类志贺邻单胞菌实时荧光TaqMan PCR 快速检测体系的建立

目的 建立针对类志贺邻单胞菌的高灵敏、高特异的实时荧光TaqMan聚合酶链式反应(PCR)快速检测体系.方法 根据类志贺邻单胞菌23S rRNA基因的一段特异性序列设计引物及TaqMan探针,利用实时荧光PCR检测平台探讨该检测体系的灵敏度;用30种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌评价该检测体系的特异性.结果...     

粪肠球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

目的 建立用于检测粪肠球菌的TaqMan实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative-Polymerase Chain Reaction,FQ-PCR)方法。 方法 根据粪肠球菌的d-丙氨酸聚连接酶(ddl)基因设计TaqMan FQ-PCR的引物及探针,并使用39种常见致病菌和条件致病菌检测其特异性。将目的基因克隆到质粒中,制作标准曲线,确定方法的检测下限。制备血液模拟标本,直接提取核酸进行检测,探索临床应用的可能。 结果 在特异性评价实验中,除阳性对照外其余样本均未出现特异性扩增曲线。建立粪肠球菌TaqMan FQ-PCR方法的标准曲线,确定该方法的检测下限为20 copy/管。通过对粪肠球菌血液模拟标本的检测发现,本方法对模拟标本的检测灵敏度为3.9×103 cfu/ml。在稳定性评价中,对含菌量为3.9×108、3.9×106和3.9×104cfu/ml的血液模拟标本重复检测10次,结果显示扩增反应Ct值的变异系数(CV)为0.99%~1.84%。 结论 本研究建立了适用于临床标本检测的粪肠球菌TaqMan FQ-PCR方法。     

阪崎肠杆菌实时荧光TaqMan PCR 检测方法的研究

目的 建立阪崎肠杆菌的TaqMan PCR检测方法。 方法 将阪崎肠杆菌的菌悬液连续10倍稀释后与健康人新鲜粪便混匀,制备成1.2100 ~ 1.2108 cfu/ml梯度浓度的粪便模拟标本并提取DNA,用以评价阪崎肠杆菌实时荧光TaqMan PCR法对临床模拟标本检测的灵敏度、特异性和稳定性。 结果 实时荧光TaqMan PCR法对阪崎肠杆菌粪便模拟标本的检测灵敏度为1.2103 cfu/ml; 其线性检测范围为:1.2103 ~ 1.2108 cfu/ml;在稳定性评价中,对含菌量为1.2108、1.2106和1.2104 cfu/ml的粪便模拟标本进行实时荧光TaqMan PCR法重复检测10次,结果显示扩增反应Ct 值的变异系数(CV)为0.65%~1.47%;在特异性评价中,除了阳性对照其余样本均未见特异性扩增曲线。 结论 本研究建立了阪崎肠杆菌实时荧光TaqMan PCR法。     

一种鉴别与大肠埃希菌O157血清凝集的弗氏枸橼酸杆菌的PCR方法

目的利用基于O抗原翻转酶wzx基因的PCR方法,鉴别与大肠埃希菌O157血清凝集的弗氏枸橼酸杆菌和O157大肠埃希菌。方法用微生物鉴定仪对细菌进行生化鉴定,与O157血清凝集,同时扩增wzx基因。结果25株与大肠埃希菌O157血清凝集的弗氏枸橼酸杆菌及1株不与大肠埃希菌O157血清凝集的弗氏枸橼酸杆菌wzx基因扩增为阳性,8株与O157血清不凝集的弗氏枸橼酸杆菌wzx基因扩增为阴性,20株O157∶H7大肠埃希菌wzx基因扩增为阴性。结论对于可与O157血清发生强凝集的弗氏枸橼酸杆菌,基于O抗原翻转酶wzx基因的PCR方法是一种有效的快速鉴别方法。     

建立检测产气肠杆菌的TaqMan荧光定量PCR和普通PCR方法

目的 建立敏感、特异的普通聚合酶链反应(PCR)方法和TaqMan 荧光定量PCR方法对产气肠杆菌进行快速检测。方法 以产气肠杆菌组氨酸脱氢酶基因(hdc)为靶基因设计引物以及TaqMan FAM探针,建立对产气肠杆菌进行检测的普通PCR方法和TaqMan 荧光定量PCR方法,并评价该方法的特异性、灵敏性和稳定性。结果 普通PCR和TaqMan 荧光定量PCR方法均能对产气肠杆菌进行特异检测;普通PCR方法对质粒标准品和粪便模拟标本的检测下限分别为 100 copies/l和1.0105 cfu/g,TaqMan 荧光定量PCR方法对质粒标准品和粪便模拟标本的检测下限分别为33 copies/l和1.0104 cfu/g;TaqMan 荧光定量PCR方法对质粒标准品和粪便模拟标本检测的扩增曲线良好;在稳定性评价试验中,普通PCR方法的重复性良好,TaqMan 荧光定量PCR方法对质粒标准品检测Ct值的组内差异为0.15%~0.98%,组间差异为0.55%~1.63%。结论 本研究建立的检测产气肠杆菌的普通PCR方法和TaqMan 荧光PCR方法特异性好、灵敏度高,能够用于产气肠杆菌的快速检测。     

潜在致病性的弗氏枸橼酸杆菌的筛查

目的 筛查具有潜在致病性的弗氏枸橼酸杆菌。方法 对从河南省睢县分离到的36株弗氏枸橼酸杆菌进行黏附HEp-2细胞的检测,以及与HEp-2细胞(MOI: 100)作用10 h后的乳酸脱氢酶(LDH)释放情况分析。同时比较弗氏枸橼酸杆菌CF74(Citrobacter freundii 74)、CF72(Citrobacter freundii 72)、肠聚集性大肠埃希菌(Enteroaggregative E. coli,EAEC)、肠致病性大肠埃希菌(Enteropathogenic E. coli,EPEC)2348/69和HB101的黏附和细胞毒性差异。结果 16株弗氏枸橼酸杆菌几乎没有黏附性,黏附指数1;18株弗氏枸橼酸杆菌具有中等强度的黏附性,黏附指数100;2株弗氏枸橼酸杆菌CF74和CF65(Citrobacter freundii 65)具有强的黏附性。与HEp-2细胞作用10 h后,除了CF74(24.4%),其余的35株弗氏枸橼酸杆菌具有低的LDH释放量,LDH释放量与阴性对照HB101(5.02%)相似。说明除了CF74,其余的弗氏枸橼酸杆菌不具有细胞毒性。CF74具有和EAEC042一样的聚集性黏附类型,并且 CF74引起的LDH释放率明显高于CF72、2348/69和HB101(P0.01)而低于EAEC17-2。结论 作为潜在的致病菌,CF74具有强的黏附性和细胞毒性。     

炭疽芽孢杆菌特异性基因序列双重TaqMan聚合酶链反应快速检测体系的建立

目的 以炭疽芽孢杆菌的主基因和致病毒素基因pagA特异性序列为检测标志，建立高敏感、高特异的荧光双重实时TaqMan聚合酶链反应快速检测体系。方法 根据炭疽杆菌主基因组特异性序列（Gs）和特异的毒力岛pagA基因序列（Pag）设计引物及探针，通过构建目的质粒获得标准模板，利用TaqMan标记探针和便携式Smartcycle实时聚合酶链反应检测平台探讨该检测体系的检测敏感性和特异性。结果该体系炭疽芽孢杆菌的检测敏感度为10^2拷贝每反应体系，与其他蜡样杆菌群细菌未出现非特异性扩增，具有较高的特异性。整个反应在1h内完成，适合于实验室或野外环境下炭疽芽孢杆菌的快速检测。结论 本研究建立的双重TaqMan实时聚合酶链反应检测体系可作为炭疽芽孢杆菌快速、准确、特异、敏感的检测手段。     

双重实时荧光定量PCR检测产志贺毒素大肠埃希菌stx1和stx2基因

摘要：目的：建立一种检测产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)的双重实时荧光定量PCR法。 方法：根据stx1和stx2及其变种序列,设计PCR引物和TaqMan探针,建立双重实时荧光定量PCR检测体系,进行灵敏度和特异性评价,并对STEC模拟粪便标本及动物粪便标本进行检测分析。 结果：双重实时荧光定量PCR检测含志贺毒素基因重组质粒的灵敏度为1×10² copies/反应体系;该法对17种常见肠道病原菌均无特异性扩增,对47株不同志贺毒素类型及变种的已知STEC菌株的检测特异性为100%;对模拟粪便标本的检测下限为3.55×10³ CFU/g;对动物粪便标本的检测阳性率高于细菌分离培养。 结论: 建立的双重实时荧光定量PCR可作为不同志贺毒素类型及变种的STEC菌株的快速鉴定方法,亦可用于人感染性腹泻标本和动物粪便标本STEC感染的快速筛查。     

枸橼酸杆菌感染

近年来枸橼酸杆菌感染的报告日益增多。该菌可致多种感染,但以医院内感染最为多见,是当前临床上的一个突出问题,应引起足够重视。本文结合近年来有关资料,对枸橼杆菌感染概述如下。一、病原学枸橼酸杆菌为革兰阴性杆菌,属肠道杆菌埃希氏菌族。可分为弗劳地、中间型及异型三个种。可能为肠道正常菌群,为条件致病菌,在一定条件下可致病。该菌能在无机培养     

多重PCR结合基因芯片技术检测11种致病菌方法的建立

目的建立一种运用多重PCR方法结合基因芯片技术快速、准确检测11种常见致病菌的方法。方法筛选志贺氏菌、肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157、副溶血性弧菌、普通变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、产气荚膜梭菌、空肠弯曲菌的特异基因作为目的基因。设计相应的引物及探针,进行多重PCR扩增,制备寡核苷酸芯片。将多重PCR扩增产物与带有11种特异探针的基因芯片杂交。用扫描仪扫描,判定细菌种类。结果该基因芯片可特异性地检测11种致病菌,具有良好的特异性,基因组DNA检测灵敏度可达2×10-3ng。结论多重PCR结合基因芯片技术检测11种不同致病菌的方法特异性好,灵敏度高,具有较好的实用性。     

TaqMan-MGB探针实时荧光定量-聚合酶链反应检测肺炎支原体方法的建立

目的 建立敏感、特异的TaqMan-MGB探针实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time PCR)快速检测方法,为临床标本中肺炎支原体快速检测提供技术支持。方法 选取肺炎支原体重复序列RepMP23中保守区域设计、合成特异性扩增引物和TaqMan-MGB探针,建立并优化real-time PCR检测方法。对优化后的方法使用标准浓度核酸进行扩增效率、灵敏度及特异度评价,并与已报道的肺炎支原体荧光PCR方法进行比较。结果 本研究建立的TaqMan-MGB探针荧光PCR方法对肺炎支原体的检测限为0.2 cfu,比普通TaqMan real-time PCR检测限(3～5 cfu)提高了一个数量级。其检测标准曲线的循环阈值(Ct) 与模板拷贝数呈良好的线性关系(R2=0.999)。用该方法扩增23种呼吸道常见病原菌染色体及人类染色体,结果均为阴性,特异度为100%。结论 TaqMan-MGB探针real-time PCR方法可快速、灵敏、特异地检测肺炎支原体,有很好的应用前景与价值。     

利用双重TaqMan荧光定量聚合酶链反应技术鉴别诊断粪便标本中的伤寒和甲型副伤寒沙门菌

目的建立针对粪便标本中伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌的检测方法,评价该方法的特异性、敏感性及检测下限,以提高感染人群粪便标本中两种病原的检出效率。方法分别根据伤寒沙门菌特异基因STY1633及甲型副伤寒沙门菌特异基因SPA4289设计特异性引物及探针,优化反应条件,建立双重TaqMan荧光定量聚合酶链反应(dual taqman fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)体系。利用44株伤寒沙门菌、30株甲型副伤寒沙门菌、88株其他血清型沙门菌染色体DNA及引起发热的其他病原菌,评价该方法的特异性和灵敏性,并对伤寒沙门菌及甲型副伤寒沙门菌的粪便模拟标本进行检测下限评价,同时利用10份伤寒患者、20份甲型副伤寒患者及48份其他病原所致发热和/或伴腹泻的患者粪便标本进行特异性、敏感性验证。结果利用本方法检测的伤寒、副伤寒沙门菌纯菌及伤寒、甲型副伤寒患者标本扩增阳性,其余的非伤寒沙门菌、致腹泻的其他5种肠道致病菌及引起发热症状的8种常见非肠道病原菌纯菌及相应患者标本均扩增阴性。在对纯伤寒沙门菌DNA及甲型副伤寒沙门菌DNA检测中,双重TaqMan荧光定量PCR法的最低检测限分别为1 pg/反应(194拷贝/反应)及2.5 pg/反应(485拷贝/反应)。以粪便模拟样品提取DNA为模板的检测中,增菌前伤寒沙门菌检测下限达102cfu/g,增菌后可达1 cfu/g;增菌前甲型副伤寒沙门菌检测下限达104cfu/g,增菌后可达10 cfu/g。结论本研究建立了特异性好、灵敏度高的检测粪便中伤寒沙门菌及甲型副伤寒沙门菌的双重TaqMan荧光定量PCR方法,为伤寒及甲型副伤寒疾病的同时快速诊断及鉴别诊断、某些不明原因发热及腹泻症状的病原的初步鉴定提供了简易手段。     

全血中伤寒沙门菌RT-LAMP检测方法的建立

目的 建立反转录-环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)方法特异检测伤寒沙门菌。 方法 针对伤寒沙门菌 fliC-d 基因设计6条特异性引物,通过优化反应条件,建立检测该靶基因的RT-LAMP方法,利用48个血清型的纯培养伤寒和非伤寒沙门菌菌株、常见非沙门致腹泻病原菌以及发热为主要症状的8种常见病原菌RNA评价该方法的特异性及敏感性,同时对伤寒沙门菌全血模拟标本进行敏感性检测,并与rRT-PCR方法的敏感性进行比较。 结果 等温65 ℃条件下,30~60 min内可完成RT-LAMP检测反应,利用该方法检测44株伤寒沙门菌均阳性,除4种少见的非伤寒沙门菌血清型扩增阳性外,其余30种非伤寒沙门菌血清型、致腹泻的其他5种肠道致病菌以及发热为主要症状的8种常见非沙门菌也均扩增阴性。在对纯菌总RNA检测中,RT-LAMP的最低检测限为0.5 pg/反应,即97个拷贝/反应。在以全血模拟样品提取核酸为模板的检测中,敏感性达1 cfu/ml,比rRT-PCR检测低限高100倍。 结论 建立了敏感性高、特异性好的RT-LAMP检测血液中伤寒沙门菌的方法,为伤寒沙门菌感染的快速诊断及不明原因发热症状的病原初步鉴别提供了简便的手段,可用于对伤寒的早期诊断、预防控制及临床治疗。     

TaqMan荧光定量PCR检测流感嗜血杆菌和肺炎链球菌方法的建立及应用

目的 建立TaqMan荧光定量PCR检测方法 ,用于流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的检测和鉴别诊断.方法 针对流感嗜血杆菌种属特异性基因bexA和肺炎链球菌种属特异性基因lytA,设计合成引物和TaqMan探针,研究不同引物和探针荧光定量PCR检测的特异性和灵敏度,确定标本检测中循环阈值(Ct)的临界值(cut-off值).将荧光定量PCR、乳胶凝集和细菌培养3种检测方法 同时应用于278份细菌性脑膜炎患者脑脊髓液标本的检测.结果 bexA基因引物和探针能特异性检测流感嗜血杆菌a、b、c、d血清型的菌株,检测灵敏度为每个反应10个基因组DNA拷贝;lytA基因引物和探针能特异性检测肺炎链球菌常见致病的血清型肺炎链球菌菌株,检测灵敏度为每个反应90个基因组DNA拷贝.通过荧光定量PCR方法 ,278份脑脊髓液标本中共检测出 4份流感嗜血杆菌阳性和7份肺炎链球菌阳性,其中各有2份培养出相应的病原菌,另有1份流感嗜血杆菌和2份肺炎链球菌乳胶凝集结果 阳性.结论 TaqMan荧光定苗PCR方法 能特异地检测和鉴定流感嗜血杆菌和肺炎链球菌,具有较高的灵敏度和快速检测的特点,能提高临床流感嗜血杆菌和肺炎链球菌感染患者标本的阳性检出率.     

Analysis of AmpC beta-lactamase expression and sequence in biochemically atypical ceftazidime-resistant Enterobacteriaceae from paediatric patients

OBJECTIVES: To analyse the variation of ampC beta-lactamase gene sequence and expression in biochemically atypical Enterobacteriaceae isolates, and to identify them definitively. METHODS: beta-Lactamase gene-containing recombinant plasmids transformed into Escherichia coli were selected using ampicillin. PCR analysis was used to locate specific ampC and 16S rRNA genes, and the amplicons were sequenced. Random amplified polymorphic DNA PCR was used to group isolates and API 20E biochemical profiling was used to identify them putatively. RESULTS: Of 50 ceftazidime-resistant clinical Enterobacteriaceae isolates, 36 were identified (>95% confidence)-using API 20E test strips-as being organisms known to express inducible class C beta-lactamases (Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Morganella morganii or Hafnia alvei). The rest were biochemically atypical. Of these, isolate I113, putatively identified as E. coli, possesses a chromosomally encoded ampC which differs by 15% from C. freundii OS60 ampC and by >30% from E. coli ampC. A related ampC gene was found in another seven of the atypical isolates. The use of various identification methods, including ampC sequence analysis, revealed that these I113-like ampC-positive isolates represent Citrobacter murliniae and Citrobacter youngae. CONCLUSIONS: We report sequences for two new Citrobacter spp. ampC genes, and provide evidence that ampC sequencing is a discriminatory method for identifying atypical Citrobacter spp. isolates.     

37株枸橼酸杆菌的耐药性及PFGE分型分析

目的了解食品及患者来源的37株枸橼酸杆菌的耐药性、毒力基因携带及PFGE的分型情况。方法运用K-B法选择15种抗生素进行药敏试验;以PCR方法检测志贺样毒素（Istx1/I和Istx2/I）、紧密素基因（Ieae/I）及溶血素（Ihly/I）4种毒力基因;用脉冲场凝胶电泳（pulse field gel electrophoresis,PFGE）方法进行同源性分析。结果37株枸橼酸杆菌中,25株为杨氏枸橼酸杆菌,11株为弗劳地枸橼酸杆菌,1株为布雷克氏枸橼酸杆菌。分离菌株对大多数抗生素敏感,但对头孢噻吩100%耐药。其毒力基因检测均为阴性。PFGE结果发现不同菌株带型差异较大。其中5株食品来源,1株为人来源的杨氏枸橼酸杆菌同为MAS007型,具有流行病学相关性。 结论该地区枸橼酸杆菌主要以杨氏枸橼酸杆菌为主;部分菌株具有多重耐药,应加强菌株的耐药性监测;脉冲场凝胶电泳对枸橼酸杆菌有较好的分型能力,有助于分析追踪疫情和来源;患者可能存在食源性感染,应引起疾控部门的重视。     

模拟粪便标本单增李斯特菌和伊氏李斯特菌TaqMan双重实时荧光定量-聚合酶链反应检测方法

目的建立一种TaqMan双重实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time PCR),用于模拟粪便标本中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的快速检测。方法以单增李斯特菌特异基因hly和伊氏李斯特菌特异基因smcL作为靶基因,合成2对引物和其相应的荧光探针,制作标准曲线,建立从模拟粪便标本中直接检测单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的TaqMan双重real-time PCR。利用李斯特菌属中其他种李斯特菌及常见致病菌验证引物、探针的特异性;通过制备模拟粪便标本并对其进行二次增菌后,分别提取DNA,采用TaqMan双重real-time PCR进行检测,以达到快速检测单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的目的。结果采用本研究建立的TaqMan双重real-time PCR对模拟粪便标本的检测结果显示特异性良好,与其他种李斯特菌和其他病原菌均无交叉反应。模拟粪便标本中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的检测下限分别为2.45×103cfu/g和2.92×103cfu/g;模拟粪便标本在3 h内可得出检测结果,当模拟粪便标本中单增李斯特菌含量为6 cfu/g和伊氏李斯特菌含量为5 cfu/g时,经过增菌后使用双重real-time PCR可检测出阳性结果。结论本研究建立了以单增李斯特菌的特异基因hly和伊氏李斯特菌的特异基因smcL为靶基因的TaqMan双重realtime PCR检测方法,该方法具有特异性好、敏感性高、快速易操作等优点,可用于临床、食品及环境标本的快速诊断,以及我国人群中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的携带或感染状况的调查分析。