不同方法提取血清总RNA的性能评价

目的 评价3种方法提取血清总RNA的性能.方法 分别用Trizol法、磁珠总RNA提取法(磁珠法)、柱式总RNA提取法(柱式法)提取血清总RNA.通过测定样品OD260/OD280值评价提取的总RNA纯度、产量;通过设计引物及TaqMan探针扩增总RNA的管家基因(GAPDH),以观察各方法提取的总RNA用于RT-PCR的效果.结果 3种方法提取总RNA纯度分别为Trizol法(1.83±0.19)、磁珠法(1.94±0.11)、柱式法(1.92±0.12);扩增管家基因GAPDH,其Ct值分别为Trizol法(19.37±3.51)、磁珠法(18.33±1.11)、柱式法(18.85±1.20).结论 磁珠法、柱式法明显优于Trizol法,磁珠法与柱式法结果 差异无统计学意义(P>0.05).     

长期冻存和新鲜胃癌组织总RNA提取方法的比较

背景:目前两种最可靠、应用最广的高通量RNA分离技术是基于异硫氰酸胍-酚︰氯仿的RNA分离技术和基于硅胶柱的RNA分离技术。在临床应用非常有限的组织材料时,有必要对RNA分离技术的可重复性和可靠性分别进行先期评价。目的:系统比较采用硅胶柱法和Trizol法从冻存、新鲜胃癌组织中分离总RNA的效果。方法:硅胶柱法和Trizol法分别提取长期-80℃冻存的(2年以上)和新鲜胃癌组织总RNA,紫外分光光度法比较RNA纯度,琼脂糖凝胶电泳分析28S和18S吸光度比值,进一步通过实时反转录-聚合酶链反应对扩增距mRNApolyA尾端不同大小片段的Ct值进行比较,间接判断不同大小mRNA的拷贝数及完整性。结果与结论:硅胶柱技术和Trizol方法在总RNA提取的纯度方面都表现很好。然而在RNA完整性方面,基于硅胶柱技术的提取方法要好于Trizol法,因为其核糖体RNA形式完好而且更好地保持了不仅短的及中等大小片段,对于较大的mRNA片段也保持更好。另外,与新鲜组织相比,长时间冻存对胃癌组织总RNA提取的影响很小。     

基于qPCR的循环miRNA定量检测的方法探讨

目的探讨和优化循环miRNA检测方法,为进一步研究循环miRNA作为生物标记物提供方法学基础。方法以miR-16和miR-21为检测目标,通过实时PCR的方法检测其表达量。比较传统Trizol法和miRNA提取试剂盒的miRNA提取效率;比较血清和血浆中miRNA含量;并对基于实时定量PCR（qPCR）的循环miRNA检测方法重复性和敏感性进行评价。结果 miRNA提取试剂盒的miRNA提取效率是传统Trizol法的16 435倍;血浆中miR-16和miR-21qPCR检测的Ct值为25.75±1.83、25.69±2.04,而血清miRNA检测Ct值为27.82±1.03、27.12±1.35,两者相比有显著差异;同一批血浆miR-16两次检测相关系数为0.8885,单个血浆样本10倍梯度稀释后Ct值拟合系数0.9865。结论 Trizol法提取循环miRNA效率低,血浆中miRNA含量较血清稍高,建议选取血浆为标本,通过miRNA提取试剂盒提取miRNA,然后行实时PCR检测其表达,该法具有较高的重复性和敏感性。     

多发性骨髓瘤患者骨髓液中miRNA-21、miRNA-15a和miRNA-16的表达及其临床意义分析

目的观察和分析多发性骨髓瘤(MM)患者骨髓液中微小RNA(miRNA)-21、miRNA-15a和miRNA-16的表达及其临床意义。方法选取50例MM患者作为病例组,根据治疗效果将其分为初治组(19例)、难治组(18例)和缓解组(13例),选取20例非恶性血液疾病患者作为对照组。对各组患者骨髓液中的miRNA-21、miRNA-15a和miRNA-16表达水平和血清β2微球蛋白(β2-MG)水平进行检测和比较。结果各组患者骨髓液中miRNA-21、miRNA-15a、miRNA-16表达水平的差异均有统计学意义(F=37.839、419.707、445.998,P0.05)。其中,难治组患者骨髓液中miRNA-21表达水平显著高于其他三组,miRNA-15a、miRNA-16表达水平显著低于其他三组,初治组患者骨髓液中miRNA-21表达水平显著高于缓解组或对照组,miRNA-15a、miRNA-16表达水平显著低于缓解组或对照组,以上差异均有统计学意义(P0.05);直线相关分析显示,MM患者血清β2-MG水平与骨髓液中miRNA-21表达水平呈正相关关系(r=0.599,P0.05),与miRNA-15a表达水平(r=-0.829)、miRNA-16表达水平(r=-0.698)呈负相关关系(P0.05),多元线性回归分析结果显示,MM患者的血清β2-MG水平与骨髓液中miRNA-15a表达水平呈负相关关系(标化相关系数=-0.976,t=-5.838,P0.05)。结论 MM患者骨髓液中的miRNA-15a、miRNA-16和miRNA-21表达水平与患者对化疗的反应性和肿瘤负荷具有相关性,可用于评价患者病情的进展、预测治疗效果和患者的预后。     

血清miRNA-21,miRNA-126表达在诊断PCI术后冠状动脉再狭窄的临床应用价值

目的研究血清miRNA-21,miRNA-126检测在诊断经皮冠状动脉介入术(PCI)术后冠状动脉再狭窄(ISR)的临床应用。方法收集82例在泾阳县医院和陕西中医药大学附属医院接受PCI治疗的急性冠脉综合征(ACS)患者(狭窄组30例,未狭窄组52例)及33例体验健康者(对照组)的血清及临床资料,采用real-time qPCR技术检测血清中miRNA-21和miRNA-126的相对表达量,比较分析其在各组中的变化。应用血管内超声(intravascular ultrasound,IVUS)来评价PCI术后再狭窄的发生。结果血清miRNA-21和miRNA-126在对照组、未狭窄组和狭窄组中的表达量分别为(0.22±0.03,0.43±0.08,0.92±0.17)和(0.87±0.15,0.49±0.10,0.23±0.04)。与对照组比较,血清miRNA-21在狭窄组与未狭窄组的表达量明显增高,而miRNA-126表达水平则显著降低,差异均有统计学意义(P=0.000)。狭窄组与未狭窄组比较miRNA-21表达水平明显增高,而miRNA-126表达水平则显著降低,差异均有统计学意义(P=0.000)。IVUS结果显示,狭窄组的斑块面积(PLA)与未狭窄组比较显著增高,而最小管腔面积(MLA)显著降低,其差异均有统计学意义(P=0.000)。两标志物在狭窄组的表达量具有负相关性(r=-0.919,P0.01)。狭窄组中miRNA-126和miRNA-21水平分别与PLA和MLA具有相关性(r=-0.945,0.926,P0.01)和(r=0.933,-0.917,P0.01)。结论血清miRNA-21和miRNA-126水平检测可用于急性冠脉综合征疾病PCI术后冠状动脉再狭窄的诊断以及预测,可能作为该疾病时的基因检测指标之一。     

高原地区大鼠耳蜗RNA提取条件优化

目的探讨在高原地区采用AMBION抽提试剂盒提取RNA的最佳条件。方法采用AMBION抽提试剂盒,对126份大鼠耳蜗(每份耳蜗分为2组,实验组和对照组)提取RNA,实验组采用AMBION抽提试剂盒优化条件提取RNA,对照组按照AMBION抽提试剂盒说明书提取RNA。结果实验组和对照组均能成功提取大鼠耳蜗组织RNA,总RNA的提取量分别为:0.896±0.348μg,0.536±0.404μg(P0.05);实验组RNA浓度高于对照组,分别为:0.147±0.047μg/μl,0.072±0.022μg/μl(P0.05);实验组RNA纯度高于对照组,纯度指标A260/280分别为:2.096±0.044,1.900±0.113(P0.05);实验组RNA完整性指标RIN值高于对照组,分别为:9.689±0.459,8.588±0.662(P0.05);实验组和对照组28S/18S分别为:1.967±0.141,1.863±0.192(P0.05)。结论在高原地区采用AMBION抽提试剂盒提取大鼠耳蜗组织RNA,需要优化提取条件,其RNA浓度、纯度和质量都能满足后续实验要求,且样本重复性好。     

股骨头坏死患者血清miRNA-210,miRNA-23b检测的应用价值

目的探讨血清微小RNA(microRNA,miRNA)-210,-23b检测在股骨头坏死患者中的临床应用价值。方法收集2015年1月~2017年1月于陕西中医药大学第一附属医院骨三科住院行股骨颈骨折内固定手术治疗的135例患者的血清及临床资料,依据是否发生股骨头坏死分为坏死组和非坏死组,其中坏死组27例,非坏死组108例。采用实时荧光定量PCR(Real time-PCR,RT-PCR)技术检测血清miRNA-210,miRNA-23b的表达。比较分析血清miRNA-210,miRNA-23b的变化与股骨头坏死之间的关系。结果坏死组血清miRNA-210,miRNA-23b表达分别为(0.19±0.03,0.21±0.05);非坏死组血清miRNA-210,miRNA-23b表达分别为(0.92±0.18,0.87±0.17)。坏死组血清miRNA-210,miRNA-23b表达分别与非坏死组比较显著下调,其差异均有统计学意义(t=35.29,31.20,P0.01)。采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析血清miRNA-23b,miRNA-210的AUC分别为0.790(95%CI:0.687~0.89.2,P=0.000)和0.743(95%CI:0.633~0.854,P=0.000)。miRNA-23b,miRNA-210在最佳临界值处诊断股骨头坏死的敏感度和特异度分别为95.7%和93.9%,91.5%和92.3%。结果显示血清miRNA-23b,miRNA-210的表达对诊断股骨头坏死的发生有临床意义。结论检测血清miRNA-210,miRNA-23b表达可预测股骨头坏死的发生,估计病情的发展状况。     

miRNA-221和miRNA-222对前列腺癌细胞PC-3的增殖、迁移及SIRT1表达的调控

目的观察前列腺癌PC-3细胞中微小RNA(microRNA,miRNA)-221和miRNA-222对细胞增殖和迁移的作用,以及对沉默信息调节因子1(SIRT1)表达的影响。方法设立无处理细胞组(简称control组)、转染空载质粒pEX-5组(简称pEX-5组)、转染miRNA-221反义抑制质粒组(简称miRNA-221抑制组)、转染miRNA-222反义抑制质粒组(简称miRNA-222抑制组),应用细胞计数试剂盒(CCK-8法)检测miRNA-221和miRNA-222对前列腺癌细胞增殖的影响;采用细胞划痕修复实验检测miRNA-221和miRNA-222对细胞迁移能力的影响;采用免疫印迹法和荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测SIRT1在蛋白水平和mRNA水平的变化;采用miRNAanda靶标进行预测分析。结果在成功抑制了PC-3细胞中miRNA-221或miRNA-222的表达后,连续7 d检测细胞活性,miRNA-221抑制组和miRNA-222抑制组的细胞活性(A450 nm值)较pEX-5组降低1.5~2.0倍,自第3天起两组之间即有明显差异(t=6.7,P0.01;t=5.3,P0.01);划痕实验显示,miRNA-221抑制组和miRNA-222抑制组的迁移能力明显低于pEX-5组。miRNA-221抑制组、miRNA-222抑制组中SIRT1蛋白的相对表达量分别为(0.26±0.021)、(0.21±0.005 8),与pEX-5组(0.14±0.017)比较差异均有统计学意义(t值分别为6.3、6.4,P均0.05);而SIRT1 mRNA的表达水平3组之间差异无统计学意义(P0.05)。结论 miRNA-221和miRNA-222能促进前列腺癌PC-3细胞的增殖与迁移能力,影响SIRT1蛋白的表达。     

食管癌和良性食管疾病患者血浆miRNA-21和miRNA-143检测的临床应用研究

目的探讨血浆微小RNA(microRNA,miRNA)-21,miRNA-143水平在鉴别早期食管癌和良性食管疾病中的临床应用。方法收集27例早期食管癌患者(食管癌组)和25例良性食管疾病患者(良性食管疾病组)的血液及临床资料,并设立健康对照组,采用实时荧光定量PCR(real-time-PCR,RT-PCR)技术检测研究对象血浆miRNA-21,miRNA-143水平的表达,采用电化学发光技术检测血浆CEA和CA72-4水平,探讨两标志物的变化与食管癌和良性食管疾病之间的关系。结果食管癌组血浆miRNA-21,miRNA-143的表达量分别为0.93±0.17和0.27±0.05;两标志物在良性食管疾病组的表达量分别为0.25±0.03和0.99±0.15;两标志物在对照组的表达量分别为0.23±0.03和1.02±0.15。食管癌组miRNA-21,miRNA-143表达量分别与良性食管疾病组比较呈现上调、下调,差异有统计学意义(t=10.87,11.55,均P0.01),与对照组比较呈现上调、下调,差异有统计学意义(t=9.20,9.07,均P0.01)。良性食管疾病组血浆miRNA-21,miRNA-143表达量与对照组比较差异则无统计学意义(t=1.39,1.19,均P0.05)。血浆miRNA-21,miRNA-143分别在食管癌组、良性食管疾病组和对照组的阳性率分别为81.5%(22/27),4.0%(1/25),0(0/24);85.2%(23/27),4.0%(1/25),0(0/24)。食管癌组miRNA-21,miRNA-143阳性率分别与良性食管疾病组和对照组比较增高,差异有统计学意义(X~2=31.59,34.39,均p0.01;x~2=34.42,37.23,均P0.01),良性食管疾病组两标志物水平与对照组比较差异则无统计学意义(X~2=0.980,0.980,均p0.01)。血浆miRNA-21,miRNA-143诊断早期食管癌的敏感度及特异度分别为81.4%,97.9%;85.1%,97.9%。食管癌组miRNA-21,miRNA-143的灵敏度分别与CEA和CA72-4比较明显增高,差异有统计学意义(X~2=12.79,P0.01;x~2=5.33,P0.05;X~2=15.03,P0.01;X~2=6.95,P0.05)。食管癌组miRNA-21,miRNA-143的特异度分别与CEA和CA72-4比较,差异无统计学意义(X~2=1.043,0.000,均P0.05,X~2=1.043,0.000,均P0.05)。采用Spearman相关性分析显示,在食管癌组中,血浆miRNA-21,miRNA-143表达量呈负相关(r=-0.658,P0.01)。在该组中miRNA-21,miRNA-143表达量分别与CEA和CA72-4水平也具有相关性(r=0.607,-0.623,均P0.01;r=0.579,-0.610,均P0.01)。结论通过检测miRNA-21,miRNA-143水平在早期食管癌和良性食管疾病患者血浆中的表达,为早期食管癌的病理诊断提供新的思路。     

非小细胞肺癌患者血浆miRNA-145和miRNA-221表达与临床特征及术后复发的相关性研究

目的探讨血浆微小RNA(microRNA,miRNA)-145和miRNA-221表达在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)术后复发中的诊断价值。方法选取2016年4月～2018年4月期间在陕西中医药大学附属医院和陕西省核工业二一五医院胸外科行手术切除的55例原发性非小细胞肺癌患者的临床资料进行回顾性分析,依据术后是否复发分为复发组和未复发组.同时选取50例同期体检健康者作为对照组.采用实时聚合酶联反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)技术检测NSCLC患者血浆miRNA-145和miRNA-221的表达,采用电化学发光方法检测血清细胞角蛋白片断21-1(CYFRA21-1)和癌胚抗原(CEA)水平,比较分析以上标志物的变化与NSCLC患者术后复发的关系。结果在对照组、未复发组和复发组中,血浆miRNA-145和miRNA-221的表达分别为0.97±0.27,0.35±0.15,0.17±0.09和0.20±0.11,0.39±0.17,1.06±0.31。未复发组的miRNA-221表达显著高于对照组,而显著低于复发组;未复发组的miRNA-145表达显著低于对照组,而显著高于复发组;以上比较的差异均有统计学意义(F=118.73～123.72,均P0.01)。在对照组、未复发组和复发组中,血清CYFRA21-1(ng/ml)和CEA(ng/ml)水平分别为3.02±1.17,9.05±3.43,47.68±16.72和2.31±2.03,7.37±3.29,29.37±12.49。复发组和未复发组的CYFRA21-1和CEA水平与对照组比较显著增高;复发组两肿瘤标志物水平与未复发组比较显著增高;以上比较差异均有统计学意义(F=87.46～96.83,均P0.01)。在复发组中,血浆miRNA-145和miRNA-221表达具有负相关性(r~2=0.772,P0.01)。miRNA-145表达分别与CYFRA21-1和CEA水平有负相关性(r~2=0.772～0.794,均P0.01),而miRNA-221表达分别与CYFRA21-1和CEA水平有正相关性(r~2=0.663～0.687,均P0.01)。血浆miRNA-221和miRNA-145表达在鳞癌中的异常率高于腺癌,在TNMⅢ期中的异常率高于Ⅰ-Ⅱ期(χ~2=0.012～0.039,均P0.05);两标志物与患者年龄、肿瘤大小和吸烟无明显相关性(χ~2=0.301～1.000,均P0.05)。结论血浆miRNA-145和miRNA-221的差异表达与NSCLC的病变进展有关,检测血浆miRNA-145和miRNA-221表达可用于监测NSCLC术后的复发。     

慢性疲劳综合征患者外周血单个核细胞中转化生长因子β1 mRNA及雌二醇受体β野生型mRNA的表达水平

目的 探讨慢性疲劳综合征(CFS)患者外周血单个核细胞(PBMCs)中转化生长因子β1(TGF-β1)mRNA及雌二醇受体p野生型(ERβwt)mRNA表达及其与CFS的发病关系.方法 用实时荧光定量逆转录(FQ-RT)-PCR检测63例CFS患者、50例其他疾病患者(疾病对照组)、50名健康体检者(健康对照组)外周血PBMCs中TGF-β1 mRNA和ERβwt mRNA的表达水平和含量.以△Ct=Ct(待测基因)-Ct(内参基因)来比较基因表达水平的变化.结果 CFS患者TGF-β1 mRNA表达水平(△Ct=3.27±0.58)明显高于健康对照组(△Ct=4.37±1.00,t=7.02,P<0.01)和疾病对照组(△Ct=4.54±1.05,t=8.11,P<0.01).CFS患者ERβwt mRNA表达水平(△Ct=9.34±0.92)明显低于健康对照组(△Ct=7.10±0.48,t=15.47,P<0.01)与疾病对照组(△Ct=7.12±0.47,t=15.44,P<0.01);结论CFS患者TGF-β1 mRNA表达水平显著高于健康人和疾病对照组;CFS患者ERβwtmRNA表达水平显著低于健康人和疾病对照组,TGF-β1 mRNA和ERβwt mRNA的表达可能参与了CFS的发病过程.     

miRNA-21-5P在食管鳞癌患者中的鉴别诊断价值

目的检测食管癌患者血清miRNA-21-5P的表达水平,探讨miRNA-21-5P对食管癌患者的鉴别诊断价值。方法选取2019年12月至2020年3月于朝阳市中心医院就诊的食管鳞癌患者50名(疾病组)及食管炎患者20名(相关疾病对照组),采集食管炎患者血清样本及组织样本,以及食管鳞癌患者治疗前血清样本、术中食管鳞癌组织及癌旁组织。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测2组血清及组织样本中miRNA-21-5P的表达水平,分析miRNA-21-5P表达水平与食管鳞癌患者临床病理参数的关系,采用ROC曲线评估其对食管鳞癌的鉴别诊断价值。结果食管鳞癌患者血清miRNA-21-5P的表达水平(3.60±0.09)显著高于食管炎患者(1.01±0.05),差异有统计学意义(t=24.43,P0.05);食管鳞癌患者癌组织中miRNA-21-5P的表达水平(4.36±0.29)显著高于癌旁组织(1.31±0.16),差异亦具有统计学意义(t=20.10,P0.05);而食管癌患者组织中miRNA-21-5P的表达水平显著高于食管炎患者组织(t=20.100,P0.05)。ROC曲线分析结果显示,组织中miRNA-21-5P筛查食管鳞癌的ROC曲线下面积(AUC~(ROC))为0.767(95%CI:0.650,0.859),当cut-off值为0.39时,其敏感性88%,特异性为75%。血清miRNA-21-5P筛查食管鳞癌的AUC~(ROC)为0.671(95%CI:0.549,0.779),当cut-off值为0.63时,其敏感性为80%,特异性为66%。结论 miRNA-21-5P在食管鳞癌血清中的诊断价值与组织相当,或可用于对食管鳞癌的鉴别诊断。     

新型循环提取方法研究miRNA-21在NSCLC中的预测价值

目的构建新型血清miRNA提取方法,并评估血清外泌体miRNA-21表达水平与非小细胞肺癌(NSCLC)患者病理与临床特征的相关性。方法收集30例NSCLC患者(试验组)和10例健康志愿者(对照组)。从每例受试者外周血中离心出两份等量的外周血血清,设为A、B两组,每组为相同的40例血清标本。在miRNA提取方法方面,A组为直接从血清中提取miRNA-21,B组先富集血清外泌体,再从外泌体中提取miRNA-21,然后采用实时荧光定量PCR法分别检测A、B两组血清miRNA-21表达水平,通过分析两组血清中各自试验组、对照组的检测结果是否存在明显差异,来比较两种血清miRNA提取方法的优劣;并进一步分析血清外泌体miRNA-21表达水平与NSCLC患者病理分型、病理分期、TNM分期的相关性。结果 NSCLC患者血清外泌体中miRNA-21的表达水平较健康人明显上调(P0.05),上调倍数为2.93倍,受试者工作曲线显示其预测NSCLC风险价值高,曲线下面积为0.867(P0.05),95%CI为0.721～1.000;而通过直接从血清中提取miRNA-21的方法,NSCLC患者和健康人表达水平差异无统计学意义(P0.05)。NSCLC患者外泌体miRNA-21表达水平与病理分期、TNM分期相关(P0.05),与病理分型无关(P0.05)。结论血清外泌体miRNA-21表达水平具有更高的预测NSCLC风险的价值,并且与NSCLC病理分期、TNM分期相关。     

改良破壁法提取白假丝酵母菌总RNA的应用评价

目的评价改良破壁法提取白假丝酵母菌总RNA的效果。方法选取白假丝酵母菌质控菌株ATCC SC5314及临床分离鉴定菌株4株(编号为NX1、NX2、NX3、NX4),选用改良Trizol破壁法(Trizol加钢珠匀浆震荡混匀破壁法)及溶壁酶(Lyticase)破壁法提取白假丝酵母菌的总RNA,用核酸蛋白测定仪检测RNA的浓度及纯度,并用荧光定量PCR检测管家基因18S rRNA。结果改良Trizol破壁法提取白假丝酵母菌总RNA的浓度、纯度及18S rRNA扩增产物的Ct转化值均高于Lyticase破壁法,差异有统计学意义(P0.05)。结论改良Trizol破壁法破壁提取白假丝酵母菌的总RNA具有浓度好、纯度高的优点,且该方法简便、快速、经济,值得临床及科研推广使用。     

肝硬化患者血清MicroRNA-122含量与分级关系

目的研究肝硬化患者血清中Micro RNA-122含量与肝硬化分级的相关关系,为Micro RNA-122用于肝硬化分级提供实验依据。方法实时荧光定量PCR法测定78例肝硬化患者血清中Micro RNA-122的含量。肝硬化患者根据Child-Pugh进行分级。比较各组间Micro RNA-122和肝硬化分级的关系。结果肝硬化失代偿期与代偿期的血清mi R-122的Ct值差异具有统计学意义(37±3 vs.26±4,P=0.002);腹水与无腹水肝硬化患者血清mi R-122的Ct值差异具有统计学意义(36±3 vs.27±2,P=0.002);上消化道出血与无上消化道出血患者血清mi R-122的Ct值差异具有统计学意义(38±3 vs.23±3,P=0.002);有自发性细菌性腹膜炎和没有的患者血清mi R-122的Ct值差异具有统计学意义(36±4 vs.25±2,P=0.002),没有这些并发症的肝硬化患者mi R-122水平显著降低。Child-Pugh A级与Child-Pugh B级肝硬化患者血清mi R-122的Ct值没有统计学差异(22±3 vs.27±5,P=0.200),Child-Pugh A级患者血清mi R-122的Ct值显著低于Child-Pugh C级患者(22±3 vs.41±3,P=0.001),同时Child-Pugh B级患者血清mi R-122的Ct值显著低于Child-Pugh C级患者(27±5 vs.41±3,P=0.001)。结论血清中Micro RNA-122含量可作为肝硬化患者分级的生物标记物。     

miRNA-570调控ATP合成酶G亚基的表达促进血小板凋亡

目的探讨微小RNA(miRNA)-570对腺苷三磷酸(ATP)合成酶G亚基因(ATP5L)基因表达的影响及miRNA调控血小板凋亡的分子机制。方法依据NCBI数据库中NM_006476.5人的序列分别合成ATP5L 3′端非翻译区(UTR)的野生型(WT)序列和突变型(MT)序列(488 bp),通过在序列两端增加限制酶酶切位点,与双荧光素酶报告基因载体(psiCHECK~(TM)-2)质粒连接,分别构建含有ATP5L 3′UTR的WT和MT的双荧光素酶报告基因载体。依据miRNA数据库中MI0003577人的序列分别合成miRNA-570序列和其阴性序列,分别与构建的双荧光素酶报告基因载体共转染293T细胞,依据转染物的不同将实验分为6组,实验组1:miRNA-570序列和psiCHECK-ATP5L-3′UTR-WT质粒;实验组2:miRNA-570序列和psiCHECK-ATP5L-3′UTR-MT质粒;阴性对照组1:miRNA-570阴性对照序列和psiCHECK-ATP5L-3′UTR-WT质粒;阴性对照组2:miRNA-570阴性对照序列和psiCHECK-ATP5L-3′UTR-MT质粒;空白对照组1:miRNA-570序列和psiCHECK-2质粒;空白对照组2:miRNA-570阴性对照序列和psiCHECK-2质粒。转染48 h后利用生物发光检测仪检测转染细胞的相对荧光强度。收集单采血小板60 mL,利用脂质体方法转染血小板,依据转染物的不同,将实验分为4组,实验组A:miRNA-570序列;阴性对照组B:miRNA-570阴性对照序列;空白对照组C:脂质体2000;空白对照组D:空白(无转染物);分别转染转染血小板,24 h后收集血小板,流式细胞仪检测血小板膜磷脂酰丝氨酸(PS)外翻表达,Western blot检测血小板半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3的表达,ELISA方法检测血小板Caspase-3活性。结果分别成功构建了psiCHECK-ATP5L-3′UTR-WT和-MT的双荧光素酶报告基因质粒载体。转染293T细胞测定的相对荧光强度:实验组1、实验组2、阴性对照组1、阴性对照组2、空白对照组1、空白对照组2分别为0.673±0.080、0.967±0.059、0.97±0.076、0.96±0.075、0.97±0.067、1.0±0.1(P0.05)。实验组A、阴性对照序列组B、空白对照组C、空白对照组D转染血小板24 h时PS表达阳性率(%):分别为5.43±0.61、3.27±0.64、3.25±0.68、3.20±0.36(P0.05);血小板中Caspase-3活性形式(%):分别为12.24±2.74、6.06±1.08、6.00±1.73、5.67±1.53(P0.05);光密度(OD)值(%):分别为0.21±0.029、0.096±0.04、0.09±0.04、0.087±0.025(P0.05)。结论 ATP5L-3′UTR有可与miRNA-570结合的靶位点,miRNA-570调控ATP5L基因的表达,提示miRNA-570可对ATP合成造成影响;miRNA-570可增加PS表达阳性率和Caspase-3活性,提示miRNA-570可对血小板凋亡产生影响。     

miRNA-21-5p对食管癌的诊断价值及其与STAT3的相关性研究

目的分析微小RNA(miRNA)-21-5p在食管癌中的潜在诊断价值,并探索其可能的作用机制。方法选取2016年1月—2018年6月在浙江大学医学院附属邵逸夫医院下沙院区治疗的食管癌患者78例(病例组)以及体检健康者69名(对照组)。采集患者治疗前血液及术中癌组织、癌旁组织,通过实时聚合酶链反应(PCR)检测血清中miRNA-21-5p的表达,通过picTar、TagetScan、Tarbase 3个数据库分别预测miRNA-21-5p的靶基因;利用Draw venn diagram选取3个数据库预测靶基因交集;采用实时PCR检测食管癌患者癌组织和癌旁组织中信号传导和转录激活子3(STAT3)mRNA的表达情况。结果实时PCR结果显示,miRNA-21-5p在食管癌患者血清中高表达,且显著高于对照组(P0.01);STAT3 mRNA在食管癌患者癌组织中高表达,显著高于癌旁组织(P0.01);Spearman相关性分析发现两者呈正相关。结论在食管癌患者血清中miRNA-21-5p呈高表达,同时在癌组织中miRNA-21-5p的预测靶基因STAT3 mRNA也呈高表达,并且两者呈正相关。     

微小核糖核酸在冠心病患者中的表达及与凝血功能的相关性

目的探究冠心病患者中miRNA表达水平及凝血功能相关性。方法选取2016年7月-2018年12月本院收治冠心病患者作为观察组(n=84),按照冠心病不同类型分为SCAD组(n=53)、ACS组(n=31)。参照Gensini积分评价标准,分为轻度狭窄组(n=32)、中度狭窄组(n=30)、重度狭窄组(n=22)。选择同期于本院体检健康合格者作为对照组(n=80)。采用ELISA法检测观察组与对照组血浆vWF、Fg、TAT、D-dimers、P-selectin水平。采用实时荧光定量PCR技术检测观察组miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335Ct值及表达量。采用spearman相关分析法分析miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335与vWF、Fg、TAT、TAT、D-dimers、P-selectin、动脉狭窄程度关系。结果SACD组与ACS组vWF、Fg、TAT、D-dimers、P-selectin水平明显高于对照组(P<0.05)。SACD组与ACS组miRNA-96与miRNA-34aCt值均低于对照组、miRNA-335Ct值高于对照组(P<0.05)。SACD组与ACS组miRNA-96、miRNA-34a表达量明显高于对照组、miRNA-335表达量均明显低于对照组(P<0.05)。轻度狭窄组miRNA-96及miRNA-34a表达量均低于重度狭窄组、miRNA-335表达量高于中度及重度狭窄组(P<0.05);中度狭窄组miRNA-96及miRNA-34a表达量低于重度狭窄组、miRNA-335表达量高于重度狭窄组(P<0.05)。spearman相关分析显示,miRNA-96、miRNA-34a与vWF、Fg、TAT、TAT、D-dimers、P-selectin、动脉狭窄程度呈正相关,miRNA-335与动脉狭窄程度呈负相关(P<0.05)。结论血液中miRNA-96、miRNA-34a及miRNA-335表达水平与冠心病患者病情严重程度及凝血功能密切相关,可作为辅助诊断冠心病患者的敏感指标。     

肾上腺髓质素和转化生长因子β_1对肺成纤维细胞增殖及c-myc表达的影响

目的探讨肾上腺髓质素(adrenomedullin,AM)对转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)促肺成纤维细胞增殖及c-myc基因表达的影响。方法体外原代培养人胚肺成纤维细胞(human fetal lung fibroblasts,HFLFs),分为对照组、AM组、TGF-β1组和AM+TGF-β1组,采用MTT法观察各组光吸度(optical density,OD)值;各组提取细胞总RNA,采用反转录PCR观察c-myc基因mRNA表达情况。结果 AM+TGF-β1组HFLFs细胞培养24、48、72h时OD值(0.615±0.054、0.483±0.017、0.675±0.014)明显低于TGF-β1组(0.830±0.012、0.753±0.089、0.929±0.039)(P0.05),TGF-β1组HFLFs细胞培养72h时OD值(0.929±0.039)明显高于对照组(0.605±0.274)(P0.05),AM组HFLFs细胞培养24、48h时OD值(0.559±0.019、0.412±0.096)明显低于对照组(0.785±0.081、0.646±0.038)(P0.05);AM组c-myc mRNA相对表达量(0.450±0.025)明显低于对照组(P0.01);TGF-β1组c-myc mRNA相对表达量(1.160±0.100)高于对照组(P0.05);AM+TGF-β1组c-myc mRNA相对表达量(0.340±0.030)低于TGF-β1组(P0.01)。结论 AM能抑制肺成纤维细胞增殖和c-myc基因表达,AM可能具有抗纤维化作用。     

miRNA-198表达异常与难治性糖尿病溃疡的相关性研究

目的探讨miRNA-198表达异常与难治性糖尿病溃疡的相关性。方法选取在内蒙古医科大学附属医院就诊的48例2型糖尿病并发慢性难治性溃疡的患者作为溃疡组,同期选取该院新诊断的65例2型糖尿病无任何急、慢性并发症患者作为单纯糖尿病组,另选取65例健康者作为健康组。测定并比较各组研究对象血中miRNA-198水平,对miRNA-198表达水平与难治性溃疡之间潜在相关性及其影响因素进行分析。结果溃疡组受试者外周血miRNA-198表达水平为(2.67±0.42)Ct,高于单纯糖尿病组的(2.43±0.42)Ct,差异有统计学意义(P0.05),健康组为(2.43±0.21)Ct。多因素回归分析发现,miRNA-198表达水平增高可以增加患糖尿病难治性溃疡风险(OR值为1.679,P0.01);超重/肥胖、高血压现病史以及高血压和糖尿病家族史都可以增加患糖尿病难治性溃疡的风险(OR值分别为1.242、1.317、1.094、1.176,P0.01)。结论 miRNA-198的水平与难治性糖尿病溃疡之间存在相关性,miRNA-198在外周血中的表达增高存在于难治性糖尿病溃疡的病理过程之中,影响了伤口的正常愈合。