阪崎肠杆菌实时荧光TaqMan PCR 检测方法的研究

目的 建立阪崎肠杆菌的TaqMan PCR检测方法。 方法 将阪崎肠杆菌的菌悬液连续10倍稀释后与健康人新鲜粪便混匀,制备成1.2100 ~ 1.2108 cfu/ml梯度浓度的粪便模拟标本并提取DNA,用以评价阪崎肠杆菌实时荧光TaqMan PCR法对临床模拟标本检测的灵敏度、特异性和稳定性。 结果 实时荧光TaqMan PCR法对阪崎肠杆菌粪便模拟标本的检测灵敏度为1.2103 cfu/ml; 其线性检测范围为:1.2103 ~ 1.2108 cfu/ml;在稳定性评价中,对含菌量为1.2108、1.2106和1.2104 cfu/ml的粪便模拟标本进行实时荧光TaqMan PCR法重复检测10次,结果显示扩增反应Ct 值的变异系数(CV)为0.65%~1.47%;在特异性评价中,除了阳性对照其余样本均未见特异性扩增曲线。 结论 本研究建立了阪崎肠杆菌实时荧光TaqMan PCR法。     

氨基糖苷类药物耐药基因armA实时荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立

目的建立一种快速、准确检测细菌中arm A耐药基因的Taq Man实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative-polymerase chain reaction,real-time PCR)方法。方法根据arm A基因设计特异的引物及探针,在多种常见致病菌中检测其特异性;使用阳性质粒标准品评价该方法的灵敏度;使用粪便模拟标本验证该方法的应用性。结果本方法特异性好,建立的arm A耐药基因real-time PCR方法标准曲线,确定其对质粒标准品的灵敏度为4.07×101拷贝/ml。应用该方法对粪便模拟标本进行检测,其检测下限为1.3×104cfu/ml。结论本研究建立了arm A耐药基因荧光定量PCR检测方法,有望在耐药基因监测中推广使用。     

模拟粪便标本单增李斯特菌和伊氏李斯特菌TaqMan双重实时荧光定量-聚合酶链反应检测方法

目的建立一种TaqMan双重实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time PCR),用于模拟粪便标本中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的快速检测。方法以单增李斯特菌特异基因hly和伊氏李斯特菌特异基因smcL作为靶基因,合成2对引物和其相应的荧光探针,制作标准曲线,建立从模拟粪便标本中直接检测单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的TaqMan双重real-time PCR。利用李斯特菌属中其他种李斯特菌及常见致病菌验证引物、探针的特异性;通过制备模拟粪便标本并对其进行二次增菌后,分别提取DNA,采用TaqMan双重real-time PCR进行检测,以达到快速检测单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的目的。结果采用本研究建立的TaqMan双重real-time PCR对模拟粪便标本的检测结果显示特异性良好,与其他种李斯特菌和其他病原菌均无交叉反应。模拟粪便标本中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的检测下限分别为2.45×103cfu/g和2.92×103cfu/g;模拟粪便标本在3 h内可得出检测结果,当模拟粪便标本中单增李斯特菌含量为6 cfu/g和伊氏李斯特菌含量为5 cfu/g时,经过增菌后使用双重real-time PCR可检测出阳性结果。结论本研究建立了以单增李斯特菌的特异基因hly和伊氏李斯特菌的特异基因smcL为靶基因的TaqMan双重realtime PCR检测方法,该方法具有特异性好、敏感性高、快速易操作等优点,可用于临床、食品及环境标本的快速诊断,以及我国人群中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌的携带或感染状况的调查分析。     

实时荧光定量PCR法检测产气荚膜梭菌

目的:运用实时荧光定量PCR法检测产气荚膜梭菌,为早期快速诊断气性坏疽提供新方法.方法:以产气荚膜梭菌16s rDNA基因序列为模板,在其保守区域设计特异性引物与探针,将PCR扩增所得产物片段克隆,作为定量检测的标准品,绘制标准曲线.并对荧光定量PCR体系与反应条件进行优化,验证方法的特异性、敏感性、重复性及可行性.结果:实时荧光定量PCR法对产气荚膜梭菌的检测具有高度特异性,与创伤弧菌等24种相关细菌等均无交叉反应;检测灵敏度以纯菌计数达9×102cfu/mL,相当于9 cfu/反应;反应体系有较高稳定性;整个操作过程仅需3 h;300例创伤可疑分泌物样本的荧光定量PCR检测结果与细菌培养结果一致.结论:实时荧光定量PCR法特异、灵敏、快速,适用于产气荚膜梭菌的临床检测及突发事件的批量检测.     

双重实时荧光定量PCR检测产志贺毒素大肠埃希菌stx1和stx2基因

摘要：目的：建立一种检测产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)的双重实时荧光定量PCR法。 方法：根据stx1和stx2及其变种序列,设计PCR引物和TaqMan探针,建立双重实时荧光定量PCR检测体系,进行灵敏度和特异性评价,并对STEC模拟粪便标本及动物粪便标本进行检测分析。 结果：双重实时荧光定量PCR检测含志贺毒素基因重组质粒的灵敏度为1×10² copies/反应体系;该法对17种常见肠道病原菌均无特异性扩增,对47株不同志贺毒素类型及变种的已知STEC菌株的检测特异性为100%;对模拟粪便标本的检测下限为3.55×10³ CFU/g;对动物粪便标本的检测阳性率高于细菌分离培养。 结论: 建立的双重实时荧光定量PCR可作为不同志贺毒素类型及变种的STEC菌株的快速鉴定方法,亦可用于人感染性腹泻标本和动物粪便标本STEC感染的快速筛查。     

肺炎链球菌TaqMan实时荧光定量PCR的建立及临床应用

目的：建立TaqMan实时荧光定量PCR检测肺炎链球菌的方法,应用于临床儿童社区获得性肺炎（CAP）标本的快速筛查。方法根据 GenBank公布的肺炎链球菌自溶酶基因（lytA）设计引物和探针,建立实时荧光定量 PCR,并对体系进行优化;同时以痰培养法做双盲对照,应用于1504份 CAP患儿标本检测。结果 TaqMan实时荧光定量 PCR菌液的最低检出限可达18.75 cfu/PCR,无交叉反应,特异度好;对1504份儿童CAP标本检测,141份肺炎链球菌实时荧光定量PCR阳性,其中140份肺炎链球菌痰培养阳性,该方法灵敏度为100％,特异度为99.93％。从样品处理到结果报告仅需2.5 h。结论 TaqMan实时荧光定量PCR快速、简便、灵敏度高、特异度强,可用于儿童CAP中肺炎链球菌的初筛和指导抗生素的的合理使用。     

利用双重TaqMan荧光定量聚合酶链反应技术鉴别诊断粪便标本中的伤寒和甲型副伤寒沙门菌

目的建立针对粪便标本中伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌的检测方法,评价该方法的特异性、敏感性及检测下限,以提高感染人群粪便标本中两种病原的检出效率。方法分别根据伤寒沙门菌特异基因STY1633及甲型副伤寒沙门菌特异基因SPA4289设计特异性引物及探针,优化反应条件,建立双重TaqMan荧光定量聚合酶链反应(dual taqman fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)体系。利用44株伤寒沙门菌、30株甲型副伤寒沙门菌、88株其他血清型沙门菌染色体DNA及引起发热的其他病原菌,评价该方法的特异性和灵敏性,并对伤寒沙门菌及甲型副伤寒沙门菌的粪便模拟标本进行检测下限评价,同时利用10份伤寒患者、20份甲型副伤寒患者及48份其他病原所致发热和/或伴腹泻的患者粪便标本进行特异性、敏感性验证。结果利用本方法检测的伤寒、副伤寒沙门菌纯菌及伤寒、甲型副伤寒患者标本扩增阳性,其余的非伤寒沙门菌、致腹泻的其他5种肠道致病菌及引起发热症状的8种常见非肠道病原菌纯菌及相应患者标本均扩增阴性。在对纯伤寒沙门菌DNA及甲型副伤寒沙门菌DNA检测中,双重TaqMan荧光定量PCR法的最低检测限分别为1 pg/反应(194拷贝/反应)及2.5 pg/反应(485拷贝/反应)。以粪便模拟样品提取DNA为模板的检测中,增菌前伤寒沙门菌检测下限达102cfu/g,增菌后可达1 cfu/g;增菌前甲型副伤寒沙门菌检测下限达104cfu/g,增菌后可达10 cfu/g。结论本研究建立了特异性好、灵敏度高的检测粪便中伤寒沙门菌及甲型副伤寒沙门菌的双重TaqMan荧光定量PCR方法,为伤寒及甲型副伤寒疾病的同时快速诊断及鉴别诊断、某些不明原因发热及腹泻症状的病原的初步鉴定提供了简易手段。     

利用实时荧光定量PCR技术检测毒素基因快速鉴定A/B型肉毒梭菌方法的建立

目的建立针对A/B型肉毒梭菌毒素基因的实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测方法,构建标准曲线,评价该方法的特异性、敏感性及检测下限,以提高肉毒梭菌检测的快速性、准确性。方法根据肉毒梭菌A/B型毒素基因设计特异性引物及探针,优化反应条件,建立real-time PCR反应体系。 用25种细菌评价该方法的特异性,使用含有A/B型毒素基因特异性序列的重组质粒标准品构建标准曲线,模拟粪便标本,评价建立方法的灵敏度。结果建立的real-time PCR检测方法特异性好,携带A/B型毒素基因的重组质粒均出现相应特异性扩增曲线,对其他25种细菌进行试验扩增时,均未见出现特异性扩增曲线。 根据重组质粒标准品构建的标准曲线可确定其对肉毒梭菌A/B型毒素基因检测灵敏度分别为5.04×102拷贝/μl和6.91×102拷贝/μl。 模拟粪便标本中含有目的基因重组质粒的检测下限为A型1.71×103拷贝/μl,B型2.14×103拷贝/μl。结论本研究设计了适合检测国内肉毒梭菌 A/B 型的引物和探针,建立 real-time?PCR 快速检测体系,为我国肉毒梭菌 A/B 型菌株的快速鉴定提供一种新的技术手段。     

基于TaqMan探针的幽门螺杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的探讨基于TaqMan探针的幽门螺杆菌23SrDNA基因片段的实时荧光定量PCR检测的有效方法。方法根据幽门螺杆菌23SrDNA序列设计引物和探针,构建质粒标准品,建立实时荧光定量PCR体系并进行方法学评价,并对2012年5月至10月收集的100份临床样本进行检测同时应用免疫组化及银染方法进行比较分析。结果建立了检测23SrDNA的实时荧光定量PCR方法：107-102copies/ul范围内均有＂S＂型扩增曲线,最低检测浓度为102copies/ul,标准曲线相关系数为1。对临床其它消化道病原体不出现特异性的扩增曲线。对100份样本进行检测,实时荧光定量PCR能检出31份阳性,而免疫组化方法能检出25份阳性,银染方法能检出28份阳性。结论实时荧光定量PCR方法可成功检测幽门螺杆菌,且该方法具有灵敏度和特异性高及重复性好等优点。     

自身猝灭探针定量PCR检测HCV方法的建立

目的 建立自身猝灭荧光探针定量PCR技术检测HCV方法.方法 构建重组质粒pMD18-T-HCV5'NCR作为标准品,并通过Sigma在线软件设计自身猝灭探针,优化定量PCR体系,并进行方法学评价.结果 建立了自身猝灭荧光探针的定量PCR方法,线性为101～1010copies/μl;灵敏度达50 copies/μl;批内CV为6.1%,批间CV为6.5%,日间CV为6.8%;特异性为100%,与其他肝炎病毒无交叉反应.与紫外定量方法比较,结果差异无显著性,且高度相关.结论 以自身猝灭荧光探针建立的HCV荧光定量PCR检测方法,灵敏度高、特异性强,为新型试剂盒的开发奠定了基础.     

TaqMan荧光定量PCR检测新型隐球菌方法的建立

目的建立TaqMan荧光定量PCR方法定量检测新型隐球菌基因组DNA,为检测隐球菌性脑膜炎提供重要方法。方法在国家生物技术信息中心(NCBI)查找新型隐球菌各亚型的ITS-rDNA序列,序列比对后设计特异性引物和探针,扩增片段为114bp,构建质粒标准品,调整质粒浓度为1.42×10~8 copy/μL~1.42×10copy/μL共8个浓度梯度,分别取2μL作为模板,优化反应条件,建立标准曲线,进行敏感性、特异性、重复性评价,并检测临床确诊的15例隐球菌脑膜炎感染菌株。结果建立的荧光定量PCR可以检测2.84×10~2拷贝的质粒DNA,对临床分离的各10例其他真菌、细菌、乙型肝炎病毒DNA和人类基因组DNA均无扩增曲线,重复性良好,3个浓度的批间变异系数分别为2.86%、1.48%、1.36%,可准确检测15例新型隐球菌。结论成功建立检测新型隐球菌的荧光定量PCR方法,敏感性和特异性较高,结果稳定可靠,可早期、快速诊断隐球菌性脑膜炎。     

TaqMan-MGB探针实时荧光定量-聚合酶链反应检测肺炎支原体方法的建立

目的 建立敏感、特异的TaqMan-MGB探针实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time PCR)快速检测方法,为临床标本中肺炎支原体快速检测提供技术支持。方法 选取肺炎支原体重复序列RepMP23中保守区域设计、合成特异性扩增引物和TaqMan-MGB探针,建立并优化real-time PCR检测方法。对优化后的方法使用标准浓度核酸进行扩增效率、灵敏度及特异度评价,并与已报道的肺炎支原体荧光PCR方法进行比较。结果 本研究建立的TaqMan-MGB探针荧光PCR方法对肺炎支原体的检测限为0.2 cfu,比普通TaqMan real-time PCR检测限(3～5 cfu)提高了一个数量级。其检测标准曲线的循环阈值(Ct) 与模板拷贝数呈良好的线性关系(R2=0.999)。用该方法扩增23种呼吸道常见病原菌染色体及人类染色体,结果均为阴性,特异度为100%。结论 TaqMan-MGB探针real-time PCR方法可快速、灵敏、特异地检测肺炎支原体,有很好的应用前景与价值。     

粪肠球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

目的 建立用于检测粪肠球菌的TaqMan实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative-Polymerase Chain Reaction,FQ-PCR)方法。 方法 根据粪肠球菌的d-丙氨酸聚连接酶(ddl)基因设计TaqMan FQ-PCR的引物及探针,并使用39种常见致病菌和条件致病菌检测其特异性。将目的基因克隆到质粒中,制作标准曲线,确定方法的检测下限。制备血液模拟标本,直接提取核酸进行检测,探索临床应用的可能。 结果 在特异性评价实验中,除阳性对照外其余样本均未出现特异性扩增曲线。建立粪肠球菌TaqMan FQ-PCR方法的标准曲线,确定该方法的检测下限为20 copy/管。通过对粪肠球菌血液模拟标本的检测发现,本方法对模拟标本的检测灵敏度为3.9×103 cfu/ml。在稳定性评价中,对含菌量为3.9×108、3.9×106和3.9×104cfu/ml的血液模拟标本重复检测10次,结果显示扩增反应Ct值的变异系数(CV)为0.99%~1.84%。 结论 本研究建立了适用于临床标本检测的粪肠球菌TaqMan FQ-PCR方法。     

弗氏枸橼酸杆菌TaqMan实时荧光定量-聚合酶链反应检测方法的建立

目的 建立针对弗氏枸橼酸杆菌的TaqMan实时荧光定量-聚合酶链反应(real time-PCR)检测方法。 方法 针对弗氏枸橼酸杆菌的特有序列设计引物和TaqMan探针,扩增目的基因建立标准曲线,确定检测方法的灵敏度;对20种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌进行检测,评价该检测方法的特异性;使用牛奶模拟标本评价方法在实际检测工作中应用性。 结果 TaqMan real time-PCR检测方法对弗氏枸橼酸杆菌重组质粒的检测灵敏度为1.0101拷贝／反应体系;该检测方法在检测30种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌时未出现特异性扩增。该检测方法对牛奶模拟样本中弗氏枸橼酸杆菌检测下限为1.0102cfu/ml的菌量;通过对1.0107、1.0105和1.0103三个浓度质粒标准品的重复检测,确定本方法的组内变异系数为1.90%~3.91%;组间变异系数为1.52%~1.69%。 结论 本研究建立的TaqMan real time-PCR检测方法可作为检测弗氏枸橼酸杆菌灵敏、特异、快速的方法。     

荧光定量PCR方法检测儿童下呼吸道感染的人博卡病毒

目的建立并应用检测儿童下呼吸道感染病人博卡病毒的荧光定量PCR方法。方法选择人博卡病毒的NS1基因作为目标基因,设计荧光定量PCR引物和检测探针,以重组质粒为标准品建立标准曲线,从而建立特异性检测人博卡病毒的荧光定量PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏度、重复性进行评价;应用该方法对下呼吸道感染患儿的痰或吸痰、咽拭子及血清标本进行定量检测。结果本研究以人博卡病毒NS1基因中85bp的特异性保守片段为目标基因建立荧光定量PCR检测方法,质粒标准曲线的相关系数为0.999,灵敏度可达到50拷贝;应用该方法对下呼吸道感染患儿的痰或吸痰、咽拭子和血清标本进行定量检测,在176例痰或吸痰标本中检测到7例阳性标本,阳性率达到3.98%(7/176),另64例咽拭子标本中未检测到阳性标本,总阳性率为2.92%(7/240),240例血清标本均未检测到阳性标本。结论建立的荧光定量PCR方法可以特异、快速、灵敏地对儿童下呼吸道感染的人博卡病毒进行定量检测。痰或吸痰标本较咽拭子或血清标本更适用于人博卡病毒感染的核酸检测。     

应用TaqMan实时荧光-聚合酶链反应方法快速检测粪便标本空肠弯曲菌的研究

目的建立空肠弯曲菌TaqMan实时荧光-PCR方法,用于粪便标本的直接检测。方法根据空肠弯曲菌特异性基因hipO和mapA分别设计引物和探针,在对2组引物和探针进行灵敏度、特异性和重复性评价的基础上,对45例临床腹泻患者粪便标本提取DNA之后,荧光PCR检测,同时进行分离培养。 结果两组引物和探针能准确检测空肠弯曲菌菌株2株,检测限可达到10~20 cfu/ml,并与其他肠道致病菌无交叉反应。检测45份腹泻病例粪便标本,该方法检测到3份为阳性,同时进行的传统培养方法仅从该3份标本中的两份中分离到空肠弯曲菌。 结论本研究建立的TaqMan荧光PCR检测粪便标本中所携带的空肠弯曲菌灵敏度高,特异性好,能够提高粪便中空肠弯曲菌的阳性检出率和缩短检测时限。     

人型支原体实时荧光聚合酶链反应检测方法的初步建立

目的 建立一种快速、灵敏和特异的人型支原体实时荧光聚合酶链反应(real-time PCR)检测技术。 方法 依据人型支原体gap基因保守区域使用Beacon Designer 7.0软件设计引物和探针,建立人型支原体real-time PCR检测方法并优化。对优化后的方法进行实验室灵敏度、特异度和检测限评价,并与聚合酶链反应(PCR)进行比较。 结果 该real-time PCR对于人型支原体的检测限为50 cfu,PCR检测限为5103cfu,其检测灵敏度为PCR的100倍。所建立的检测方法对其他10种常见支原体、12种泌尿生殖道感染病原菌染色体及人类染色体的扩增均为阴性。 结论 本研究建立的real-time PCR方法可灵敏、特异的检测人型支原体,有望用于临床标本检测。