可溶性鸡Ⅱ型胶原蛋白的理化特性研究

摘要：目的：研究可溶性鸡Ⅱ型胶原蛋白(SCCⅡ）的物理化学特性。 方法：用光谱法测定吸收峰和等电点,HPLC法检测氨基酸组成,乌氏黏度计测定不同条件下溶液的增比黏度。用SDS-PAGE测定相对分子量（Mr）,结合免疫印迹法分析胃蛋白酶、胰蛋白酶、α-糜蛋白酶和Ⅱ型胶原酶作用于SCCⅡ和热变性后的SCCⅡ（D-SCCⅡ）的酶解产物。 结果：SDSPAGE显示SCCⅡ亚基的Mr约为120×10³,能与抗SCCⅡ抗体反应;D-SCCⅡ含有10多条免疫印迹呈阳性反应的片段。SCCⅡ溶液的最大吸收峰为230 nm,等电点pH约6.25。氨基酸组成中,Gly、Pro、Glu和Ala含量高,芳香族氨基酸低。SCCⅡ溶液的增比黏度随浓度的增加而增加,在25~45 ℃范围内随着温度的升高逐渐下降。在胃蛋白酶和糜蛋白酶作用下SCCⅡ的电泳和免疫印迹图谱无变化,Ⅱ型胶原酶可使SCCⅡ快速水解,胰蛋白酶作用后出现10条免疫印迹阳性条带;D-SCCⅡ经酶解后免疫印迹无阳性条带。 结论:SCCⅡ具有独特的物理化学性质,对消化酶有一定抵抗作用,胰蛋白酶作用后可出现多条活性片段。     

软骨损伤后Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白的表达

背景：目前Ⅰ型胶原蛋白与骨关节炎间的关系尚未被完全揭示,Ⅰ型胶原蛋白的表达模式亦未知,缺乏相关的研究来探讨上述问题。目的：观察软骨退变过程中Ⅰ型胶原蛋白表达的模式,为进一步研究Ⅰ型胶原蛋白与骨关节炎间的关系提供参考。方法：10只新西兰大白兔,用手术刀片在兔左下肢股骨滑车凹造一约5 mm长的纵向软骨损伤制备软骨损伤模型。造模后2,6周分别处死5只动物,取软骨损伤部位后制作石蜡切片,免疫组织化学检测损伤周围Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白的表达情况,番红O-快绿染色检测损伤周围软骨的退变情况。结果与结论：免疫组织化学示：造模后2周后即可在软骨损伤周围检测到少量Ⅰ型胶原蛋白,6周后软骨损伤周围的Ⅰ型胶原蛋白有所增加,Ⅱ型胶原蛋白则未见明显改变。番红O-快绿染色示：2,6周软骨损伤周围均未见明显退变。结果表明,Ⅰ型胶原蛋白在骨关节炎早期即有表达,在软骨退变过程中表达逐渐增加,提示与骨关节炎的发生密切相关。     

通痹灵对Ⅱ型胶原蛋白诱导性大鼠模型润膜细胞凋亡的影响

目的：研究通痹灵对Ⅱ型胶原蛋白诱导性大鼠关节模型（CIA）滑膜细胞凋亡的影响。方法：原位细胞凋亡检测试剂盒检测各组原代大鼠滑膜细胞凋亡的水平。结果：通痹灵组CIA大鼠滑膜细胞的凋亡数明显增加。结论：通痹灵治疗类风湿性关节炎的机制可能与诱导滑膜细胞凋亡有关。     

血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体检测法的建立与应用

目的 建立血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体的ELISA法,探讨其在类风湿关节炎(RA)患者中的应用价值.方法 以自提可溶性鸡Ⅱ型胶原蛋白(soluble chicken collagen type Ⅱ,SCC Ⅱ)作为包被抗原,优化实验条件,建立抗Ⅱ型胶原蛋白抗体间接ELISA法.对124例RA病人和54例健康人血清抗II型胶原蛋白抗体进行检测.结果 血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体的检测条件为:SCCⅡ包被浓度为20 μg/ml;以含10%羊血清的缓冲液进行封闭、稀释血清和酶标抗体;采用双波长(450nm/630 nm)进行测定.RA患者和健康人血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体阳性率分别为19.35%(24/124)和1.85%(1/54),两组有明显的统计学差异(P<0.01).结论 以SCCⅡ为包被抗原检测抗Ⅱ型胶原蛋白抗体可作为判断RA患者病情的一个辅助诊断指标.     

复方丹参对Ⅱ型胶原蛋白诱导性关节炎大鼠滑膜细胞白介素—6mRNA表达的影响

目的：研究复方丹参对Ⅱ型胶原蛋白诱导性关节炎模型（CIA）滑膜细胞白介素－6mRNA（IL－6mRNA）表达的影响。方法：用Ⅱ型胶原蛋白诱导大关节类型，以逆转录－多聚酶链反应（RT－PCR）半定量法测定模型滑膜细胞IL－6mRNA的表达，以及复方丹参对其的影响。结果：复方丹参可以明显下降CIA大鼠滑膜细胞IL－6mRNA表达的水平。结论：复方丹参治疗类风湿性关节炎的机制可能与下调滑膜细胞IL－6mRNA的表达水平有关。     

类风湿性关节炎患者血清Ⅱ型胶原抗体检测

用本室提取纯化的Ⅱ型胶原（ＣⅡ）作为包被抗原，建立了ＥＬＩＳＡ试验最佳条件。采用ＥＬＩＳＡ法对３６例类风湿性关节炎（ＲＡ）、３９例其他关节痛患者及４０例正常人进行了血清ＣⅡ抗全检测。结果表明：ＲＡ患者有较高的ＣⅡ抗体检出率，阳性率为３３．３３％；其他关节痛患者及正常大ＣⅡ抗体检测结果均为阴性。结果提示，ＣⅡ在ＲＡ发病中具有重要作用，ＣⅡ抗体检测可以作为观察ＲＡ对ＣⅡ产生自身免疫及研究相关病理机制的     

类风湿性关节炎患者抗胶原蛋白Ⅱ抗体及其自身反应性T淋巴细胞的检测

目的:分析类风湿性关节炎(RA)患者T淋巴细胞免疫应答及抗胶原蛋白Ⅱ(CⅡ)抗体的异常表现。方法:应用流式细胞仪分析22例RA及6例骨关节炎(OA)患者外周血和关节滑膜液(SF)中T淋巴细胞免疫表型和趋化因子受体的表达。选用HSP-65和胶原蛋白Ⅱ(CⅡ)抗原诱导和分析患者自身反应性T淋巴细胞克隆频率,采用经典的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测患者外周血和SF中抗CⅡ抗体以及IFN-γ、IL-10、IL-4和IL-12的含量。结果:RA患者关节SF中CD4+/CD8+T淋巴细胞的比值为1.09,显著低于外周血中CD4+/CD8+T淋巴细胞比值(2.02);SF中CD3+/CD25+双阳性的活化T淋巴细胞占(15.9±9.6)%。SF中T淋巴细胞表面趋化因子受体CCR5表达较低,与外周血相比无统计学意义,但趋化因子受体CD25+/CXCR3+表达量较高,为(16.0±4.0)%,远远高于外周血T淋巴细胞[仅为(0.5±0.3)%](P<0.01)。ELISA检测结果表明RA患者关节SF中抗CⅡ抗体阳性率明显高于其血清以及OA患者SF和血清;RA患者SF中IFN-γ、IL-12的含量高于外周血。来自RA患者病灶关节SF单个核细胞(SFMC)较外周血单个核细胞(PBMC)对HSP-65抗原和CⅡ的诱导具有更高的自身反应性T淋巴细胞应答频率(分别为8.5×10-6和11.5×10-6)。结论:RA患者关节SF中存在高活化状态的T淋巴细胞,其对CⅡ的高克隆反应频率以及SF中高表达抗CⅡ抗体,均提示自身反应性T淋巴细胞的浸润是造成患者病灶区组织损伤的关键因素。     

类风湿性关节炎患者抗Ⅱ型胶原抗体及血清可溶性CD137的水平

近年来有报道抗天然Ⅱ型胶原(抗NaⅡ)与类风湿性关节炎(RA)发病有关。也发现可溶性CD137(sCD137)在RA患者血清中水平升高。本研究检测抗NaⅡ与sCD137水平，旨在初步了解其与RA发病的关系。     

骨质疏松大鼠膝关节组织总胶原、Ⅰ型及Ⅱ型胶原蛋白的含量变化

背景：目前研究认为胶原蛋白在骨细胞的增殖与分化、骨质的形成和吸收、骨基质矿化等过程中起着非常重要的作用。目的：观察骨质疏松模型大鼠膝关节组织总胶原、Ⅰ型及Ⅱ型胶原蛋白含量变化。方法：SD雌性大鼠40只随机分为实验组和对照组,实验组大鼠行双侧卵巢切除16周后,取膝关节软骨和交叉韧带,采用微量羟脯氨酸测定法及酶联免疫吸附法测定大鼠膝关节软骨及前交叉韧带组织总胶原、Ⅰ型及Ⅱ型胶原蛋白含量。结果与结论：骨质疏松膝关节模型大鼠膝关节软骨、前交叉韧带总胶原、Ⅰ型及Ⅱ型胶原蛋白含量明显下降（P〈0.05）,Ⅰ型/Ⅱ型胶原比值也显著降低（P〈0.05）,提示骨质疏松可引起膝关节内组织总胶原、Ⅰ型及Ⅱ型胶原含量及其比值改变,与膝关节骨性关节炎的发生密切相关。     

骨质疏松大鼠膝关节组织总胶原、Ⅰ型及Ⅱ型胶原蛋白的含量变化

背景:目前研究认为胶原蛋白在骨细胞的增殖与分化、骨质的形成和吸收、骨基质矿化等过程中起着非常重要的作用.目的:观察骨质疏松模型大鼠膝关节组织总胶原、Ⅰ型及Ⅱ型胶原蛋白含量变化.方法:SD雌性大鼠40只随机分为实验组和对照组,实验组大鼠行双侧卵巢切除16周后,取膝关节软骨和交叉韧带,采用微量羟脯氨酸测定法及酶联免疫吸附法测定大鼠膝关节软骨及前交叉韧带组织总胶原、Ⅰ型及Ⅱ型胶原蛋白含量.结果与结论:骨质疏松膝关节模型大鼠膝关节软骨、前交叉韧带总胶原、Ⅰ型及Ⅱ型胶原蛋白含量明显下降(P < 0.05),Ⅰ型/Ⅱ型胶原比值也显著降低(P < 0.05),提示骨质疏松可引起膝关节内组织总胶原、Ⅰ型及Ⅱ型胶原含量及其比值改变,与膝关节骨性关节炎的发生密切相关.     

I、II型胶原蛋白对人软骨细胞生物学特性的影响

背景：实验证明胶原蛋白底物具有刺激成软骨的作用,但关于不同类型胶原蛋白刺激成软骨作用的能力仍存在争议。 目的：观察I、Ⅱ型胶原蛋白对体外培养人软骨细胞生物学特性的影响。 方法：将P3代人软骨细胞分别加入普通培养板、I型胶原蛋白包被培养板、Ⅱ型胶原蛋白包被培养板继续培养。培养10d内,MTT法绘制细胞生长曲线;培养28d后,采用ELISA法、聚合酶链反应、二甲基亚甲基蓝比色等方法检测3种培养板中软骨细胞分泌I胶原蛋白、Ⅱ型胶原蛋白及糖胺多糖的量。 结果与结论：Ⅱ型胶原蛋白包被培养板中软骨细胞数量最多,增殖速度为I型胶原蛋白包被培养板的2倍、普通培养板的5倍。Ⅱ型胶原蛋白包被培养板中软骨细胞分泌I型胶原蛋白最少,与普通培养板板检测结果差异有显著性意义（P〈0．01）,与I型胶原蛋白包被培养板检测结果差异无显著性意义;Ⅱ型胶原蛋白包被培养板中软骨细胞分泌Ⅱ型胶原蛋白、糖胺多糖最多,与其他两种培养板检测结果差异有显著性意义（P〈0．01）。表明胶原蛋白包被培养板培养软骨细胞优于普通培养板,其中Ⅱ型胶原蛋白包被培养板在培养软骨细胞时更能维持细胞形态,延长去分化现象出现的时间,更利于细胞再分化。     

口服鸡Ⅱ型胶原诱导实验性关节炎大鼠产生免疫耐受

用本室制备纯化的鸡Ⅱ型胶原诱导胶原性关节炎及佐剂性关节炎大鼠产生了明显的口服免疫耐受。实验表明；大鼠在致炎前经灌胃给予ＣＣⅡ，可明显推迟ＣＩＡ和ＡＡ的发闰时间，降低ＣＩＡ和ＡＡ的发病率，并使关节炎表现明显减轻，ＣＩＡ组ＣＣⅡ的剂量以０．０３，０．３０及３．００ｍｇ／ｋｇ作用显著，ＡＡ组的剂量则以０．０１和０．０３ｍｇ／ｋｇ作用显著。     

京尼平苷干预体外培养大鼠软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白的合成

背景：近年来的研究表明,中药栀子可能具有活化软骨细胞的功能,而京尼平苷是栀子中重要成分之一。目的：观察京尼平苷对体外培养大鼠膝关节软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白合成的影响。方法：体外分离培养大鼠膝关节软骨细胞,分别应用25,50及100 mmol/L京尼平苷干预,并设置正常对照组。RT-PCR和Western blot法观察京尼平苷对各组细胞Ⅱ型胶原mRNA和蛋白表达的影响。结果与结论：RT-PCR和Western blot法检测结果显示,与正常对照组相比,25,50及100 mmol/L京尼平苷干预可以明显促进Ⅱ型胶原mRNA及蛋白的表达（P 〈0.01）。结果证实,京尼平苷可以促进大鼠膝关节软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白的合成。     

自身免疫疫患者血清抗Ⅱ型胶原抗体的检测意义

胶原是动物体内含量最丰富的蛋白质 ,占人体蛋白总量的 2 5 33% ,广泛分布于细胞外间质 ,构成组织器官的支架。人的关节透明软骨含有不同类型胶原 ,其中以天然Ⅱ型胶原(ｎａｔｉｖｅｔｙｐｅⅡｃｏｌｌａｇｅｎ ,ＮａｔⅡ )含量丰富。近年来有关报道认为抗ＮａｔⅡ与类风湿性关节炎 (ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ,ＲＡ)发病有关。但亦有文献报道 ,抗ＮａｔⅡ在ＲＡ患者血清中的阳性率较低 ,与患者的病情活动和临床表现无关 ,且在其他疾病中也有一定的阳性率[1] 。本文采用酶联免疫吸附试验 (ＥＬＩＳＡ)检测自身免疫病患者血清中抗ＮａｔⅡＩｇＧ…     

不同强度跑台运动对大鼠膝关节软骨Ⅱ型胶原纤维的影响

目的探讨不同强度跑台训练对大鼠膝关节软骨胶原纤维形态学及基因表达的影响。 方法采用随机数字表法将48只雄性SD成年大鼠分为对照组、低强度运动组、中强度运动组及高强度运动组。3个运动组大鼠分别进行低、中、高强度跑台运动。于实验进行8周后处死所有实验动物,取膝关节软骨标本行天狼星红-饱和苦味酸染色观察胶原纤维排列情况,采用免疫组化技术检测Ⅱ型胶原（Col2）含量;另外本研究同时采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测软骨biglycan（BGN）、fibromodulin（FMOD）及Ⅱ型胶原（Col2）mRNA表达。 结果对照组膝关节软骨胶原纤维排列规则;低、中强度运动组与对照组间无明显差异;而高强度运动组胶原排列不规则、细纤维数量增多;高强度运动组Ⅱ型胶原含量显著低于对照组。与对照组比较,低强度运动组软骨细胞Col2 mRNA表达明显增高,高强度运动组BGN mRNA表达明显增高。 结论低、中强度运动有助于维持关节软骨正常结构及功能;高强度运动能促使关节软骨Ⅱ型胶原纤维减少、排列紊乱,但软骨自我修复可能同时存在。     

猪软骨Ⅱ型胶原的生物相容性研究

目的对所提取的猪软骨II型胶原进行生物相容性的研究,评价其作为医用生物材料的安全性。方法通过急性毒性试验、刺激性试验、过敏性试验、溶血性试验及体外软骨细胞相容性等试验进行检测。结果急性毒性试验、刺激性试验、过敏性试验和溶血性试验的结果均呈阴性。体外软骨细胞相容性试验:软骨细胞能增殖及传代,且前6代的细胞基本都能呈原代的形态特点,随着培养时间的延长和代数的增加,成纤维状细胞才出现并逐渐增多。而且原代培养的软骨细胞有大量糖胺多糖合成,传代的代数越多,软骨细胞合成糖胺多糖的能力也愈弱。结论猪软骨Ⅱ型胶原具有良好的生物相容性,是可以安全使用的医用生物材料。     

猪软骨Ⅱ型胶原的生物相容性研究

目的：对所提取的猪软骨Ⅱ型胶原进行生物相容性的研究，评价其作为医用生物材料的安全性，方法：通过急性毒性试验，刺激性试验，过敏性试验，溶血性试验及体外软骨细胞相容性等试验进行检测。结果：急性毒性试验，刺激性试验，过敏性试验和溶血性试验的结果均呈阴性，体外软骨细胞相容性试验。软骨细胞能增殖及传代，且前6代的细胞基因都能呈原代的形态特点，随着培养时间的延长和代数的增加，成纤维状细胞才出现并逐渐增多，而且原代培养的软骨细胞有大量糖胺多糖合成，传代的代数越多，软骨细胞合成糖胺多糖的能力也愈弱。结论：猪软骨Ⅱ型胶原具有良好的生物相容性，是可以安全使用的医用生物材料。     

通痹灵对Ⅱ型胶原蛋白诱导性大鼠模型滑膜细胞凋亡的影响

目的研究通痹灵对Ⅱ型胶原蛋白诱导性大鼠关节模型(CIA)滑膜细胞凋亡的影响。方法原位细胞凋亡检测试剂盒检测各组原代大鼠滑膜细胞凋亡的水平。结果通痹灵组CIA大鼠滑膜细胞的凋亡数明显增加。结论通痹灵治疗类风湿性关节炎的机制可能与诱导滑膜细胞凋亡有关。     

自身免疫病患者血清抗Ⅱ型胶原抗体的检测意义

胶原是动物体内含量最丰富的蛋白质,占人体蛋白总量的25.33%,广泛分布于细胞外间质,构成组织器官的支架.人的关节透明软骨含有不同类型胶原,其中以天然Ⅱ型胶原(native type Ⅱ collagen,Nat Ⅱ)含量丰富.近年来有关报道认为抗NatⅡ与类风湿性关节炎(rheumatoid,RA)发病有关.但亦有文献报道,抗NatⅡ在RA患者血清中的阳性率较低,与患者的病情活动和临床表现无关,且在其他疾病中也有一定的阳性率[1].本文采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测自身免疫病患者血清中抗NatⅡ IgG,旨在讨论IgG类抗NatⅡ与自身免疫病尤其是系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)、RA的关系.