应用2D-DIGE及MALDI-TOF-MS筛选胰腺癌血清标志物

目的 利用比较蛋白质组学的方法对胰腺癌患者血清和对照组血清例进行分析,寻找胰腺癌潜在的特异性候选标志物.方法 采用双向差异凝胶电泳分离40例胰腺癌患者、10例慢性胰腺炎患者、10例良性肿瘤患者和40例健康体检者外周血清蛋白质,利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术对差异显著的蛋白进行鉴定.结果 成功鉴定出2个胰腺癌差异表达蛋白:转甲状腺素蛋白和载脂蛋白E.该组蛋白在胰腺癌组中呈高表达,在正常对照组、慢性胰腺炎组和良性肿瘤组中呈低表达.结论 双向差异凝胶电泳联合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术筛选胰腺癌患者外周血清中的特异性生物标志物的方法具有较好的重复性和稳定性.检测鉴定的差异蛋白质载脂蛋白E、转甲状腺素蛋白可能是胰腺癌早期诊断潜在的血清特异性生物标志物.     

蛋白质组技术在胃癌相关标志物筛查中的应用

目的 建立胃癌组织和正常胃组织双向凝胶电泳图谱，鉴定差异表达蛋白，从中发现有意义的胃癌相关标志物。方法 采用双向凝胶电泳（2-DE）分离胃癌组织和正常胃组织总蛋白，银染显色，PDQuest软件分析，从中选取差异表达蛋白质点，通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）或MALDI-TOF-TOF-MS鉴定差异表达的蛋白质。结果 获得重复性和分辨率较好的胃组织双向凝胶电泳图谱；发现23个差异表达蛋白质，其中15个得到鉴定，在肿瘤组织中高表达的有10个，其余5个在肿瘤组织中低表达。结论 建立了胃癌组织和正常胃组织双向凝胶电泳图谱，并应用质谱技术鉴定了15个差异表达蛋白质。     

前列腺癌骨转移血清蛋白质组学研究

目的:应用蛋白质组学双向凝胶电泳和质谱技术筛选前列腺癌骨转移血清标志物。方法:收集前列腺癌伴骨转移、不伴骨转移各5例血清样本。血清样品用除白蛋白试剂盒除去血清中的白蛋白后进行双向凝胶电泳,ImageMaster 2D Platinum软件分析,有意义的差异蛋白质点行基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定。结果:双向凝胶电泳显示,前列腺癌骨转移组血清蛋白中有15个斑点与前列腺癌无骨转移组有显著差异,前列腺癌骨转移患者血清中10个蛋白质表达水平显著增加,5个蛋白质表达水平显著下降。5个差异蛋白点进行胶内原位酶解,肽质量指纹图谱分析成功得到了3个蛋白质肽质量指纹图谱,并查询数据库初步鉴定了该3个蛋白质分别为锌α2糖蛋白、结合珠蛋白和载脂蛋白CⅢ。结论:双向凝胶电泳结合质谱鉴定是血清差异蛋白质组学研究的可靠平台和有力工具。所鉴定出的蛋白质与前列腺癌骨转移的发生、发展有关,可能是前列腺癌骨转移潜在的血清标志物。     

前列腺癌与良性前列腺增生细胞株差异核基质蛋白的鉴定

目的:鉴定人前列腺癌雄激素依赖性细胞株LNCaP、前列腺癌雄激素非依赖性细胞株PC-3与良性前列腺增生细胞株BPH-1之间差异表达的核基质蛋白(nuclear matrix proteins,NMPs)。方法:常规制备各细胞株NMPs,应用双向凝胶电泳对其进行分离;对差异表达的蛋白质点行MALDI-TOF-MS/MS质谱分析,数据库搜索并鉴定。结果:成功获得了分辨率高、重复性好的不同细胞株NMPs双向凝胶电泳图谱;初步鉴定出包含酶、调节蛋白、RNA结合蛋白及各种因子在内的12个差异表达的蛋白质,在癌细胞株中3个NMPs表达上调,9个下调。结论:人前列腺癌细胞与良性前列腺增生细胞之间NMPs表达存在明显差异;初步筛选出12个差异NMPs,其表达水平及功能与疾病的联系需进一步研究。     

胆管癌患者血清肿瘤标志物的筛查和鉴定

目的 通过双向凝胶电泳-质谱技术寻找胆管癌患者血清肿瘤标志物.方法 收集8例胆管癌和8例胆管结石患者血清,应用Albumin and IsG Removal kit去除其中的高丰度蛋白等成分,双向凝胶电泳技术分离血清蛋白样本,蛋白分离凝胶采用考马斯亮蓝染色,GPS Explorer~(TM)software凝胶图像分析软件对图像进行数据分析,通过基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱技术进行鉴定.结果 胆管癌和胆管结石患者血清双向凝胶电泳图谱中发现25个差异蛋白质点,20个差异蛋白质点获得成功鉴定,去除相同重复蛋白质后,有8种差异蛋白在胆管结石患者血清中高表达和7种差异蛋白在胆管癌患者血清中高表达.结论 胆管癌与胆管结石患者的血清蛋白中存在较多差异表达的蛋白质,利用双向凝胶电泳技术有望筛选出与胆管癌相关的肿瘤标志物.     

应用蛋白质组学技术筛选Ⅰ期非小细胞肺癌的差异表达蛋白

目的 筛选和鉴定Ⅰ期非小细胞肺癌(NSCLC)的血清差异表达蛋白.方法 分别收集经手术、病理证实的6例Ⅰ期NSCLC患者、7例肺部良性疾病患者和15例健康体检者的血清,利用双向凝胶电泳(2-DE)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对Ⅰ期NSCLC的差异表达蛋白进行分离、筛选和鉴定.结果 每一标本的3张2-DE图谱半均蛋白质点数约(323±11)个.共挖取51个差异蛋白质点,经MALDI-TOF-MS分析,成功鉴定出5种蛋白质,均为上调蛋白,分别为α1-酸性糖蛋白、C1酯酶抑制物、血管紧张素原、转铁蛋白及转甲状腺素蛋白A链.结论 应用蛋白质组学技术在Ⅰ期NSCLC血清中鉴定出5种差异表达蛋白,为开发NSCLC早期诊断标志物提供了重要的候选蛋白.     

低分化胃癌患者血清中相关标志物的筛查和鉴定

目的 初步探讨蛋白质组技术在血清研究中的应用，建立低分化胃癌患者血清和健康者血清双向凝胶电泳图谱；筛查并鉴定低分化胃癌患者血清和健康者血清中的差异表达蛋白质，期望从中发现有意义的胃癌分子标志物。方法 采用双向凝胶电泳（2-DE）分离低分化胃癌患者血清和健康者血清总蛋白，银染显色，PDQuest软件分析，从中选取差异表达蛋白质，通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定差异表达的蛋白质。结果 获得重复性和分辨率较好的血清双向凝胶电泳图谱；鉴定得到6个仅在胃癌组血清中表达的蛋白质和4个仅在对照组血清中表达的蛋白质。结论 在低分化胃癌患者血清与健康者血清中存在差异表达蛋白质，利用蛋白质组学这一高通量的筛查技术可望从中发现与低分化胃癌相关的标志物。     

炎症性肠病患者混合样本策略的蛋白质组学研究

目的 应用混合样本策略的蛋白质组学方法在炎症性肠病患者血清中寻找与疾病相关的蛋白质.方法 选取2007年3月至2008年6月中山大学附属第六医院收治的炎症性肠病患者以及健康受试者血清蛋白样本各8例,混合样本后用不同的CyDye荧光染料标记后进行胶内双向差异凝胶电泳,并对获得的图谱进行分析及对差异蛋白质进行基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定和生物学信息分析.应用DeCyder V6.0软件中的胶内差异分析及生物学差异分析软件进行统计分析.组间比较采用t检验.结果 成功建立炎症性肠病和健康受试者的胶内荧光差异染色双向凝胶图谱,发现了炎症性肠病患者中存在56个表达异常蛋白质点,质谱分析和数据库检索筛选后共鉴定出30个点有意义,包括结合珠蛋白、补体B因子、载脂蛋白A-Ⅱ、K-ras基因等.结论 采取混合样本策略、双向差异凝胶电泳、MALDI-TOF-MS技术路线的蛋白质组学方法能很好显示炎症性肠病患者与健康受试者血清蛋白质表达差异,所鉴定的蛋白质可为研究炎症性肠病的生物学行为提供新的分子标志物.     

结肠腺癌与腺瘤的蛋白质组表达差异

目的 通过比较结肠腺癌与结肠腺瘤组织的蛋白质组表达差异,寻找结肠腺癌相关的蛋白质,筛选结肠癌早期诊断的分子标志物.方法 应用蛋白质组学技术,对8例结肠腺癌组织和8例结肠腺瘤组织进行胶内差异双向电泳(2-D),选择差异表达超过2倍的蛋白点进行MALDI-TOF/TOF质谱分析和生物学信息分析.结果 成功建立结肠腺癌和结肠腺瘤的双向凝胶电泳图谱,结肠腺癌和腺瘤组织凝胶电泳图谱中平均蛋白质斑点数分别为3289和2986,其中表达差异超过2倍的斑点共有31个,质谱分析和数据库检索共鉴定出18个蛋白质,包括keratin 8、S100A6、protein disulfide isomerase等.结论 蛋白质组学可提示结肠腺癌与腺瘤组织间的蛋白质表达差异,而对相关差异表达蛋白的研究有可能为结肠癌的早期诊断和治疗提供新的分子标记物.     

二维电泳及质谱法分离和鉴定胰腺癌差异表达蛋白质

目的 通过分离并鉴定胰腺癌组织、癌旁组织和正常胰腺组织的差异表达蛋白质,发现可能用于早期诊断的胰腺癌肿瘤标志物.方法 用双向电泳分离胰腺癌、癌旁和人正常胰腺组织的总蛋白质.对胰腺癌组织中明显差异表达的蛋白点,行质谱鉴定和生物信息学分析.并对鉴定出的部分蛋白质行免疫印迹验证.结果 建立了稳定、重复性好的凝胶蛋白图谱.对分离出的在胰腺癌组织中明显差异表达的20个蛋白点,成功鉴定出11个蛋白点,其中高表达的有6个,包括:galectin-1、SLP-2、sorcin、3BP-2、BB1和NCC27.Galectin-1和SLP-2在胰腺癌组织中的高表达通过免疫印迹得到验证.结论 胰腺癌组织相对于癌旁、正常胰腺组织蛋白存在明显的表达差异.胰腺癌差异表达蛋白质可能成为用于早期诊断和评价预后的胰腺癌标志物.     

人胰腺导管腺癌组织及癌旁组织双向电泳图谱的差异分析

目的:探讨人胰腺导管腺癌组织和癌旁组织之间差异的表达蛋白。方法:利用双向凝胶电泳（2-DE）对8例胰腺导管腺癌组织和癌旁组织的总蛋白进行分离,并用质谱仪对两组间差异蛋白质点进行肽指纹谱和串联质谱鉴定。利用蛋白质印迹分析和免疫组化法检测差异蛋白在胰腺癌和癌旁组织的表达。结果:2-DE显示,肿瘤组织中有28个蛋白质点表达上调,17个表达下调。上述蛋白质点经质谱鉴定得到30个蛋白质,包括酶类、抗氧化蛋白、信号转导蛋白、钙结合蛋白、结构蛋白及分子伴侣等。Western blot和免疫组化结果显示差异表达蛋白annexin II在胰腺癌组织中表达上调,与2-DE结果一致。结论:以2-DE为基础的蛋白质组学技术是研究肿瘤的一种重要手段。本实验所得的annexin II等差异表达蛋白可能成为潜在的诊断胰腺癌的分子标志或控制肿瘤生长的治疗靶点。     

胆囊癌血清标志物的蛋白质组学研究

目的 分析胆囊癌患者和健康人血清蛋白质组的差异,筛选胆囊癌血清分子标志物.方法 以6例健康人和6例早胆囊癌患者的血清为样本,图像分析两组血清图谱寻找差异蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对差异蛋白点进行鉴定.Western blot和免疫组织化学方法检测差异蛋白质S100A10和结合珠蛋白在胆囊癌患者和健康人血清中的表达.结果 建立了健康人和胆囊癌患者血清样品的二维凝胶电泳图谱,质谱鉴定出24种非冗余的血清蛋白质.Westernblot证实了S100A10蛋白和结合珠蛋白在胆囊癌患者和健康人血清中的差异表达.免疫组织化学证实胆囊癌组织中S100A10及结合珠蛋白高表达.结论 24种血清差异蛋白质为筛选胆囊癌的血清分子标志物提供了实验依据.     

胃癌基因表达谱和蛋白质表达谱的分析研究

目的从转录组水平和蛋白质组水平寻找胃癌组织与正常胃组织间的差异表达基因和蛋白。方法应用含有14592个已知基因及表达序列标签的cDNA表达谱芯片获取基因表达谱信息．50％以上样本中Cy3／Cy5荧光强度比大于或等于2和小于或等于0．5的基因分别为在胃癌中表达上调或下调的基因。采用双向凝胶电泳（2-DE）分离32例经手术切除的胃癌患者的胃癌组织和正常胃组织总蛋白．对差异表达蛋白质点利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI—TOF—MS）进行分析．获取肽质量指纹图谱（PMF）。同时搜索SWISS-PROT数据库鉴定蛋白质。结果与正常组织相比．胃癌组织中差异表达基因共有387个,其中表达上调的有149个基因．上调超过3倍的有29个基因：表达下调的有238个基因．其中下调超过5倍的有21个基因。在蛋白质水平鉴定了15个差异表达蛋白．在肿瘤组织中高表达的有10个．其余5个在肿瘤组织中低表达。胃癌中过表达的基凶与蛋白产物主要与细胞骨架运动、细胞增殖及信号传导有关．表达下调的则主要与细胞免疫防御、毒理代谢有关。结论从转录组水平和蛋白质组水平对胃癌基因表达谱进行分析．不仅有助于从分子水平全方位理解胃癌的发病机制及生物学特性．同时也有助于进一步发现新的胃癌相关标志物和基因治疗的靶点。     

胃癌细胞甲硫氨酸依赖性的蛋白质组学研究

目的 应用蛋白质组学的技术筛选并鉴定与胃癌SGC-7901细胞甲硫氨酸依赖性相关的蛋白质.方法 将胃癌细胞株SGC-7901在同型半胱氨酸替代甲硫氨酸的培养液(M-H+)和正常培养液(M+H-)连续培养5 d后抽提细胞总蛋白,应用双向电泳与质谱技术筛选并鉴定差异表达的蛋白质,并用Western blot方法 进一步验证差异表达的蛋白质.结果 筛选并鉴定出10个差异表达的蛋白.这些蛋白质的功能主要涉及信号传导、抗氧化和药物代谢、细胞内蛋白运输等.结论 限制甲硫氨酸环境可能通过激活p38激酶信号传导通路、破坏胃癌细胞抗氧化防御机制及药物解毒功能来抑制肿瘤细胞生长.     

免疫蛋白质组学筛查具有早期诊断价值的人胰腺癌相关膜抗原

目的筛查具有早期诊断价值的人胰腺癌相关膜抗原。方法采用膜生物学技术抽提多株胰腺癌细胞的膜蛋白;双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（2-DE）分离膜蛋白,将其转移至PVDF膜上;利用纯化的胰腺癌患者血清IgG与分离的膜蛋白进行免疫印迹杂交,比对膜蛋白2-DE图谱,筛查胰腺癌特异的免疫杂交阳性斑点;MALDI—TOF质谱鉴定杂交阳性斑点;采用RT—PCR技术检测膜抗原基因在多株胰腺癌细胞中的表达;利用免疫组化染色技术检测膜抗原在人胰腺癌组织中的表达情况。结果成功提取了胰腺癌细胞株的膜蛋白;经比对膜蛋白2-DE图谱,筛查出免疫杂交阳性斑点;经MALDI—TOF质谱鉴定,免疫杂交阳性点分别为VDAC-2、VDAC-1、CHCHD3、SLP-2、TOM40;RT—PCR结果显示上述膜抗原基因在多株胰腺癌细胞中均有表达;免疫组织化学染色证实,SLP-2在胰腺癌组织中呈现显著高表达。结论SLP-2、VDAC-1、VDAC-2、CHCHD3、TOM40是新发现的与人胰腺癌相关的具有免疫原性的膜抗原,利用这些膜抗原检测胰腺癌高危人群外周血中的特异性自身抗体将有助于实现胰腺癌的早期诊断。     

血清CEA阴性结直肠癌患者血清差异蛋白质的初步筛选

目的分析血清CEA阴性结直肠癌患者、血清CEA阳性结直肠癌患者与正常人血清中差异表达蛋白,筛选潜在的与血清CEA阴性结直肠癌患者诊断及预后密切相关的血清蛋白质。方法血清CEA阴性结直肠癌患者、血清CEA阳性结直肠癌患者与正常人空腹血清标本各11例分别等量混合成3组样本,利用双向凝胶电泳（2-DE）及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI_TOF-MS／MS）技术筛选及鉴定差异表达的蛋白点,并对其部分蛋白进行生物学分析。结果筛选出3组间表达量差异2倍以上差异蛋白点共13个,进行MALDI-TOF-MS／MS分析,鉴定出：①血清CEA阴性结直肠癌患者与正常人血清比较,表达下调的蛋白有纤维胶凝蛋白2前体,纤维胶凝蛋白3,载脂蛋白L1,间a胰蛋白酶抑制剂轻链H4,转甲状腺素蛋白,表达上调的蛋白为免疫球蛋白lambda轻链。②血清CEA阳性结直肠癌患者与正常人血清比较,表达下调的蛋白有纤维胶凝蛋白2前体,纤维胶凝蛋白3,载脂蛋白L1,间a胰蛋白酶抑制剂轻链H4,转甲状腺素蛋白,表达上调的蛋白为：载脂蛋白E,结合珠蛋白。③血清CEA阴性结直肠癌患者与血清CEA阳性结直肠癌患者的1个差异点,经鉴定为免疫球蛋白lambda轻链。结论血清CEA阴性结直肠癌患者与血清CEA阳性结直肠癌患者、正常人血清的蛋白质表达谱表现出一定差异,这些差异蛋白有可能成为血清CEA阴性结直肠癌患者诊断与判定预后的血清标志物。     

胰腺癌相关免疫原性膜抗原的筛查和鉴定

目的 应用蛋白质组学技术筛查、鉴定胰腺癌相关免疫原性膜抗原.方法 培养、提取并纯化胰腺癌细胞株SW1990的膜蛋白,将膜蛋白通过双向凝胶电泳(2-DE)进行分离,平行的3块2-DE凝胶分别行考马斯亮蓝染色和免疫印迹杂交.收集并纯化临床上66例胰腺癌和24例慢性胰腺炎患者血清中的IgG,分别与膜蛋白2-DE平行凝胶进行免疫印迹杂交.应用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱分析杂交阳性蛋白位点,并经肽指纹库鉴定.应用RT-PCR、实时荧光定量PCR(real-time PCR)、Western blot方法对筛查出的膜抗原进行验证,并比较不同胰腺癌细胞株、正常胰腺组织中目的 膜抗原的基因及蛋白表达水平的差异.结果 胰腺癌细胞株SW1990膜蛋白与胰腺癌患者血清IgG免疫印迹杂交共出现9个阳性点,与同慢性胰腺炎IgG杂交所出现的2个阳性点无重复,经质谱分析鉴定出电压依赖性离子通道(VDAC)2可能是有潜力的候选膜抗原.经RT-PCR和real-time PCR验证,VDAC2基因在胰腺癌细胞株SW1990、AsPc、P3中均有表达.Western blot实验结果表明,VDAC2在胰腺癌细胞株中的蛋白表达明显高于正常胰腺组织.结论 胰腺癌细胞膜蛋白VDAC2可能是具有免疫原性的胰腺癌相关膜抗原,其基因在胰腺癌细胞株SW1990、AsPc、P3中均有表达,并且在胰腺癌细胞株中的蛋白表达水平明显高于正常胰腺组织.     

胰腺癌相关免疫原性膜抗原的筛查和鉴定

目的 应用蛋白质组学技术筛查、鉴定胰腺癌相关免疫原性膜抗原.方法 培养、提取并纯化胰腺癌细胞株SW1990的膜蛋白,将膜蛋白通过双向凝胶电泳(2-DE)进行分离,平行的3块2-DE凝胶分别行考马斯亮蓝染色和免疫印迹杂交.收集并纯化临床上66例胰腺癌和24例慢性胰腺炎患者血清中的IgG,分别与膜蛋白2-DE平行凝胶进行免疫印迹杂交.应用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱分析杂交阳性蛋白位点,并经肽指纹库鉴定.应用RT-PCR、实时荧光定量PCR(real-time PCR)、Western blot方法对筛查出的膜抗原进行验证,并比较不同胰腺癌细胞株、正常胰腺组织中目的 膜抗原的基因及蛋白表达水平的差异.结果 胰腺癌细胞株SW1990膜蛋白与胰腺癌患者血清IgG免疫印迹杂交共出现9个阳性点,与同慢性胰腺炎IgG杂交所出现的2个阳性点无重复,经质谱分析鉴定出电压依赖性离子通道(VDAC)2可能是有潜力的候选膜抗原.经RT-PCR和real-time PCR验证,VDAC2基因在胰腺癌细胞株SW1990、AsPc、P3中均有表达.Western blot实验结果表明,VDAC2在胰腺癌细胞株中的蛋白表达明显高于正常胰腺组织.结论 胰腺癌细胞膜蛋白VDAC2可能是具有免疫原性的胰腺癌相关膜抗原,其基因在胰腺癌细胞株SW1990、AsPc、P3中均有表达,并且在胰腺癌细胞株中的蛋白表达水平明显高于正常胰腺组织.