人端粒酶逆转录酶基因转染人髓核细胞的安全性研究

目的评价人端粒酶逆转录酶（humantelomerasereverse transeriptase,hTERT）基因转染对人椎间盘髓核细胞“安全性”的影响．方法将构建好的重组腺相关病毒人端粒酶逆转录酶基因（recombinantadeno—associatedvirusvee—tor—nlediatedhTERTgene,rAAV—hTERT）按感染复数（muhiplieityofinfection,MOI）10^5v．g每细胞转染体外培养二代髓核细胞。没立rAAV—hTERT转染组,AAV空病毒转染组及未转染组;利用RT—PCR及Western—blot检测转染后hTERT基闪的表达;对体外培养120d的细胞进行染色体核型分析;将3组细胞（100μL,3×10^7／mL）分别注入裸鼠腋下检测其成瘤性,以人Hela细胞为阳性成瘤实验对照。结果成功检测出rAAV—hTERT转染髓核细胞后hTERT轼因的表达;G-带核型分析未见染色体结构异常克隆;3组细胞均未观察到裸鼠体内肿瘤形成。结论rAAV—hTERT能成功转染人惟问盘髓核细胞并IF确表达,rAAV—hTERT转染髓核细胞在有限的体外培养过程中是安全的,可为进一步的在体研究提供安伞性证据.     

骨形态发生蛋白-7及其对椎间盘退变修复作用的研究进展

椎间盘退行性疾病(degenerative disc disease,DDD)是临床常见病。近年来,应用生长因子、细胞及基因等生物技术和手段治疗DDD引起了广泛关注。其中,骨形态发生蛋白-7(bone morphogenefic proteins,BMP-7)由于其对软骨细胞、纤维环细胞及髓核细胞合成代谢具有显著促进作     

人髓核软骨样细胞的生物学特性观察

目的:探讨人髓核软骨样细胞的生物学特性,为组织工程椎间盘种子细胞的选取提供依据.方法:髓核组织取材于3例脊柱侧凸行前路矫形手术者(年龄11～13岁),依次用0.25%胰蛋白酶和0.2%Ⅱ型胶原酶分离髓核细胞,用含10%胎牛血清(FBS)的F12培养液培养细胞,取传1～7代次细胞进行光镜、电镜检查,观察细胞形态学改变,对细胞计数、二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)摄取进行比较,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定细胞的聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅰ型和Ⅱ型胶原蛋白信使RNA(mRNA)的表达情况.结果:体外培养条件下,传3代之前的细胞形态正常,胞浆丰富;传4代起.部分细胞的形态逐渐向长梭形演化.与传1代细胞相比,传2、3代细胞数量增殖无明显减缓(P>0.05),传4代细胞第4天开始生长减慢(P<0.05),传5Ⅰ7代细胞第2天即较转1代细胞数量明显减少(P<0.05).传1Ⅰ3代细胞的MTT摄取吸光度值差异无统计学意义(P>0.05),和传1代相比,传4代具有统计学差异(P<0.05),传5Ⅰ7代的差异更显著(P<0.01).聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原在传3代之前各代次的mRNA表达量间无统计学差异(P>0.05),和传1代相比,Ⅱ型胶原从第4代起表达量显著下降(P<0.05),聚集蛋白聚糖从第5代起表达量显著下降(P<0.05),而从传5代起髓核软骨样细胞开始表达Ⅰ型胶原:结论:髓核细胞传代后前3代细胞形态良好,增殖能力强,聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA表达良好,适合作为组织工程椎间盘的种子细胞.     

组织工程髓核原位植入椎间盘的形态及运动学观察

目的观察组织工程髓核原位植入椎间盘的形态与运动学变化。方法以beagle犬髓核细胞-PLGA支架构建组织工程复合物。12月龄beagle犬18只随机分为A、B、C组,各6只,A组行L4~5髓核摘除术、B组行L4~5髓核摘除＋空白支架植入术,C组行L4~5髓核摘除＋髓核细胞-PLGA支架复合物植入术。术前、术后及实验犬处死前行腰椎正侧位及过屈过伸位X线片检查;术前及处死前行腰椎MRI平扫检查,测量术后椎间隙高度及MRI髓核信号。结果术后A、B组实验犬椎间隙高度降低均〉1 mm,C组椎间隙高度降低〈0.8 mm;术前实验犬L4~5椎间盘活动度为5.78°±0.95°,术后A组为9.56°±0.87°、B组为10.17°±0.37°、C组为8.38°±0.45°,C组与A、B组相比,P均〈0.05;手术节段髓核信号比灰度值A组为0.15±0.06、B组为0.13±0.04、C组为0.24±0.06,C组与A、B组相比,P均〈0.05。结论髓核细胞-PLGA支架复合物能较好地维持椎间盘节段高度、髓核含水量及节段稳定性。     

慢病毒载体介导绿色荧光蛋白基因在椎间盘髓核细胞中的表达

目的本研究构建含绿色荧光蛋白基因的重组慢病毒,并观察其在人椎间盘髓核细胞中的表达情况。方法应用分子克隆技术将绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因导人慢病毒载体质粒pLenti6／V5 TOPO,应用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统（包括包装质粒、包膜蛋白质粒等）共转染入293细胞进行包装,48h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,72h收集病毒上清并感染髓核细胞,在荧光显微镜下感染情况。结果重组慢病毒滴度测定约为10^7U／mL。感染人椎间盘髓核细胞后,荧光显微镜下观察到GFP的表达。结论成功构建了含GFP的慢病毒载体,且能成功将目的基因转入椎间盘髓核细胞并表达。     

不同细胞接种密度构建组织工程椎间盘的实验研究

目的:探索构建组织工程椎间盘时合理的细胞接种数量.方法:取孕20周自然流产的人胚胎椎间盘细胞为种子细胞,聚乳酸-羟基乙酸(polylactic-glycolic acid.PLGA)材料为支架分别构建细胞接种密度为0(A组,空白对照组)、104个/150μl(B组)、105个/150μl(C组)、106个/150μl(D组)的细胞-支架复合物,体外培养48h后植入裸鼠背部皮下,8周后取材行形态及HE和免疫组织化学染色组织学观察,生化测定Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白和糖胺聚糖,观察BrdU(5-bromo-2-deoxyuridine,5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷)标记细胞.结果:人胚胎椎间盘细胞可与PLGA支架在体外及裸鼠体内实现良好的复合并初步发挥生理功能.8周时,实验组复合物维持了良好的外形,有效阻挡了外源纤维组织长人支架内部.细胞-支架复合物内有大量BrdU阳性细胞.C组及D组细胞-支架复合物中胶原蛋白及糖胺多糖的表达量明显高于A组和B组,差异有显著性(P<0.01).结论:人胚胎椎间盘细胞在体外培养条件下可与PLGA支架完成良好的立体结合,细胞可顺利完成贴附及增殖.构建组织工程椎间盘时比较理想的细胞接种密度应不低于105个/150μl.     

椎板后壁部分刮除辅助透视行颈椎弓根钻孔

目的探索椎板后壁部分刮除辅助透视行下颈椎椎弓根钻孔的可行性。方法3具新鲜尸体下颈椎的30例椎弓根，透视确定椎弓根轴线所在高度，将此高度侧块与椎板后壁交界内外侧各5mm范围内的皮质骨去除，刮除其下松质骨，先暴露出内侧的椎板前壁，后紧贴椎板前壁向外侧刮除，找到椎弓根入口。根据内倾角确定入口外侧骨质去除范围，以椎弓根内壁为参照，透视确定上倾角，行髓腔钻孔。CT扫描明确钻孔准确性。结果1例髓腔消失，放弃钻孔；27例钻孔准确；2例髓腔〈3mm，椎弓根外壁向外侧移位，但〈2mm。结论椎板后壁部分刮除辅助透视行下颈椎椎弓根髓腔钻孔效果满意。     

组织工程椎间盘体内原位植入的实验研究

目的:观察组织工程椎间盘原位植入Beagle犬腰椎间盘后支架与种子细胞的转归及犬腰椎间盘的形态与功能变化。方法:应用聚乳酸聚酯(polyL-lactic-co-glycolicacid,PLGA)可吸收多孔支架复合犬髓核细胞构建组织工程椎间盘。将18只Beagle随机分为3组,均摘除L4/5椎间盘髓核,A组单纯髓核摘除,B组植入空白PLGA支架,C组植入组织工程椎间盘。术后定期行X线片及MRI检查,分别于术后4、8及12周处死动物行组织病理及免疫组化观察。结果:全部动物术后存活。4周后,X线片示3组椎间盘高度均有下降,C组下降幅度较小,与A、B组比较有显著性差异(P0.05);A组和B组手术节段屈伸活动度(ROM)明显大于C组(P0.05);MRI示A组与B组椎间盘退变明显,呈"黑间盘"改变,而C组椎间盘退变程度较轻,呈灰色,MRIT2加权像上椎间盘信号灰度值测量结果示A、B组明显低于C组(P0.05)。术后4周B、C组组织学观察未见到支架材料结构,A、B组椎间盘内纤维组织增生形成瘢痕样组织,C组于术后8周仍能观察到植入的红色荧光细胞,有大量类软骨细胞增生伴丰富的细胞外基质。术后8周免疫组化显示三组均有Ⅰ、Ⅱ型胶原着色,其中C组Ⅱ型胶原染色强度高于Ⅰ型,A、B组Ⅰ型胶原染色强度高于Ⅱ型。结论:PLGA组织工程椎间盘支架在体内可降解吸收;种子细胞可存活并分泌Ⅰ、Ⅱ型胶原,能阻止纤维组织侵入及瘢痕形成;维持了脊柱节段稳定及生理活动功能。     

重组2型腺相关病毒-人骨形成蛋白7转染犬髓核细胞及其对髓核细胞表型的影响

目的:观察重组2型腺相关病毒-人骨形成蛋白7(recombinant adeno-associated virus-2expressinghuman bone morphogenetic protein-7,rAAV2-hBMP7)转染犬髓核细胞情况及其对细胞表型的影响。方法:用1岁龄Beagle犬L4/5椎间盘髓核进行髓核细胞体外培养,取第2代髓核细胞进行实验,实验组以rAAV2-hBMP7(1×105v.g/细胞)转染髓核细胞,对照组以重组2型腺相关病毒-增强型绿色荧光蛋白(recombinantadeno-associated virus-2expressing enhanced green fluorescent protein,rAAV2-EGFP)转染髓核细胞。在转染后4d、7d和14d以PCR检测髓核细胞中hBMP7的mRNA表达,在转染后7d和14d以Western blot法检测髓核细胞中hBMP7蛋白表达。在转染后4d、7d和14d采用RT-PCR法检测蛋白多糖、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的mRNA含量,采用二甲基蓝及ELISA法分别检测蛋白多糖、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的蛋白含量。结果:实验组髓核细胞表达hBMP7 mRNA及蛋白,并于转染后7d时表达量最高,而对照组无表达。实验组髓核细胞蛋白多糖mRNA及蛋白含量在转染后7d和14d时较4d时明显增高,14d时较7d时亦明显升高(P0.05),对照组各时间点无统计学差异(P0.05);4d时实验组与对照组比较无明显差异,7d和14d时较对照组明显增加(P0.05)。同组各时间点Ⅰ型胶原mRNA及蛋白含量均无统计学差异,两组各时间点间比较无统计学差异(P0.05)。实验组髓核细胞Ⅱ型胶原mRNA及蛋白含量在转染后7d和14d时较4d时明显增高,14d时较7d亦明显升高(P0.05),对照组各时间点无统计学差异(P0.05);实验组4d时与对照组比较无明显差异,7d和14d时较对照组明显增加(P0.05)。结论:rAAV2-hBMP7转染犬髓核细胞后能表达hBMP7蛋白,并能提高其蛋白多糖及Ⅱ型胶原含量。