地区分布

目的 研究甘肃省鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）的规律成簇的间隔短回文重复序列（CRISPR）位点多态性及地区分布。方法 选取1962－2014年分离的203株鼠疫菌,培养并提取DNA。采用3对CRISPR引物对菌株DNA进行PCR扩增,对PCR产物进行测序。根据菌株CRISPR位点的间区序列种类和排列情况,确定菌株的基因型（类群）,采用BioNumerics 5.10软件进行聚类分析。结果 203株鼠疫菌发现有16种间区序列,包括YPa位点9种、YPb位点4种、YPc位点3种,发现新的间区序列a1''。共发现5个CRISPR基因簇,分别为Cb2、Ca7、Ca7''、CaΔ5''、Ca35''。不同的基因簇呈现区域性特征：Cb2主要分布在会宁县、平川区,Ca7主要分布阿克塞哈萨克族自治县;Ca7''主要分布在夏河县;Ca35''主要分布肃北蒙古族自治县、玉门市;CaΔ5''主要集中在肃南裕固族自治县。结论 CRISPR分子分型方法能够较好地区分甘肃省不同疫源地的菌株,且各基因簇呈现一定的区域性特征。对研究甘肃省鼠疫菌进化规律和人间疫情分子生物学溯源有一定意义。     

福氏志贺菌血清型单重PCR鉴定方法的建立及应用

目的 建立基于O抗修饰基因的福氏志贺菌血清型PCR鉴定方法.方法 根据福氏志贺菌O抗原合成及修饰特异基因设计引物,以常见的14种福氏志贺菌血清型(包括1a、1b、1c、2a、2b、3a、3b、4a、4b、5a、Y、X、Xv和F6)为标准菌株,建立福氏志贺菌血清型单重PCR鉴定方法;并以痢疾志贺菌、宋内志贺菌、鲍氏志贺菌和腹泻相关的其他菌属菌株验证特异性;应用该方法对106株福氏志贺菌临床分离株进行PCR血清分型.结果 建立一种福氏志贺菌血清型单重PCR鉴定方法,通过8个PCR反应,能够鉴定目前已知的15种血清型中的14种(Xv除外).检测灵敏度在10 pg至1 ng DNA(20μl反应体系).对106株福氏志贺菌临床分离株的检测结果提示,PCR分型方法与玻片凝集法具有很高的一致性.结论 本研究建立的福氏志贺菌血清型单重PCR鉴定方法具有特异性、灵敏性,可用于临床检测.     

广东省2013-2014年食源性疾病主动监测的病原学特征分析

目的 了解广东省腹泻病例中沙门菌、志贺菌、副溶血弧菌和4种致泻性大肠埃希菌［肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）、肠致病性大肠埃希菌（EPEC）、产志贺毒素大肠埃希菌（STEC）、肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC）］的感染情况及其血清型别、耐药变化和分子特征。方法 对2013-2014年广东省食源性疾病主动监测检出的沙门菌、志贺菌、副溶血弧菌和4种致泻性大肠埃希菌菌株进行血清分型、药物敏感试验和PFGE分型。结果 2013-2014年检测粪便标本57 834份,分离到3 372株致病菌,检出率为5.83%;沙门菌的检出阳性率最高,其次是副溶血弧菌、致泻性大肠埃希菌、志贺菌。3 213株沙门菌分为143种血清型,最常见的血清型为鼠伤寒、4,5,12：i：-、肠炎、斯坦利和德尔卑沙门菌。沙门菌对头孢类和氟喹诺酮类药物均较敏感;不同血清型沙门菌对抗生素的耐药率有明显差异,10种最常见血清型中,肠炎沙门菌对头孢类药物的耐药率最高,德尔卑沙门菌对环丙沙星的耐药率最高。2 289株各血清型沙门菌的PFGE型别分布多样,表现出较大的指纹图谱多态性。85株副溶血弧菌分为10种血清型,最主要的血清型为O3：K6（61.18%）,其次是O4：K8（10.59%）;tdh携带率高（81.18%）,trh携带率较低（7.06%）,有10株菌（11.76%）不携带该两种毒力基因;副溶血弧菌对亚胺培南、萘啶酸、复方新诺明、氯霉素、四环素的敏感率均>95%。13株志贺菌分别为宋内志贺菌9株、福氏志贺菌3株、鲍氏志贺菌1株;对头孢他啶、环丙沙星、氯霉素较敏感（76.92%）。检出的86株致泻性大肠埃希菌中ETEC 29株（33.72%）,EPEC 27株（31.39%）,STEC 27株（31.39%）,EIEC 3株（3.48%）。结论 2013-2014年广东省食源性疾病主动监测中沙门菌检出率最高（5.57%）,其次是副溶血弧菌、致泻性大肠埃希菌、志贺菌;沙门菌、副溶血弧菌和志贺菌对头孢类和氟喹诺酮类药物敏感;沙门菌感染中仅发现聚集性病例,但未监测到暴发。     

河北省鼠疫菌CRISPR基因分型及流行病学分析

目的对河北省鼠疫菌株进行规律聚集间隔短回文重复序列CRISPR)基因分型。方法利用聚合酶链式反应(PCR),采用3对CRISPR引物,对河北省分离的128株鼠疫菌进行扩增,测定扩增产物核酸序列并进行分析,确定河北省菌株CRISPR基因型。结果 128株鼠疫菌在3个CRISPR位点上有8种间隔序列,包括al、a2、a3、b1、b2、c1、c2、c3,分为2个基因型。118株鼠疫菌株为Cb2型,另外10株鼠疫菌均为新基因型(命名为Cc△1型)。结论通过CRISPR分析显示河北省鼠疫菌株遗传进化比较稳定,建立了CRISPR基因库,为鼠疫菌种群遗传进化和鼠疫防控的研究提供参考。     

1978~1991年北京丰台区痢疾菌菌型分布与变迁的调查分析

北京丰台区1978~1991年共检出志贺氏菌386株,均经生化、血清学鉴定,对其中108株作了药敏试验。菌型分布于4个群、20个血清型(亚型),其中福氏志贺氏菌始终占优势(72.80%),以F₂a、F₃a为主,宋内氏志贺氏菌为第二位(17.10%),B:D比值为4.3。此外,对菌型变迁的因素进行了初步探讨,为志贺氏菌病的防治提供了参考依据。     

贵州省不明原因发热病例钩端螺旋体病原体分离鉴定研究

目的 对贵州省钩端螺旋体（钩体）病疫区不明原因发热病例进行钩体分离鉴定和分子分型，了解其病原学特征，为当地钩体病的防治提供病原学依据。方法 采集贵州省钩体病疫区黔东南州黎平县不明原因发热病例血液和尿液标本进行钩体分离培养，对分离的钩体疑似菌株通过致病性钩体G1/G2-PCR方法进行初步鉴定，进一步采用钩体血清群特异PCR进行分群鉴定，然后采用多位点序列分型（MLST）技术对其进行分子分型，并与国内常见血清群参考菌株进行聚类分析。结果 从35例发热病例血液中分离得到3株钩体疑似菌株，分离率为8.6%，分别命名为17BX002、17BX003和17AJX008；3株菌株经钩体特异性G1/G2-PCR鉴定为致病性钩体；钩体血清群PCR鉴定显示，17BX002株为流感伤寒群钩体，其余2株菌为阴性（排除其为黄疸出血群、赛罗群、犬型、秋季群、流感伤寒群和七日热群）；进一步的MLST显示，17BX002株为ST106型，与流感伤寒群聚类最近，而其余2株为ST96型，与巴达维亚群菌株一致。结论 高发季节贵州省疫区不明原因发热病例中存在钩体感染病例，流感伤寒群和巴达维亚群为贵州省新发现钩体菌群。     

昆明市静脉注射吸毒人群丙型肝炎病毒基因型分析

目的 研究云南省昆明市静脉注射吸毒人群(IDUs)中丙型肝炎病毒(HCV)基因型的流行特点。方法 2014年4－7月在昆明市连续收集276份IDUs的血浆,其中199份样品为HCV抗体阳性,提取RNA后用巢式PCR对E1E2基因和NS5B基因的部分片段进行扩增。扩增产物经基因序列测定,所得序列通过构建系统进化树确定HCV的分子亚型。结果 结合2 个基因片段,共有125份样品获得了分型结果,3b为主要的亚型,占48.8%(61/125);其他亚型按照比例依次为3a(30.4%,38/125)、6n(14.4%,18/125)、6a(3.2%,4/125)和1b(3.2%,4/125)。各HCV亚型按性别、婚姻、民族和HIV-1抗体是否阳性差异无统计学意义,按年龄分布差异有统计学意义,45岁以下组亚型多样化。分别计算不同亚型在E1E2和NS5B基因区的基因距离,结果显示3a、3b和6a亚型的基因距离大于1b和6n亚型的基因距离。3a、3b、6a 3种亚型中3b亚型毒株的基因距离大于3a亚型毒株。结论 昆明市IDUs人群中HCV存在5种亚型,3b和3a是主要毒株且在该人群中具有较长的流行时间。     

广东省和广西壮族自治区部分地区2014-2016年宋内志贺菌病原学特征分析

目的 了解2014-2016年广东省和广西壮族自治区部分地区宋内志贺菌暴发分离株及散发分离株的病原学特征。方法 对2014-2016年广东省和广西壮族自治区柳州市分离的14株宋内志贺菌暴发菌株和6株散发菌株进行抗生素敏感性试验和PFGE分析,并选择其中6株代表菌株进行全基因组测序,与NCBI上获取的51株国内外宋内志贺菌的基因组进行遗传进化分析。结果 抗生素敏感性检测结果显示,试验菌株对氨苄西林、四环素、庆大霉素、复方新诺明和萘啶酸有较高的耐药性,对阿奇霉素、氯霉素和亚胺培南完全敏感。PFGE分子分型显示,不同地区不同来源的分离株之间PFGE指纹图谱有很高的相似度（93.2%）,基于全基因组的遗传进化分析显示,广东省和广西壮族自治区柳州市的宋内志贺菌分离株同处在一个进化分支上,与来自韩国的菌株亲缘关系最为接近。结论 广东省和广西壮族自治区部分地区分离的宋内志贺菌对常用抗生素具有较高的耐药性,对阿奇霉素、氯霉素和亚胺培南有较高的敏感性。试验菌株之间具有相似的PFGE指纹图谱,遗传进化关系相近。     

In vitro activity of eight antibiotics againstSalmonella andShigella species

The minimum inhibitory concentrations (MICs) of ampicillin, chloramphenicol, trimetoprimsulfamethoxazole (TMP-SMX), ofloxacin, ciprofloxacin, pefloxacin, enoxacin and fleroxacin forSalmonella spp. (n=72) andShigella spp. (n=52) were established.S. typhi isolates were all susceptible to all of the antibiotics tested. In non-typhi salmonellae andShigella spp., resistance to ampicillin, chloramphenicol and TMP-SMX with various rates were encountered, but all isolates were susceptible to fluoroquinolones.     

全国细菌耐药监测网2014-2019年耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌流行病学变迁

 目的 了解中国耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）的耐药变迁。方法 分析2014-2019年全国细菌耐药监测报告中CRKP相关数据,比较不同地区、不同等级医院、不同标本来源、不同年龄组及不同科室CRKP的耐药变迁。结果 全国CRKP检出率从2014年的6.4%上升至2019年10.9%。2019年河南省及上海市CRKP检出率最高,分别为32.8%和28.7%,西藏检出率最低（为0.6%）;2019年全国儿童医院、三级医院及二级医院CRKP检出率分别为14.0%、11.6%及5.5%;2019年全国重症医学科患者CRKP检出率最高（23.0%）,高于住院、急诊及门诊患者。结论 中国CRKP检出率呈现上升趋势,不同地区及不同科室间存在差异。