糜蛋白酶在烟草烟雾诱导的仓鼠肺动脉高压中的作用

目的探讨糜蛋白酶在烟草烟雾所诱导的肺动脉重构和肺动脉高压中的作用。方法将仓鼠暴露在烟草产生的烟雾中（烟雾暴露组,n=6）,4个月后,使用免疫组织化学法、蛋白免疫印迹法、放射免疫学测定、反转录PCR等测定仓鼠肺的形态学和肺组织的生物化学改变。对烟雾暴露组与对照组（n=6）上述指标进行比较。结果长期烟草烟雾暴露使仓鼠右心室收缩压升高,肺小动脉中层细胞肥大,同时肺组织糜蛋白酶活性及合成增加,血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）水平升高（与对照组比较,P均﹤0.05）。糜蛋白酶抑素（chymostatin）可以降低烟草诱导的仓鼠肺组织中糜蛋白酶活性的增加和AngⅡ水平,改善肺小动脉的重构程度,降低右心室收缩压,但对仓鼠肺组织中血管紧张素转换酶（ACE）的活性无影响。结论长期烟草烟雾暴露可增加仓鼠肺中糜蛋白酶的活性及表达,激活的糜蛋白酶进一步诱导肺组织AngⅡ形成,这可能是烟草诱导的肺动脉高压发生机制的一部分。因此,糜蛋白酶抑素也许会对吸烟的肺动脉高压患者有益。     

人脐带间充质干细胞高效分离的方法

背景：目前利用传统分离提取细胞的方法所获取的人脐带来源的间充质干细胞与脐带组织中所含人脐带来源的问充质干细胞的理论值相差甚远,造成脐带组织的极大浪费,阻碍了间充质干细胞的规模化制备培养。目的：建立一套高效分离人脐带间充质干细胞的方法,为间充质干细胞应用于临床提供技术方案。方法：实验分为4组,以传统酶法（胰酶与Ⅱ型胶原酶）为对照组,在此基础上,针对脐带结构分别逐一加入Ⅳ型胶原酶、透明质酸酶、DNase来对脐带组织进行消化,各实验组设不同作用时间组,比较不同分离方法、不同作用时间所获得细胞数量、细胞活性、原代细胞贴壁出现时间、融合时间及所获得人脐带来源的间充质干细胞第3代细胞在增殖能力、表面标记与多向分化能力方面的差别。结果与结论：经Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、胰蛋白酶、透明质酸酶和DNAase联合作用于脐带组织,4h细胞计数达到最高（12．47±0．16）×10^6/cm（P〈0．01）;活力为（75．00±5．07）％（P〈0.01）：收获的混合细胞中CD105阳性率及CD29阳性率均高于对照组;细胞贴壁及细胞团融合时间均较对照组缩短（P〈0．01）;伴随细胞的传代,形态逐渐均一,第3代细胞形态基本达到统一,呈梭形漩涡状生长;实验组P3人脐带来源的间充质干细胞特异性标记CD44,CD105,CD29阳性率阳性率均高于对照组,CD34阳性率低于对照组。向脂肪细胞诱导4周后,油红O染色鉴定可见细胞内大量脂滴：向成骨细胞诱导后,茜素红染色鉴定,大体观察可见阳性钙沉积。实验证明了Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、胰蛋白酶、透明质酸酶和DNAase四酶联合消化脐带组织作用4h的方法缩短了分离细胞用时并显著提高了细胞产量、细胞活力以及细胞增殖能力,同时缩短原代细胞贴壁时间、融合时间。提取得到的原代细胞中间充质干细胞比例,第3代间充质干细胞细胞纯度较传统方法均有提高。     

构建原代分离培养与鉴定小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的方法及模型

背景:肺泡Ⅱ型上皮细胞在肺发育和肺功能调节中起重要作用,它与肺纤维化和肺癌等疾病的发生发展有密切联系,为了对这些疾病进行体外实验研究,必须对肺泡Ⅱ型上皮细胞进行分离、原代培养与鉴定以建立一个稳定高效的细胞模型.目的:建立一套可靠的小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞分离、纯化、原代培养与鉴定的方法,为肺纤维化及肺癌等疾病的进一步研究奠定基础.方法:①用低浓度胰酶联合Ⅰ型胶原酶消化法,分离小鼠肺组织细胞成分.取出小鼠肺组织,剪成小块,加入胰蛋白酶,移出细胞悬液,加入含胎牛血清的DMEM中止消化;同法用胰蛋白酶再消化1次,中止消化后加入Ⅰ型胶原酶,再中止消化.②经差速离心差速贴壁和免疫黏附法纯化肺泡Ⅱ型上皮细胞,进行原代培养.将肺细胞悬液接种入包被小鼠IgG的培养皿中培养,吸出含未黏附细胞的液体接种于另一包被小鼠IgG的培养皿中培养,吸出未黏附细胞,去上清,重悬沉淀,将细胞接种于培养皿和培养板中培养.倒置显微镜观察细胞形态及生长特点,测定肺泡Ⅱ型上皮细胞产量、纯度及活力,免疫细胞化学染色鉴定肺泡表面活性蛋白A和肺泡表面活性蛋白C的表达,透射电镜鉴定肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性细胞结构.结果与结论:用此方法,每只小鼠获得肺泡Ⅱ型上皮细胞(4.8±1.2)×10~6,纯度达到(85.0±2.4)%,细胞活力为(92.0±2.4)%,倒置显微镜下原代肺泡Ⅱ型上皮细胞呈圆形或立方形,细胞质内有大量反差明显的细小颗粒,细胞为岛状生长方式;免疫细胞化学鉴定,肺泡表面活性蛋白A呈棕黄色,肺泡表面活性蛋白C呈绿色,均定位表达于细胞浆;透射电镜见特征性板层小体和细胞游离面大量微绒毛.证实利用胰酶联合胶原酶消化,差速离心差速贴壁和免疫黏附纯化的方法可获得高产量高纯度的AEC Ⅱ,能满足一般的体外实验要求.     

血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体检测法的建立与应用

目的 建立血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体的ELISA法,探讨其在类风湿关节炎(RA)患者中的应用价值.方法 以自提可溶性鸡Ⅱ型胶原蛋白(soluble chicken collagen type Ⅱ,SCC Ⅱ)作为包被抗原,优化实验条件,建立抗Ⅱ型胶原蛋白抗体间接ELISA法.对124例RA病人和54例健康人血清抗II型胶原蛋白抗体进行检测.结果 血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体的检测条件为:SCCⅡ包被浓度为20 μg/ml;以含10%羊血清的缓冲液进行封闭、稀释血清和酶标抗体;采用双波长(450nm/630 nm)进行测定.RA患者和健康人血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体阳性率分别为19.35%(24/124)和1.85%(1/54),两组有明显的统计学差异(P<0.01).结论 以SCCⅡ为包被抗原检测抗Ⅱ型胶原蛋白抗体可作为判断RA患者病情的一个辅助诊断指标.     

对梭子蟹过敏患者血清特异性IgE抗体针对的过敏原的异质性分析

目的分析梭子蟹过敏患者血清特异性IgE(sIgE)抗体所针对过敏原的异质性。方法提取梭子蟹蛋白质溶液,经酶免疫印迹技术,分析50例梭子蟹过敏患者血清sIgE与梭子蟹蛋白质发生特异性结合的不同区带,并分析个体间的差异。结果针对分子量(Mr)36 000蛋白质的sIgE在患者人群中出现的频率高达80%(40/50),针对Mr 48 000、43 000蛋白质的sIgE分别达62%(31/50)和50%(25/50)。反应条带为3条及3条以上的患者总数占92%(46/50),6条反应条带的患者达30%(15/50)。结论对梭子蟹过敏患者血清中sIgE所针对的过敏原组分存在明显异质性。     

犬关节软骨细胞的体外分离与培养

背景：自1967年Manning等提出的通过胰蛋白酶和细菌胶原酶联合消化法分离软骨细胞以来,软骨细胞的体外分离培养研究较多,但目前尚无统一标准。目的：研究犬关节软骨细胞在体外分离以及培养的条件,寻求体外扩增软骨细胞较简便、可行、高效的实验方法。方法：取3周龄幼犬关节软骨组织,应用胰酶、胶原酶制定8种消化方法获取软骨细胞,对比不同方法所获取细胞数量及细胞成活率,分离细胞进行原代及传代培养,观察各代软骨细胞形态。结果与结论：在体外分离犬关节软骨细胞的各种方法中,单纯应用Ⅱ型胶原酶消化法获得的软骨细胞数最多,细胞成活率最高。软骨细胞可以通过体外培养获得扩增,并且维持良好的细胞形态及表型,但仅限于5代以内。     

胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶消化获取关节软骨细胞

背景:近年来,众多研究欲采用体外分离培养的关节软骨细胞作为修复缺损的关节软骨的种子细胞,然而,获得纯化的具有生物活性的关节软骨细胞较为困难.目的:拟运用胰蛋白酶与Ⅱ型胶原酶联合消化获取关节软骨细胞.方法:从SD大鼠的正常股骨及胫骨关节表面获取关节软骨,先后运用0.25%的胰蛋白酶和0.2%Ⅱ型胶原酶消化,显微镜下见大量细胞游离后,弃去大块的未消化的关节软骨碎片,离心,去上清,PBS洗涤2次后,加入软骨细胞原代培养液进行培养、增殖.应用甲苯胺蓝及苏木精-伊红染色方法检验所得细胞是否为关节软骨细胞.结果与结论:在严格掌握酶的浓度及消化时间的前提下,通过0.25%胰蛋白酶和0.2%Ⅱ型胶原酶联合酶解关节软骨的方法,成功从大鼠股骨及胫骨关节软骨内分离培养出细胞,并经过甲苯胺蓝染色及苏木精-伊红染色证实,所得的细胞为具有生物活性的关节软骨细胞.     

四种不同处理方法体外培养大鼠滑膜细胞

背景：常用的原代滑膜细胞培养方法主要是组织块培养法、酶消化法、机械分散法等。目的：用4种不同方法处理大鼠滑膜组织观察体外培养中滑膜细胞生长情况,探索大鼠膝关节滑膜细胞体外培养的最优方法。方法：将大鼠滑膜细胞组织块组与剪碎组分别按4种不同的方法处理：①不加消化酶消化。②加Ⅱ型胶原酶消化。③加胰蛋白酶消化。④先加Ⅱ型胶原酶消化、再加胰蛋白酶消化。各组处理后分别进行自然沉壁和人工贴壁培养,利用倒置显微镜观察不同方法下滑膜细胞的生长状况。结果与结论：培养9d后,组织剪碎不加消化酶人工贴壁培养的细胞得数为2.03×106,是所有培养方法中细胞的数最多的,细胞活力为95%,细胞活力最强,优于自然贴壁。提示组织的形状、所加入酶的成分以及沉壁的方式均对细胞的生长有重要影响,大鼠膝关节滑膜细胞体外培养的最优方法为组织剪碎不加消化酶人工贴壁培养。     

确证HTLV-Ⅰ/Ⅱ感染的新条带免疫印迹试剂

作者对一种最新开发的抗HTLV-Ⅰ/Ⅱ重组免疫印迹试剂(RIBA)做了评价。此试剂用作筛选试验的确证,具有较强的特异性,解决了献血者中免疫印迹法(WB)不确定结果的问题,且不影响敏感性。 材料与方法 HTLV-Ⅰ/ⅡRIBA 所有标本均用HTLV-Ⅰ/ⅡRIBA检测。RIBA为一种免疫印迹法,用重组抗原和合成肽测定HTLV-Ⅰ/Ⅱ抗体。除弱阳性(1+)和强阳性(3+)人IgG对照条带外,每一试验条含5种HTLV-Ⅰ/Ⅱ抗原带:重组包膜抗原P21e(HTLV-Ⅰ)和758-Ⅱ (HTLV-Ⅱ),HTLV-Ⅰ多肽(HT1L1)和HTLV-Ⅱ多肽(HT2E1)及一条按序列HTLV-Ⅰ和HTLV-Ⅱ混合的重组P24抗原带。RIBA阳性反应如下:2个以     

骨关节炎软骨细胞的体外分离培养

背景:由于体外分离培养骨关节炎患者软骨细胞存在难度,同时软骨组织中因富含大量的基质,且软骨细胞分布于其中的软骨陷窝中,因此与其他细胞相比,软骨细胞的分离更为困难.目的:从骨关节炎行人工膝关节置换者的关节软骨中分离软骨细胞,并改良其酶消化法分离软骨组织,观察软骨细胞的生物学特性.设计、时间及地点:对比观察,实验于2007-04/2008-03在解放军第三军医大学烧伤研究所实验室完成.对象:标本取材于解放军第三军医大学西南医院关节外科中心同期收治的10例人工膝关节置换患者软骨组织(＞3 cm).方法:切取原发性骨关节炎患者关节软骨,将软骨剪成1mm×1 mm×1mm左右的碎块,以Ⅱ型胶原酶顺序消化联合胰蛋白酶消化分离关节软骨细胞,同期对比用Ⅱ型胶原酶加胰蛋白酶消化法消化软骨后的收获细胞数及细胞成活率,分离细胞进行原代和传代培养.主要观察指标:以倒置相差显微镜观察体外培养软骨细胞形态;以甲苯胺蓝染色以及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色进行软骨细胞鉴定;四甲基偶氮唑盐法测定骨关节炎细胞增殖情况.结果:改良的Ⅱ型胶原酶顺序消化联合胰蛋白酶法,对原代关节软骨细胞的分离取得了优良而稳定的效果,与传统的胰蛋白酶消化法相比,收获细胞数为3.72×106,细胞存活率为97.5%,二者相比有显著性差异(P＜0.05).体外培养观察软骨细胞贴壁和生长均较缓慢.原代和传代后细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学和甲苯胺蓝异染反应均较弱.软骨细胞增殖和生长缓慢.结论:Ⅱ型胶原酶顺序消化联合胰蛋白酶分离骨关节炎患者软骨细胞的技术简单且易操作,分离培养的软骨细胞符合骨关节炎时软骨退变的表现,可为骨关节炎的病因研究及软骨细胞移植治疗骨性关节炎提供实验基础.     

江浙蝮蛇毒纤溶酶的生化和药理性质特征

背景：蝰亚科、蝮亚科和眼镜蛇科等蛇毒中存在着一类能直接溶解纤维蛋白（原）的酶，称为纤维蛋白（原）溶酶（纤溶酶），可做为溶解在心肌梗死．中风等期间形成的血栓的抗栓药物。目的：分离纯化江浙蝮蛇毒纤溶酶，并分析其部分生物化学和药理性质。设计：对照观察实验。单位：广西医科大学蛇毒研究所。材料：实验于2003—07／2005-06在广西医科大学蛇毒研究所完成。昆明种小鼠，体质量18&;#177;25g，平均（20&;#177;2）g，鼠龄三四个月，由广西医科大学实验动物中心提供。蛇毒冻干粉由广西医科大学蛇毒研究所提供：方法：应用DEAE Sepharose CL-6B阴离子交换柱和HiPrep Sephacryl S100柱分离纯化纤溶酶，以高效液相色谱仪和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯度、相对分子质量，应用等电聚焦电泳测定等电点，然后测定氩基酸组分及部分药理性质。主要观察指标：纤溶酶相对分子质量、等电点和氨基酸组成．抑制剂对纤溶酶的作用，出血活性实验，纤溶酶对家兔体内抗凝活性的作用。结果：纳入30只鼠和12只免全部进入结果分析．分离得到相对分子质量为59100，等电点为4．98，SDS—PAGE为一条带，高效液相色谱分析为单一峰的纤溶酶。该组分属于金属蛋白酶类。氨基酸组成分析表明它含较多的酸性氩基酸．有微弱的出血毒性。具有较强且持久的溶栓效果。结论：分离纯化得到了一种有微弱出血毒，具有较强抗凝活性的单一组分的酸性金属蛋白酶.     

人脐带来源间充质干细胞分离培养方法的优化

背景：关于人脐带间充质干细胞的分离培养方法不一,如何提高人脐带来源间充质干细胞获得效率的问题尚未解决。目的：优选人脐带来源间充质干细胞制备的消化酶组分。方法：无菌条件下取正常足月剖腹产的脐带近胎儿段,按不同混合酶浓度比值划分为3组,混合酶Ⅰ组成分为0.4%Ⅱ型胶原酶、0.1%胰酶、0.02%EDTA和0.1%透明质酸酶;混合酶Ⅱ组成分为0.1%Ⅱ型胶原酶、0.4%胰酶、0.02%EDTA和0.1%透明质酸酶;混合酶Ⅲ组成分为0.3%Ⅱ型胶原酶、0.1%胰酶、0.02%EDTA、0.1%透明质酸酶和0.1%DNA酶。每组再按消化时间分为1,2,3h3个亚组。最后重悬细胞终体积均定位4mL并计数,采用含血清的DMEM培养液体外培养细胞。结果与结论：采用3种不同混合酶浓度进行消化,发现相同消化时间内,混合酶Ⅲ组消化细胞最多（P〈0.05）。在作用3h时,混合酶Ⅲ组获取的细胞中活细胞比值显著低于混合酶Ⅰ组和混合酶Ⅱ组（P〈0.01）。提示0.3%Ⅱ型胶原酶、0.1%胰酶、0.02%EDTA、0.1%透明质酸酶和0.1%DNA酶混合液消化脐带组织块2h为获取脐带间充质干细胞的最佳条件。     

冬凌草乙素对白血病HL-60细胞的增殖抑制作用

背景:已有研究证明,冬凌草乙素可以通过诱导许多实体肿瘤的细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用,目前,冬凌草乙素对白血病HL-60细胞的作用尚未见资料报道.目的:观察冬凌草乙素对白血病HL-60细胞的体外增殖抑制作用及其机制.方法:以不同浓度的冬凌草乙素(10-50 μmol/L)作用于体外培养的HL-60细胞24,48,72 h,应用MTT法检测细胞生长抑制率,流式细胞术检测细胞周期,免疫印迹法检测Caspase-3及其裂解底物多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)表达水平的变化,并对细胞周期调节蛋白P21、P16的表达水平进行检测.结果与结论:冬凌草乙素可显著抑制细胞的生长及诱导细胞发生凋亡,呈现出明显的量-效与时-效关系.流式细胞术检测结果表明细胞主要被阻滞在G0/G1期,50 μmol/L的冬凌草乙素作用48 h后可以出现典型的亚G1期峰(细胞凋亡峰).免疫印迹法检测结果显示Mr32 000的Caspse-3酶被活化出现Mr20 000亚单位片段,同时Caspse-3的底物PARP被裂解出现Mr89 000的亚单位片段,免疫印迹法检测结果还显示50 μmol/L的冬凌草乙素作用不同时间后,细胞周期调节蛋白P21及P16的表达水平逐渐升高.结果提示冬凌草乙素在体外对HL-60细胞具有显著的细胞周期阻滞作用,并诱导细胞发生凋亡,通过上调细胞周期调节蛋白P21及P16的表达水平及激活Caspse-3可能是冬凌草乙素引起HL-60细胞G0/G1阻滞及诱导细胞发生凋亡的重要作用机制之一.     

可溶性Ⅱ型胶原蛋白提取纯化条件的研究

目的 优化实验条件,建立提取纯化可溶性Ⅱ型胶原蛋白(soluble collagen typeⅡ,SCⅡ)的可靠方法.方法 选择鸡胸箭突软骨为提取原料,用盐酸胍去除蛋白多糖,对胃蛋白酶的消化方式、氯化钠盐析浓度、DEAE阴离子树脂种类进行研究.采用SDS-PAGE、吸收光谱分析、氨基酸成分分析对SCⅡ进行鉴定.结果 4 mol/L盐酸胍能有效去除蛋白多糖,分二步加入胃蛋白酶的消化结果满意,氯化钠盐析浓度为2.4 mol/L时最佳.SDS-PAGE电泳结果显示提取纯化的SCⅡ与Sigma公司的产品一致,SCⅡ最大吸收峰为230 nm,在检出的15种氨基酸中甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸含量最高.结论 改进后的方法具有材料广泛、实验条件简便、结果可靠等优点,适用于科研、临床各种规模SCⅡ的提取.所得产品纯度高、符合Ⅱ型胶原的特征.     

双向电泳联合免疫印迹技术分析日本血吸虫成虫可溶性抗原

目的建立及优化日本血吸虫成虫的蛋白质组学分析方法,寻找可溶性蛋白组分中与免疫应答相关的特异性成虫抗原。方法纯化日本血吸虫成虫可溶性蛋白,应用双向电泳（2D—E）结合免疫印迹技术（Western blotting）,获得相应的电泳图谱和免疫印迹图谱,应用PDQuest 8．0双向电泳图像分析软件对图像进行分析比对,鉴别特异性抗原。结果血吸虫成虫可溶性蛋白经双向电泳后,考马斯亮蓝G250染色,电泳图谱显示约152个主要蛋白斑点。分子量（Mr）分布约为14～114kD;等电点（pI）主要集中在4．9～9．5。进一步的Western blotting鉴定结果显示：实验组图像可见的抗原抗体反应点数目约57个,对照组为0。结论双向电泳联合免疫印迹技术是成功分析蛋白质组学的技术关键,该技术为寻找日本血吸虫特异性抗原开辟了新途径。     

胃蛋白酶原亚群测定与萎缩性胃炎诊断的相关性分析

目的：探讨血清中胃蛋白酶原（PG ）亚群水平与萎缩性胃炎临床诊断之间的关系。方法选择2011年1月至2013年6月来该院就诊的萎缩性胃炎76例（萎缩性胃炎组）、胃癌44例（胃癌组）、健康体检50例（健康对照组）,三组研究对象均采用胶乳增强免疫比浊法测定血清中胃蛋白酶原Ⅰ（PGⅠ）和胃蛋白酶原Ⅱ（PGⅡ）的水平,探讨血清中PG亚群水平和萎缩性胃炎之间的关系。结果三组患者的血清PGⅠ、PGⅠ/PGⅡ水平相比较,差异有统计学意义（P＜0．05）;三组患者的血清PGⅡ水平相比较,差异无统计学意义（P＞0．05）。萎缩性胃炎阳性检出限的判定为当PGⅠ≤80μg/L时,检出萎缩性胃炎的灵敏度最高位;当PGⅠ/PGⅡ≤6时萎缩性胃炎阳性检出情况较好。结论血清中PGⅠ和PGⅠ/PGⅡ水平下降,其与萎缩性胃炎的发病有着密切联系,这一血清检验学指标为正确诊断萎缩性胃炎提供重要的血清学依据,对临床中及早筛查胃癌患者有着重要的意义。     

Ⅱ型糖尿病患者血浆抵抗素、内皮素、超敏C-反应蛋白与血管性病变的相关性探讨

目的 探讨血浆抵抗素、内皮素(ET)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)与Ⅱ型糖尿病患者发生血管性病变的关系.方法 用放射免疫比浊法测定血浆ET;于OLYMPUSAU400全自动生化分析仪,采用颗粒增强免疫透射比浊法测定hs-CRP;酶联免疫法测定血浆抵抗素.结果 Ⅱ型糖尿病患者合并血管性病变与血浆抵抗素、ET、hs-CRP水平呈正相关(P<0.05);结论血浆抵抗素、ET、hs-CRP在Ⅱ型糖尿病患者合并血管性病变中起重要作用.     

应用流式细胞术测定CD24表达鉴定人髓核细胞

背景：CD24是成熟髓核细胞表面表达的特异性分子,测定CD24的表达是否可以作为鉴定髓核细胞的一种方法？目的：验证流式细胞仪测定髓核细胞CD24表达鉴定髓核细胞的方法。方法：采用酶消化法分离培养人髓核细胞,取生长旺盛的第2代人髓核细胞爬片进行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,RT-PCR测定Ⅱ型胶原及SOX9的表达,流式细胞仪检测其CD24阳性表达率,分析来自同一批细胞的免疫组织化学染色、RT-PCR结果与CD24阳性率的相关性。结果与结论：体外分离培养的7例第2代髓核细胞爬片Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性,RT-PCR结果阳性,流式细胞仪测定CD24其阳性率均为50%以上,髓核细胞分泌胞外基质Ⅱ型胶原与SOX9的表达与CD24阳性率结果有相关性。提示采用流式细胞仪测定CD24表达可以快速、简便地鉴定髓核细胞。     

大鼠心肌成纤维细胞组织金属蛋白酶抑制剂mRNA水平检测

目的通过建立多重反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,旨在测定大鼠心肌成纤维细胞组织金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)、组织金属蛋白酶抑制剂-2(TIMP-2)的mRNA水平。方法采用胶原酶-胰蛋白酶消化法培养成年雌性SD大鼠的心肌成纤维细胞,提取细胞总RNA并进行反转录反应。自行设计大鼠TIMP-1,TIMP-2和内参照GAPDH的PCR引物序列,进行多重PCR反应,PCR产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳分析目的基因片段。结果20g/L琼脂糖凝胶电泳在同一条泳道显示TIMP-1,TIMP-2和GAPDH3条目的DNA条带,表明成功地同时扩增了TIMP-1,TIMP-2和GAPDH基因。结论采用多重RT-PCR方法,测定了大鼠心肌成纤维细胞TIMP-1,TIMP-2mRNA水平,此方法为研究高血压病心肌纤维化提供了可靠手段。     

血管平滑肌细胞功能调节中血管紧张素1型受体表达和生物学作用的变化

目的：探讨血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)转染表达血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)2型受体(angiotensin Ⅱ type 2 receptor，AT2R)后其1型受体(angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R)表达所受的影响。方法：用同源重组方法构建带AT2R基因的重组复制缺陷型腺病毒载体(AdCMV—AT2R)，体外转染VSMC，分别用流式细胞仪检测AT1R、AT2R细胞转染表达率、用免疫组织化学法和免疫荧光法检测其膜表达、以反转录聚合酶链式反应法(RT—PCR)和蛋白印迹法检测其mRNA和蛋白表达。结果：AdCMV—AT2R转染后，随着转染表达时间延长，AT2R细胞表达率呈显著增加趋势，48h最高表达率达89．51％，AngⅡ作用与否及不同浓度AngⅡ作用对AT2R表达无显著影响。而转染前后AT1R表达相对较稳定，受不同浓度AngⅡ作用，其表达明显呈增加趋势。AT2R峰值表达时，免疫组织化学法和免疫荧光法检测其膜表达结果也提示AT2R表达随转染表达时间延长显著增加，转染前后AT1R表达无明显变化，在一定浓度范围内，AngⅡ刺激对AT2R表达无显著影响，却显著增加AT1R的膜表达。RT-PCR法和蛋白印迹法检测AT1R和AT2R的mRNA和蛋白表达结果与其细胞表达率和膜表达的检测结果相一致。结论：AT2R转染表达并发挥其生物学作用时，对ATIR的表达无明显影响，VSMC转染表达AT2R后，AngⅡ刺激仍可使AT1R表达增加，提示AT1R和AT2R之间不存在表达方面此消彼长的关系，因而，AT2R转染表达有助于对VSMC功能的调节。