神经干细胞移植再支配失神经骨骼肌的实验研究

目的 探讨采用神经干细胞移植的方法使失神经骨骼肌重获神经再支配的可行性。方法 将108只SD大鼠按注射药物的不同随机分为3组，每组36只大鼠。切断右侧胫神经建立腓肠肌失神经实验模型。实验组：将神经干细胞悬液注射到切断胫神经的远端。对照组：注射等量的细胞培养液。损伤组：注射等量的生理盐水。术后8、10、12周采用免疫组织化学、HRP逆行示踪技术和神经形态学的方法，检测失神经骨骼肌是否重新获得移植神经干细胞的再支配。结果 术后8周局部即可检测到分化的神经元和神经胶质细胞，其再生的轴突与靶肌肉已经建立神经突触连接。术后10、12周时，再生的神经纤维进一步增多。结论 周围神经断伤后局部用神经干细胞移植能够使远端失神经骨骼肌重新获得神经再支配。     

应用胚胎脊髓前角细胞移植修复大鼠神经损伤的实验研究

目的　观察鼠胚胎脊髓前角细胞移植入胫神经远断端后的变化及作用。方法　将 2 4只SD大鼠随机分为移植组和对照组 ,每组 12只。切断大鼠右侧胫神经形成失神经腓肠肌实验模型。分离并制备孕 14～ 18d大鼠胚胎脊髓前角运动神经元 ,植入已切断的胫神经远断端。对照组在相同部位注射等量的培养液。术后 3个月 ,对移植细胞进行组织学观察、Nissl染色和辣根过氧化物酶 (horseradishperoxidase ;HRP)逆行示踪检测。行胫神经再生纤维计数 ,并检测腓肠肌电生理变化、肌湿重和肌动蛋白表达。结果　植入细胞能在胫神经远端存活 ,呈现Nissl阳性染色并被HRP逆行示踪所标记。移植组胫神经的再生率、腓肠肌肌湿重和肌动蛋白含量均明显高与对照组 (P <0 .0 5 )。电刺激移植组胫神经可记录到腓肠肌的诱发动作电位 ,能引起肌肉收缩和踝关节运动。结论　同种异体胚胎脊髓前角细胞移植到外周神经内可使靶肌肉获得神经支配并延缓其失神经萎缩的变化。     

神经营养因子-3基因移植的雪旺细胞延缓肌萎缩的实验研究

目的 探讨神经营养因子-3(neurotrophic factor-3,NT-3)基因修饰的雪旺细胞(Schwann cells,SC)延缓失神经性肌肉萎缩的作用.方法 采用双酶消化法和贴壁法培养、纯化与传代SC.应用阳离子脂质体以NT-3基因修饰SC,免疫组织化学S-100染色检测NT-3基因转入前后SC的纯度.切断右侧胫神经建立腓肠肌失神经支配的动物模型.将104只SD大鼠按注射药物的不同随机分为4组,每组26只.A组,细胞外基质(extracellular matrix,ECM)凝胶组;B组,SC-ECM凝胶组;C组,NT-3基因-ECM凝胶组;D组,NT-3基因修饰的SC-ECM凝胶组.术后12周进行腓肠肌肌肉电生理,8周和12周做肌湿重、肌纤维横截面积的检测.结果 NT-3转染前后SC纯度分别为(94.7±2.1)%及(95.6±2.5)%,两者比较差异有统计学意义(P＜0.05).术后12周用电刺激腓肠肌,均可引出肌肉收缩活动;且随着时间的延长,单次收缩的波幅、速度,及强直收缩的时间和强直收缩波幅的恢复率均增加.D组均优于B、C组,B、C组均优于A组(P＜0.05),而B、C组相比差异无统计学意义(P＞0.05).术后8周和12周的肌湿重与肌纤维横截面积D组均优于B、C组,B、C组均优于A组(P＜0.05),而B、C组相比差异无统计学意义(P＞0.05).结论 转染NT-3基因的SC移植能够实现失神经骨骼肌的神经再支配,并且能与骨骼肌建立起功能性突触连接,有延缓失神经性骨骼肌萎缩的作用.     

骨骼肌卫星细胞移植对延缓失神经肌肉萎缩的作用

目的探讨骨骼肌卫星细胞移植对延缓失神经骨骼肌萎缩的作用,为提高治疗失神经骨骼肌萎缩的疗效提供依据。方法取成年SD大鼠32只,雌雄不限。随机分为2组,对照组与实验组各16只。两组均切断大鼠右后肢坐骨神经,并造成1cm神经缺损,形成失神经支配腓肠肌动物模型。无菌条件下切取SD大鼠双后肢及背部的肌肉,采用两步酶消化法分离肌卫星细胞,不连续密度梯度离心法纯化后体外培养,传代培养14～20d,细胞扩增至1×107/ml以上后准备移植。移植前1d以质量分数为0.02%的DAPI(4′-6-二脒基-2-苯吲哚)荧光标记肌卫星细胞过夜,实验组与对照组分别取肌卫星细胞悬液和生理盐水各0.2ml,注入腓肠肌内。术后第2、8周时取双侧腓肠肌测定肌湿重,然后行肌动蛋白免疫组织化学染色及HE染色,并作图像分析,测定肌纤维横截面积及肌动蛋白的含量,数据经SPSS10.0软件处理,行两组样本均数t检验。结果肌卫星细胞移植处可观察到带荧光的细胞核及肌纤维。实验组第2、8周时,失神经支配腓肠肌湿重残存率、腓肠肌纤维横截面积残存率、腓肠肌肌动蛋白含量与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论肌卫星细胞移植到失神经骨骼肌内可明显延缓骨骼肌的萎缩。     

心脏营养素-1对失神经骨骼肌的营养和保护作用

目的探讨心脏营养素-1（Cardiotrophin-1，CT-1）及其受体在失神经骨骼肌中的表达规律，观察外源性CT-1对失神经骨骼肌的营养和保护作用。方法选用11组Swiss小鼠，每组10只，切断其右侧胫神经，分别于术后不同时间点完整切取失神经腓肠肌，用Northern blot法测定肌肉中CT-1及其受体亚基LIFR-β，gp130的mRNA含量，探讨三者的表达规律。另取Swiss小鼠30只，同样方法切断其胫神经后，连续腹腔注射CT-1（100μg／kg／d），于7、14和28d后检测失神经腓肠肌的湿重、肌纤维横截面积和肌肉总蛋白含量，观察超微结构的变化，分别与对照组比较。结果CT-1及其受体在正常骨骼肌中均有表达。胫神经切断后，腓肠肌中CT-1的表达进行性下降；而LIFR-β和gp130在早期均有一个表达增高的过程，前者的表达高峰出现在失神经支配后24h，后者在神经切断后1周表达最高。连续应用外源性CT-12周，有效地维持了失神经腓肠肌的湿重、肌纤维横截面积和总蛋白含量，减轻了肌浆网的扩张程度。用药4周后，这种效果更加明显。结论内源性CT-1表达不足，是失神经骨骼肌早期萎缩的一个重要因素。受体gp130／LIFR-β的表达上调，提高了肌肉对其配体CT-1的敏感性，及时应用外源性CT-1，可对失神经骨骼肌产生营养和保护作用，能有效地延缓失神经骨骼肌的萎缩。     

胚胎运动神经元移植对失神经肌肉影响的实验研究

目的探讨胚胎运动神经元移植至入肌点前支配神经内对失神经肌肉萎缩的影响.方法取20只健康SD大鼠建立失神经腓肠肌动物模型,随机分移植组和对照组(每组10只);将胚胎14～18d的SD鼠胚脊髓前角运动神经元的活细胞悬液注入移植组切断的胫神经远端,对照组注射等量的生理盐水.手术后第3个月,进行腓肠肌肌力、肌湿重测定,组织和免疫化学检查以及胫神经纤维计数,并作图像分析.结果种植入胫神经内的鼠胚胎运动神经元能够存活.移植组腓肠肌肌力和肌湿重恢复率高于对照组,差异有显著性(P＜0.01);肌纤维横截面积恢复率高于对照组,差异有显著性(P＜0.05),且I型、Ⅱ型纤维面积均优于对照组(P＜0.05);肌动蛋白的相对含量移植组高于对照组,差异有显著性(P＜0.05);移植组运动终板结构清晰,而对照组大部分运动终板崩解,两组运动终板恢复率比较,差异有显著性(P＜0.05);移植组神经纤维再生率为0.661±0.149,高于对照组的0.463±0.109,差异有显著性(P＜0.01).结论胚胎运动神经元移植至外周神经内,便于靶组织获得神经营养,能延缓失神经肌肉的萎缩,并可提高其功能的恢复.     

不同移植时间对胚胎脊髓源性神经干细胞体内分化为神经元影响的实验研究

目的 探讨不同移植时间对胚胎脊髓源性神经干细胞体内分化为神经元影响,为胚胎脊髓源性神经干细胞移植防治骨骼肌失神经萎缩的最佳移植时间点的选择提供实验依据.方法 从孕龄14 d SD大鼠胚胎脊髓组织中分离、获得并鉴定脊髓源性神经干细胞.90只SD大鼠分为9组,分别于胫神经切断后0、1、2、3、4、6、8、12及16周,移植胚胎脊髓源性神经干细胞至切断胫神经远端神经外膜下,移植后4周取胫神经冰冻切片行免疫组化方法 计数神经元数量并进行图像分析.结果 损伤后1周移植时,神经元数量最多,其次为损伤后6周,损伤后16周组无神经元存在.结论 对胚胎脊髓源性神经干细胞体内移植后分化为神经元影响最小的时间点是损伤后1周,因此我们可以推断胚胎脊髓源性神经干细胞移植防治骨骼肌失神经萎缩的最佳移植时间点是损伤后1周.     

失神经支配骨骼肌退变组织形态学及电生理实验研究

目的研究大鼠失神经支配骨骼肌组织形态学及其电生理变化,为临床寻找检测肌肉萎缩程度的方法及更好防治肌肉萎缩提供理论基础。方法选用成年ＳＤ大鼠,切断胫神经建立失神经支配腓肠肌实验模型。测定萎缩肌肉湿重、肌细胞直径及截面积,观察骨骼肌运动终板及肌肉纤颤电位波幅与频数变化。结果４周内肌肉湿重下降最快,以后逐渐减慢并维持于一定水平,而肌细胞直径及截面积呈持续性下降;在４周内运动终板改变不明显,６周后退变逐渐加重,１６周后消失;２周时肌肉纤颤电位波幅最大,１２周后进行性下降,２０周时有半数以上大鼠出现电静息,频数与波幅值变化规律相一致。结论肌肉湿重、肌细胞直径及截面积可作为反映肌肉萎缩的组织形态学指标,而后两者更为可靠;肌肉纤颤电位波幅与频数可作为电生理指标,周围神经损伤后修复手术越早越好,应力争在运动终板消失前进行。     

失神经纤颤电位及正尖波波幅与神经修复后肌肉功能恢复关系的实验研究

目的 研究大鼠腓肠肌失神经支配后纤颤电位与正尖波波幅的变化,并探讨其与在损伤后不同时期修复断伤胫神经后腓肠肌功能恢复间的相关性。方法 雄性SD大鼠54只,按手术先后顺序随机分为8组。第1组12只大鼠,于切断其右侧胫神经后即刻、48h、72h、1周、2周、4周、8周、12周、16周,测定右侧腓肠肌的纤颤电位及正尖波。第2－7组（每组6只大鼠）,分别在胫神经切断后1、2、4、8、12、16周时修复神经,各组于修复后12周取腓肠肌,测定肌湿重及肌纤维直径及截面积。第8组（6只大鼠）作为正常对照组。结果 第1组的正尖波先于纤颤电位出现,纤颤电位的波幅在术后1周最高,在神经切断后4周内维持在较高水平;术后8周起春波幅呈进行性,16周时全部消失。正尖波于神经切断后478h开始出现,术后8周其波幅最大,术后16周时半数大鼠的正尖波消失。于神经断伤后8周内修复后胫神经,恢复的肌肉功能与正常对照组相比,差异无显著性意义（t＝1．952,P＞0．05）;神经断伤后12周以后修复组恢复的肌肉功能明显变差,与正常对照组相比差异有显著性意义（t＝3．127,P＜0．05）。结论 失神经支配腓肠肌纤颤电位下正尖波的波幅。与神经修复后功能恢复程度间有密切的相关性,可作为大鼠失神经骨骼肌萎缩是可逆的一个量化指标。     

被动活动对失神经支配骨骼肌萎缩的影响

目的 研究被动活动对失神经支配骨骼肌萎缩的影响。方法 选用SD大鼠16只，建立双侧下肢失神经支配腓肠肌的实验模型，被动活动右下肢，观察肌肉的组织学、超微结构、纤颤电位波幅及Na、K-ATP酶和Ca-ATP酶活性变化。结果 被动活动延缓肌细胞的线粒体、肌质网退变；被动活动侧肢体肌细胞直径及截面积较对照侧下降速度明显减慢；被动活动延缓肌肉纤颤电位波幅峰值出现时间；Na、K-ATP酶活性下降速度被动活动侧较对照侧慢23．53％；Ca-ATP酶活性下降速度被动活动侧较对照侧慢27．94％。结论 被动活动肢体对失神经支配骨骼肌的组织学、电生理及酶组织化学的各项指标均有保护作用，是延缓失神经支配肌肉萎缩发生与发展的有效手段。     

Application of fetal neural stem cells transplantation in delaying denervated muscle atrophy in rats with peripheral nerve injury

Injury to peripheral nerves always results in progressive skeletal muscle atrophy and poor functional recovery. Previous studies have demonstrated that transplanting neural stem cells (NSCs) into peripheral nerve can differentiate into neurons and delay muscle atrophy. However, the mechanism was not very clear. In this study, we transplanted the fetal NSCs to the injured nerve and examined new formed neuromuscular junctions (NMJs) in the denervated muscle and arrest of muscle atrophy. In our study, two pregnant Fischer rats were used to harvest fetal NSCs, 70 rats were randomly divided into NSC‐transplanted and control groups, five rats without surgery were used as the normal control. A volume of 5 μl culture media with or without fetal NSCs (5 × 10⁶) were transplanted into distal tibial nerve stump after the nerve was transected in two groups, respectively. Three, five, and seven months after denervation, the dry weight of gastrocnemius muscle was found significant heavier, and the fiber area was more retained in NSC‐transplanted group comparing to the control group (P < 0.05). Neurons were found in the distal tibial nerves even 7 months after fetal NSCs transplantation. Newly formed NMJs were detected by immunohistochemistry. In addition, the results of electrophysiological analysis and retrograde tracing manifested that the neural pathway between muscle and differentiated neurons was integrity. In conclusions, our study demonstrated that fetal NSCs transplanted into peripheral nerves could differentiate into neurons and form functional NMJs with denervated muscle, which may be beneficial for the treatment of muscle atrophy after peripheral nerve injury. © 2009 Wiley‐Liss, Inc. Microsurgery, 2010.     

神经束植入联合甲钴胺治疗失神经骨骼肌的实验研究

目的研究神经束植入治疗失神经支配骨骼肌．并比较靶肌肉局部用药与全身性用药的疗效,探讨神经营养药物应用的最佳给药方法。方法选用雄性大鼠60只随机等分5组．每组12只,制作左侧胫神经切断动物模型。A组：神经束植入组;B纽：神经束植入＋左侧腓肠肌注射甲钴胺;C组：神经束植入＋腹腔注射甲钴胺;D组：胫神经切断：E组：胫神经切断＋左侧腓肠肌注射生理盐水。术后当日开始,B组隔日左侧腓肠肌注射甲钴胺300μg／kg;C组隔日腹腔注射甲钴胺300μg／kg;E组隔日左侧腓肠肌注射等渗盐水0．02ml。分别于术后4周和8周测量左小腿腓肠肌电生理、肌纤维横截面积和肌细胞TUNEL染色。结果术后4周及8周,A,B,C三组腓肠肌电位波幅组间比较差异均有显著性（P〈0．05）;D组与E组腓肠肌纤颤电位波幅差异无显著性（P〉0．05）。术后4周及术后8周,肌纤维横截面积和肌细胞TUNEL阳性细胞数A,B,C组间差异均有显著性（P〈0,05）,D,E组间差异无显著性（P〉0．05）,A,B,C组与D,E组差异有显著性（P〈0．05）。B组明显优于其他组。结论神经柬植入能有效防治失神经骨骼肌萎缩,靶肌肉给药效果优于全身用药。     

神经干细胞移植延缓失神经肌肉萎缩的实验研究

目的 研究异体神经干细胞(neural stern cell,NSC)移植于切断的周围神经远端,延缓失神经肌肉萎缩的作用,并探讨其发挥作用的可能机制.方法 取2只孕12～14 d绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)转基因大鼠,取其胚胎并体外分离培养脊髓NSC.选取2月龄健康成年F344雌性大鼠32只,体重(180±20)g,随机分为实验组和对照组(n=16).于右股部膝关节上1.5 cm处水平切断胫神经及腓总神经,近端反折缝合,建立小腿三头肌失神经支配模型.实验组:将制备的5μGFP-NSC悬液自胫神经远侧断端进针1 cm后缓慢注入胫神经内;对照组:同法注入等量NSC培养上清液.术后观察大鼠一般情况,于术后4周及12周取材,测量小腿三头肌湿重,行肌肉HE染色、Mallory三色染色及突触后膜染色,观察并测量肌纤维横截面积维持率及肌肉突触后膜的形态和面积.结果 各组大鼠伤口均Ⅰ期愈合,右侧后肢无溃疡发生.术后4周和12周,右侧小腿三头肌湿重,实验组分别为(0.849±0.064)g和(0.596±0.047)g,对照组分别为(0.651±0.040)g和(0.298±0.016)g,同时间点组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).术后4周与12周,骨骼肌纤维横截面积维持率实验组分别为72.55%±8.12%和58.96%±6.07%,对照组分别为50.23%±4.76%和33.63%±4.41%:实验组均优于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).失神经肌肉经Mallory三色染色,术后4周可见肌纤维之间已有大量胶原纤维增生:术后12周,胶原纤维进一步增多,大部分肌肉纤维被取代,但实验组纤维化程度轻于对照组.术后12周,实验组突触后膜面积为(137.29±29.14)μm2,更接近于正常(198.63±23.11)μm2,达对照组(61.03±11.38)μm2的2倍以上,各组差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 异体胚胎脊髓NSC体内移植可发挥延缓失神经肌肉萎缩和维持失神经肌肉突触后膜形态、功能的作用,为临床上周围神经损伤后肌肉萎缩的防治提供了新的思路和方法.     

神经干细胞移植延缓失神经肌萎的作用机制

目的 研究脊髓神经干细胞移植到外周神经后延缓失神经肌萎的作用及机制.方法 取孕10～12 d的SD孕鼠,提取、培养及纯化脊髓神经干细胞,传2～3代后,将分散成单细胞的神经干细胞(106/μl×5μl)移植到胫神经切断模型的远端;设立对照组,移植5μl干细胞培养液.术后分别于3、5个月取材,观察移植神经干细胞的分化;比较干细胞移植能否延缓失神经肌萎;观察靶肌肉中突触(神经肌肉接头)的变化情况.结果 移植后3、5个月,发现移植组小腿三头肌萎缩较对照组减轻(P<0.05);移植组中的突触后膜退变萎缩明显好于对照组,术后5个月出现了新的突触结构.结论 神经干细胞移植可以延缓失神经肌萎的程度,有效保护失神经肌肉突触后膜的结构,并能形成新的突触.     

缺血对失神经肌肉超微结构及酶组织化学的影响

目的 研究肢体缺血对失神经支配骨骼肌组织学、超微结构及Na、K—ATP酶和Ca—ATP酶活性的影响。方法 选用SD大鼠24只，建立双下肢失神经支配腓肠肌实验模型后，结扎右侧股动脉，观察肌细胞的组织学，超微结构及Na、K—ATP酶和Ca—ATP酶活性变化。结果 缺血侧肢体肌细胞直径及截面积较对照侧下降速度快25．48％及32．33％(t=2．94，P＜0．05；t＝2．88，P＜0．05)；缺血加速肌细胞线粒体，肌质网退变；Na、K—ATP酶活性术后2周实验侧较对照例增高59．68％，而术后4周缺血侧较对照侧下降17．45％(t＝2．24，P＜0．05)；Ca—ATP酶活性下降速度缺血侧较对照侧分别快26．42％及21．87％(t＝2．64、2．24，P＜0．05)。结论 缺血加速失神经支配骨骼肌萎缩的发生与发展，周围神经损伤合并肢体动脉损伤时，动脉尽可能予以全部修复。     

班布特罗与当归补血汤对失神经肌肉萎缩防治作用的实验研究

目的：研究班布特罗及当归补血汤对防治失神经骨骼肌萎缩的作用效果及有无协同作用。方法 SD大鼠40只，随机分组，每组10只，建立失神经骨骼肌萎缩的实验模型。术后4周处死大鼠，双侧腓肠肌及心脏称重，测定肌肉SOD含量，测肌纤维直径，检测细胞凋亡情况。结果 各用药组与对照组肌总蛋白含量、SOD含量、肌纤维直径均无显著性差异（P〉0．05）。在排除个体体重差异后肌肉湿重亦无显著性差异。两种药物之间无协同作用。各组均可见凋亡细胞，荧光显微镜下肉眼观测凋亡细胞的数量无显著性差异。结论 班布特罗与当归补血汤在4周时无明显预防肌萎缩作用及协同作用；细胞凋亡在失神经肌萎缩中发挥一定的作用；本实验为探索药物长期应用防治失神经骨骼肌萎缩的研究提供借鉴。     

神经营养素3基因修饰的神经干细胞对周围神经再生修复的影响

目的 探讨神经营养素3基因修饰的神经干细胞对周围神经再生的影响。方法 54只SD大鼠随机分为3组，造成坐骨神经切断损伤模型，神经外膜端端缝合，于小腿三头肌每周分别注射生理盐水、未被神经营养素3基因修饰的神经干细胞、及神经营养素3基因修饰的神经干细胞。术后3、6、9周动态观察坐骨神经功能指数(SFI)以了解后肢功能恢复情况、组织学切片观察、肌湿重恢复率测定、9周后吻合口神经干的电镜观察。结果 神经营养素3基因修饰的神经干细胞组动物的有髓神经纤维密度、神经组织面积、髓鞘厚度、肌湿重以及坐骨神经功能指数均显著优于未被神经营养素3基因修饰的神经干细胞组和生理盐水组，9周时差异有统计学意义。单纯神经干细胞组各项指标优于生理盐水组。结论 将神经营养素3基因修饰的神经干细胞移植于修复的周围神经，使局部释放的NT-3加快轴突再生速度以促进周围神经再生，减缓失神经支配肌肉的萎缩。