联合抑制Notch2和MEK/ERK通路对胃癌细胞增殖的影响

目的探讨Notch2和MEK/ERK信号通路在胃癌细胞SGC-7901中是否存在交叉作用。方法采用体外化学合成的特异性针对Notch2的siRNA(Notch2siRNA)和丝裂原激活蛋白激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路的抑制剂PD98059,分别单独和联合处理体外培养的胃癌SGC-7901细胞,以转染阴性对照siRNA(control siRNA)细胞作为siRNA对照组,并设不给予任何转染的空白对照组。免疫印迹(Western Blotting)法检测磷酸化ERK1/2(p-ERK)1/2和Notch2蛋白的表达水平。比色法(MTT)检测癌细胞增殖抑制率。结果Notch2siRNA能降低蛋白Notch2的表达水平,并抑制癌细胞增殖[(38.26±1.82)%],而p-ERK的表达水平则较对照组增加。PD98059能降低p-ERK的表达水平,并抑制癌细胞的增殖[(30.05±3.16)%],Notch2水平则无明显变化,联合应用Notch2siRNA和PD98059能明显降低p-ERK和Notch2蛋白的表达水平,与Notch2siRNA或PD98059单独应用比较,显著抑制癌细胞增殖率,差异有统计学意义[(72.55±5.30)%,P0.01]。结论特异性抑制Notch2信号通路,且抑制MEK/ERK通路可进一步增强抑制Notch2通路的抗肿瘤增殖效果,提示MEK/ERK和Notch2 2条信号通路在胃癌SGC-7901细胞中存在交叉作用。     

慢性高原病患者骨髓有核红细胞Bcl-2家族基因表达研究

目的研究慢性高原病(CMS)患者骨髓有核红细胞凋亡家族相关基因Bcl-2、Bcl-xl、Bax mRNA表达水平及临床意义。方法采用流式细胞术检测26例CMS患者(CMS组)和26例体检健康者(对照组)骨髓CD71+有核红细胞凋亡率,实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)法检测Bcl-2、Bcl-xl、Bax等凋亡相关基因mRNA表达水平,并分析CMS患者血红蛋白(Hb)与骨髓有核红细胞凋亡率及凋亡相关基因的相关性。结果CMS组骨髓CD71+有核红细胞凋亡率为2.40%,对照组骨髓CD71+有核红细胞凋亡率为2.30%,两组比较差异无统计学意义(t=0.409,P=0.686);CMS组骨髓CD71+有核红细胞中Bax mRNA表达水平较对照组下降(0.71±0.01 vs.1.00±0.05),两组比较差异有统计学意义(t=13.866,P0.05);CMS组与对照组相比Bclxl、Bcl-2mRNA表达水平差异无统计学意义(P0.05);CMS患者外周血Hb、骨髓CD71+有核红细胞凋亡率与Bax mRNA间无明显相关性(P0.05)。结论虽然CMS组与对照组相比骨髓CD71+有核红细胞凋亡率比较差异无统计学意义,但CMS组促凋亡基因Bax mRNA表达水平较对照组明显下降,提示骨髓CD71+有核红细胞凋亡可能参与CMS疾病的发病机制。     

辛伐他汀通过MEK/ERK信号转导通路上调突触素表达

目的研究辛伐他汀(SV)对体外培养大鼠大脑皮层神经元突触素(SYP)的影响及信号转导机制。方法从新生Sprague-Dawley大鼠大脑皮层分离和培养神经元,4 d后分为对照组、SV处理组(2、4、8μmol/L作用48 h)、PD98059处理组和SV+PD98059处理组(先加入10μmol/L阻断剂PD98059作用30 min,再加入10μmol/L SV作用48 h)。应用免疫荧光检测法检测SYP表达,Western blot检测磷酸化丝裂原细胞外激酶(p-MEK)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶1(p-ERK1)和磷酸化细胞外调节蛋白激酶2(p-ERK2)水平。结果免疫荧光检测显示,4μmol/L SV可明显增强SYP免疫反应性。Western blot检测显示,8μmol/L SV可显著增高SYP、p-MEK、p-ERK1和p-ERK2水平。应用PD98059可显著降低SV引起的SYP、p-MEK、p-ERK1和p-ERK2水平上调。结论SV可通过激活MEK/ERK信号转导通路上调SYP表达。     

PD98059对高原红细胞增多症患者骨髓CD71~+、CD235a~+有核红细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究Ras/Raf/MEK/ERK信号通路蛋白激酶MEK特异性抑制剂PD98059对高原红细胞增多症(HAPC)患者骨髓CD71~+、CD235a~+有核红细胞增殖和凋亡影响及HAPC发病机制。方法:采用免疫磁珠法分选16例HAPC患者及16例对照者骨髓CD71~+、CD235a~+有核红细胞,分别加入5、10和20μmol/L不同浓度PD98059及DM SO溶剂,低氧培养72 h,以Annexin V和PI双染流式细胞术测定细胞凋亡,CCK8检测细胞增殖。同时观察加入5、10和20μmol/L等不同浓度PD98059及DMSO溶剂对骨髓单个核细胞(BMMNC)红系集落形成能力。结果:HAPC患者骨髓CD71~+、CD235a~+有核红细胞凋亡率随PD98059浓度增加上升(r=0.807,P0.01);增殖率随PD98059浓度增加而下降(r=0.502,P0.01)。HAPC患者骨髓BM M NC红系集落形成率随PD98059浓度增加而下降(r=0.504,P0.01),7和14 d时各组比较均有统计学差异(P0.05)。结论:M EK特异性抑制剂PD98059对HAPC患者CD71~+、CD235a~+有核红细胞具有抑制增殖、促进凋亡作用,对红细胞过度积累有一定的抑制作用。     

MEK/ERK信号通路在环磷酰胺诱导的白细胞减少症模型大鼠造血功能中的作用研究

目的探讨丝裂原活化蛋白激酶激酶/细胞外信号调节激酶(MEK/ERK)信号通路在环磷酰胺诱导的白细胞减少症模型大鼠造血功能中的作用。方法采用随机数字表法将60只SD大鼠分为ARRY-162组、模型组和空白对照组。ARRY-162组和模型组连续3 d腹腔注射环磷酰胺30 mg/(kg·d)造模,对照组注射等体积生理盐水。自造模当天起,ARRY-162组给予ARRY-1623 mg/(kg·d)尾静脉注射,模型组和对照组给予生理盐水尾静脉注射处理。连续干预7 d,采用全自动分析仪分析外周血白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)、网织红细胞(REC)数量,苏木素-伊红(HE)染色观察骨髓组织病理改变,流式细胞仪检测骨髓细胞凋亡情况,蛋白免疫印迹分析Bax、Bcl-2、MEK1/2、ERK1/2蛋白表达情况。结果与对照组比较,模型组大鼠外周血WBC、RBC、PLT数量及REC比率均显著减少,差异有统计学意义(P0.05);骨髓组织增生程度低,造血细胞减少,现大量脂肪组织增生,造血组织结构被破坏;骨髓细胞凋亡率明显升高(P0.05);骨髓组织Bcl-2蛋白水平显著降低,Bax、p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白水平明显增高(P0.05)。与模型组比较,ARRY-162组大鼠外周血WBC、RBC、PLT数量及REC比率均明显增多(P0.05);骨髓细胞凋亡率明显降低(P0.05);骨髓组织增生明显好转,组织损伤程度减轻;骨髓组织Bcl-2蛋白水平显著升高,Bax、p-MEK1/2、pERK1/2蛋白水平明显降低(P0.05)。结论 MEK/ERK信号通路在环磷酰胺诱导的白细胞减少症大鼠的造血功能下降中具有重要作用,MEK抑制剂ARRY-162可有效改善白细胞减少症大鼠的造血功能。     

抑制ERK1途径对支气管上皮细胞谷氨酰半胱氨酸合成酶表达的影响

目的探讨抑制ERK1传导路径对支气管上皮细胞谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)合成的影响。方法用4-羟基壬烯醛(4-HNE)做刺激原,分为10μmol/L4-HNE、50μmol/LPD98059(MEK1抑制剂)孵育+10μmol/L4-HNE、正常对照组分别作用支气管上皮细胞0.5、2、4、8、12h后,检测细胞γ-GCSmRNA和蛋白的表达水平;10μmol/L4-HNE刺激细胞0.5、2、4、8、12h后,检测磷酸化JNK、P38MAPK、ERK1/2、活化蛋白-1(AP-1)活性;观察MEK1抑制剂PD98039对AP-1结合活性的影响。结果 10μmol/L4-HNE、50μmol/LPD98059孵育+10μmol/L4-HNE、正常对照组2、4、8、12h,细胞γ-GCS和γ-GCSmRNA表达三组差异有统计学意义,50μmol/LPD98059孵育+10μmol/L4-HNE较其他两组增加。10μmol/L4-HNE刺激0.5、2、4、8、12h组细胞磷酸化ERK1/2水平,AP-1结合活性较对照组增强。PD98059孵育后,4-HNE作用0.5、2、4、8、12h后,AP-1结合活性较未用PD98059孵育4-HNE刺激组降低。结论 MEK1抑制剂PD98059可以抑制支气管上皮细胞16-HBE细胞内ERK1-AP1信号传导通路,对4-HNE引起支气管上皮细胞γ-GCS合成有促进作用,阻断AP-1途径后支气管上皮细胞并不能减少γ-GCS的表达。     

抑制ERK增强白血病和卵巢癌耐药细胞系化疗敏感性

为了研究细胞外调节蛋白激酶(extracelluar regulated protein kinases，ERK)和端粒酶在白血病和卵巢癌细胞耐药中的作用，应用流式细胞术检测细胞凋亡率，应用端粒重复序列扩增法(TRAP)和生物发光分析法去除检测端粒酶活性，应用Weestern blot法检测磷酸化ERK1/2蛋白(ERK1和ERK2)表达水平。结果表明：ERK激酶1(MEK1)特异性抑制剂PD98059能增强HL-60／E6细胞对三尖杉酯碱(HRT)的敏感性，PD98059也能增强COCl／DDP细胞对顺铂(DDP)的敏感性。PD98059与化疗药物HRT和DDP均可以降低细胞内磷酸化ERK表达，抑制端粒酶活性，但PD98059与化疗药物的联合作用明显强于其各自的单独作用。结论：通过阻抑ERK通路，降低磷酸化ERK1/2蛋白表达水平，进而下调端粒酶活性，可以达到增强白血病和卵巢癌耐药细胞对HRT或DDP敏感性的目的。     

碱性成纤维细胞生长因子对人涎腺腺样囊性癌ACC-2细胞株增殖及MEK/ERK、MKP-1通路的影响

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)对人涎腺腺样囊性癌ACC-2细胞株增殖及MEK1/2、ERK1/2及MKP-1表达的影响。方法:培养人涎腺腺样囊性癌细胞株(ACC-2),MTT比色法测定不同浓度bFGF对细胞增殖的影响;免疫沉淀法纯化蛋白并ERK试剂盒测定ERK活性;免疫印迹法测定p-MEK1/2、p-ERK1/2及MKP-1表达。结果:MTT实验显示bFGF明显增强ACC-2细胞增殖,免疫沉淀法显示bFGF上调ERK活性,免疫印迹法显示bFGF明显增强p-MEK1/2、p-ERK1/2表达及抑制MKP-1表达。结论:bFGF可促进人涎腺腺样囊性癌ACC-2细胞株增殖,其途径与上调ERK活性、激活MEK/ERK通路、抑制MKP-1表达有关。     

ERK1/2通过调控NADPH氧化酶和线粒体分裂在结肠炎中的作用

目的 研究细胞外信号调节激酶1和2(ERK1/2)通过调控NADPH氧化酶（Nox）和线粒体分裂在结肠炎中的作用。方法 3%葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导小鼠急性结肠炎。将30只C57BL/6J小鼠用随机数表法分为6组：Control组、3%DSS组、1%二甲亚砜（DMSO）组、ERK1/2抑制剂（PD98059）组、3%DSS+1%DMSO组、3%DSS+PD98059组，每组5只。评估Control组和3%DSS组小鼠体重变化、结肠长度改变、疾病活动指数和结肠组织病理学改变，检测小鼠结肠黏膜ERK1/2、磷酸化（p）-ERK1/2、Nox1和Nox2表达水平。1%DMSO组、3%DSS+1%DMSO组给予腹腔注射1%DMSO;PD98059组、3%DSS+PD98059组小鼠给予腹腔注射PD98059。评估4组小鼠结肠组织病理学改变，检测Nox1、Nox2、动力相关蛋白1(DRP1)、p-DRP1-S616和p-DRP1-S637等线粒体分裂相关蛋白表达水平的改变。透射电镜观察Control组和3%DSS组小鼠结肠上皮细胞线粒体分裂情况。免疫荧光双染分析2组小鼠结肠黏膜中Nox2与线粒...     

IPL对TGF-β1介导成纤维细胞增殖的影响及ERK抑制剂作用

目的探讨强脉冲光(IPL)照射对TGF-β1介导的成纤维细胞增殖及细胞外ERK表达的影响。方法利用包皮组织(包皮环切获得)体外分离培养原代成纤维细胞。实验分为两个部分:第一部分:使用不同浓度的TGF-β1,即0ng/ml、0.01ng/ml、0.1ng/m1、1.0ng/ml、10.0ng/ml及50.0 ng/ml分别处理成纤维细胞。(2)第二部分:按照下列情况分组:TGF-β11.0ng/ml组、10.0ng/ml组、 PD98059+72J/cm2组、PD98059+TGF-β110.0ng/ml组、PD98059+72J/cm2+TGF-β110.0ng/ml组、IPL72J/cm2组、IPL 72J/cm2+TGF-β110.0ng/ml组、阴性对照组,处理细胞后采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组细胞增殖情况、采用Western Blot法测定p-ERK的变化。结果第一部分:不同浓度的TGF-β1分别处理24及48小时后,与未照射组比较, TGF-β1浓度为10.0ng/ml时,细胞增殖活性显著增高(P0.05)。第二部分:与阴性对照组相比:IPL 72J/cm2组和72J/cm2+TGF-β110ng/ml组成纤维细胞增殖活性明显增加(P0.01),但PD98059+TGF-β110ng/ml及PD98059+72J/cm2较对照组细胞增殖活性减少(P0.05);各组p-ERK表达水平较对照组均有增加,但与72J/cm2组比较,加入PD98059的组其p-ERK表达均有降低。结论体外实验证实强脉冲光及TGF-β1可促进成纤维细胞增殖活性,其机制可能是通过ERK信号通路介导完成。     

妊娠期糖尿病脂肪细胞转染网膜素1对葡萄糖摄取率的影响及MEK/ERK通路蛋白的参与研究

目的分析妊娠期糖尿病脂肪细胞转染网膜素1对葡萄糖摄取率的影响及MEK/ERK通路蛋白的参与作用。方法构建网膜素1过表达载体转染传代脂肪细胞,分析不同转染浓度(0μg、1.0μg、2.0μg、4.0μg)脂肪细胞的葡萄糖摄取率。采用荧光定量PCR法、Western Blotting法和免疫细胞化学法分析MEK/ERK通路蛋白的表达变化。结果不同网膜素1转染浓度对脂肪细胞葡萄糖摄取率和MEK/ERK通路蛋白及IRS水平有明显影响,且随着网膜素1转染浓度的升高,葡萄糖摄取率逐渐升高(P0.05),MEK、ERK1/2蛋白(P0.05)、mRNA(P0.05)水平逐步降低,而IRS-1蛋白水平明显升高(P0.05)。结论妊娠期糖尿病脂肪细胞转染网膜素1后细胞的葡萄糖摄取率及IRS明显升高而MEK/ERK通路蛋白表达降低,表明网膜素1过表达和MEK/ERK通路蛋白被抑制与葡萄糖葡萄糖摄取和胰岛素抵抗密切相关。     

外源性一氧化氮调控MEK/ERK信号通路促进胃溃疡大鼠黏膜修复的实验观察

目的观察外源性一氧化氮(NO)通过调控丝裂原细胞外信号调节激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路促进胃溃疡(GU)大鼠黏膜修复作用。方法取40只大鼠以冰醋酸法建立GU大鼠模型,并将其随机分为模型组、低、中、高剂量组,另取10只大鼠注射生理盐水,设为对照组。术后低、中、高剂量组腹腔注射NO外源性供体硝普钠(SNP) 2 mg/kg、4 mg/kg、6 mg/kg,对照组和模型组腹腔注射等体积生理盐水,2次/d,连续3 d。第4天处死大鼠,进行组织病理学观察,对比溃疡面积、溃疡抑制率,并对比表皮生长因子受体(EGFR)、大鼠肉瘤相关因子(Raf)、MEK、ERK mRNA相对表达量、磷酸化EGFR(pEGFR)/EGFR、磷酸化Raf(pRaf)/Raf、磷酸化MEK(pMEK)/MEK、磷酸化ERK(pERK)/ERK及紧密连接蛋白1(ZO-1) mRNA和蛋白相对表达量。结果组织病理学观察发现,3剂量组炎性细胞浸润程度较模型组减轻,且中剂量组减轻程度最为明显;溃疡面积组间比较,中剂量组最低、低、高剂量组其次、模型组最高,除低、高剂量组比较差异无显著性(P 0. 05)外,每两组间比较差异有显著性(P 0. 05),中剂量组溃疡抑制率显著高于低、高剂量组(P 0. 05),低、高剂量组溃疡抑制率比较无显著性(P 0. 05);溃疡组织EGFR、Raf、MEK、ERK mRNA相对表达量、pEGFR/EGFR、pRaf/Raf、p MEK/MEK、pERK/ERK及ZO-1 mRNA和蛋白相对表达量组间比较,对照组最高、中剂量组其次、低、高剂量组稍高、模型组最低,除低、高剂量组比较无显著性(P 0. 05)外,每两组间比较差异均有显著性(P 0. 05)。结论外源性NO供体SNP可促进GU大鼠黏膜修复,其中4 mg/kg的SNP促进效果最佳,推测与上调EGFR、Raf、MEK、ERK mRNA,ZO-1 mRNA和蛋白相对表达量,pEGFR/EGFR、pRaf/Raf、pMEK/MEK、pERK/ERK,激活MEK/ERK信号通路有关。     

ERKl／2信号通路在高糖诱导的HK-2上皮间质转分化中的作用

目的：观察高糖诱导的细胞外信号调节激酶（ERK1/2）信号通路活化在上皮间质转分化中的作用,从而探讨延缓糖尿病肾病肾间质纤维化的发生机制。方法体外培养HK-2细胞,随机分为正常对照组、高糖组、ERK1/2通路抑制剂PD98059＋高糖组和高渗组,处理72 h后收集细胞,应用免疫细胞化学方法检测α-SMA、CK18的表达;应用Western blot法检测磷酸化ERK1/2、总ERK1/2表达水平的变化。结果（1）正常对照组胞质有大量CK18蛋白阳性表达,而α-SMA蛋白表达呈阴性;高糖组胞质中可见大量α-SMA蛋白强阳性染色,而CK18蛋白呈阴性表达;经PD98059处理后,CK18表达较高糖组染色深,而α-SMA表达较高糖组染色浅;高渗组胞质中CK18呈阳性表达,α-SMA表达呈阴性。（2）正常对照组可见少量总ERK1/2表达,p-ERK1/2蛋白仅有微量表达;经高糖刺激48 h后,总ERK1/2表达较正常对照组无明显差异,p-ERK1/2蛋白表达明显增加（P＜0.05）;而使用PD98059处理后,总ERK1/2的变化不大,但p-ERK1/2蛋白的表达却显著降低（P＜0.05）;高渗组与正常对照组无显著差异。结论 ERK1/2信号通路可能参与了高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞（HK-2）转分化过程,阻断 ERKl/2可部分抑制人近端肾小管上皮细胞的转分化,进而延缓肾小管间质纤维化的发生和发展。     

针康法对脑缺血大鼠神经功能和细胞外信号调节激酶1/2信号通路的影响

目的探讨针康法对脑缺血大鼠神经功能预后和细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)信号通路的影响。方法 90只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分入假手术组(n=18)、模型组(n=18)、针刺组(n=18)、康复组(n=18)及针康组(n=18),再分为术后3 d、7d、14 d三个亚组(n=6)。线栓法制备永久性局灶性脑缺血模型。假手术组和模型组不进行治疗,针刺组采用头穴丛刺针法治疗,康复组给予电动跑台训练,针康组采用针康法治疗。各时间点,采用改良神经损害严重程度评分进行评定,Western blotting法检测缺血半暗区皮层ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达。结果术后各时间点,与模型组比较,各治疗组神经缺损评分降低(P0.05);术后7 d、14 d,与针刺组、康复组比较,针康组评分降低(P0.05)。术后各时间点,与模型组比较,各治疗组p-ERK1/2蛋白表达增加(P0.05),(p-ERK1/2)/(ERK1/2)增加(P0.05);与针刺组、康复组比较,针康组p-ERK1/2蛋白表达升高(P0.05),(p-ERK1/2)/(ERK1/2)增加(P0.05)。结论针康法治疗可进一步改善脑缺血大鼠神经行为,可能与ERK1/2信号通路激活有关。     

脑源性神经营养因子通过AKT和ERK1/2信号通路诱导内皮细胞血管生成

本研究探讨脑源性神经营养因子（BDNF）促进血管新生的作用及其参与的信号通路,为抗肿瘤血管生成的研究提供新的实验依据。以人脐静脉内皮细胞为对象,采用Western blot方法检测细胞内磷酸化Akt、ERK1/2蛋白质的表达;采用Transwell小室迁移实验和管腔形成实验评价体外内皮细胞血管新生的能力,MTT法检测内皮细胞增殖活性,FITC-Annexin-Ⅴ/PI双染流式细胞术分析细胞调亡。结果表明：BDNF以时间依赖性的方式激活PI3K/Akt和MEK1/ERK信号通路。应用PI3K激酶抑制剂Ly294002、MEK1激酶抑制剂PD98059可以明显阻断BDNF对PI3K/Akt、MEK1/ERK信号通路的激活。100ng/ml的BDNF体外促内皮细胞血管新生能力与25ng/ml血管内皮生长因子（VEGF）相当,其中BDNF诱导的细胞迁移分别被Ly294002和PD98059阻断,其抑制率分别约为74%和36%;同样,Ly294002、PD98059可部分阻断BDNF诱导的小管形成效应,其阻断率分别约57%和37%;而BDNF的促增殖效应仅被PD98059拮抗,抑制凋亡效应仅受Ly294002影响。结论：BDNF在体外有促血管新生的作用。PI3K/Akt和MEK1/ERK信号通路以不同机制共同调节这一过程,其中PI3K/Akt信号通路起着更为重要的调节作用。     

丙泊酚对大鼠海马ERK1/2磷酸化和c-fos mRNA表达水平的影响

目的探讨丙泊酚对大鼠海马ERK1/ERK2磷酸化和c-fos mRNA表达水平的影响。方法成年雄性SD大鼠64只,体重250-280 g,随机分为2组(n=32),丙泊酚组(P组)于训练前15 min腹腔注射丙泊酚9 mg/kg,容量2 ml/kg;生理盐水组(S组)注射等容量生理盐水。采用避暗箱实验测试大鼠认知功能。首先对大鼠进行训练,记录100 s内大鼠不再钻入暗室所需的训练次数。于训练结束后1、3、24 h(T1-3)时点记录大鼠在明室停留的时间即记忆潜伏期。各组于给药后15 min(T0)和T1-3记忆能力测试结束后,各断头处死8只大鼠,分离海马,测定ERK1/ERK2、磷酸化ERK1/ERK2(p-ERK1/ERK2)、c-fos mRNA的表达水平。结果与S组比较,P组大鼠不再钻入暗室所需的训练次数增加,T2和T3时记忆潜伏期缩短,T2,3时ERK1磷酸化水平降低,T0-3时ERK2磷酸化水平降低(P0.01),T0,3时海马c-fos mRNA表达水平无明显变化(P0.05),各时点海马ERK1、ERK2的表达差异均无统计学意义(P0.05)。结论丙泊酚可抑制大鼠海马ERK1/ERK2的磷酸化水平,对c-fos mRNA的表达尚不确定。     

丙泊酚对大鼠海马ERK1/ERK2和CREB磷酸化水平的影响

目的探讨丙泊酚对大鼠海马ERK1/ERK2和CREB磷酸化水平的影响。方法成年雄性SD大鼠64只,体重250-280 g,随机分为2组(n=32),丙泊酚组(P组)于训练前15 min腹腔注射丙泊酚9 mg/kg,容量2 ml/kg;生理盐水组(S组)注射等容量生理盐水。采用避暗箱实验测试大鼠认知功能。首先对大鼠进行训练,记录100 s内大鼠不再钻入暗室所需的训练次数。于训练结束后1、3、24 h(T1-3)时点记录大鼠在明室停留的时间即记忆潜伏期。各组于给药后15 min(T0)和T1-3记忆能力测试结束后,各断头处死8只大鼠,分离海马,测定ERK1/ERK2、磷酸化ERK1/ERK2(p-ERK1/ERK2)、CREB和磷酸化CREB(p-CREB)的表达水平。结果与S组比较,P组大鼠不再钻入暗室所需的训练次数增加,T2和T3时记忆潜伏期缩短,T2,3时ERK1磷酸化水平降低,T0-3时ERK2和CREB磷酸化水平降低(P0.01),各时点海马ERK1、ERK2和CREB的表达差异均无统计学意义(P0.05)。结论丙泊酚可抑制大鼠海马ERK1/ERK2和CREB的磷酸化水平。     

柿叶提取物通过MAPK/ERK1/2通路减轻心肌缺血再灌注损伤

目的探讨柿叶提取物(PEL)减轻心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的作用机制。方法健康雄性SD大鼠随机分为假手术组、心肌缺血再灌注损伤组(MIRI组)、柿叶提取物组(PEL组)、MAPK抑制剂组、MAPK抑制剂+PEL组。采用结扎大鼠冠状动脉左前降支30 min后再灌注60 min建立心肌缺血再灌注模型。PEL组大鼠灌胃50 mg/(kg·d)柿叶提取物,MAPK抑制剂组大鼠尾静脉注射PD0325901; MAPK抑制剂+PEL组大鼠灌胃50 mg/(kg·d)柿叶提取物前30 min尾静脉注射PD0325901。假手术组和MIRI组灌胃等量生理盐水。每天相同时间给药1次,连续给药21 d。全自动生化分析仪检测血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)水平,试剂盒检测心肌组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平,TUNEL法检测心肌细胞凋亡率,采用1%氯化三苯基四氯唑测定心肌梗死面积,Western Blot检测心肌组织中Bcl-2、Bax和p-ERK1/2蛋白表达。结果与假手术组比,MIRI组大鼠血清AST和CK含量、心肌细胞凋亡率、心肌梗死面积,心肌组织MDA和LDH含量、Bax蛋白表达均显著升高(P 0. 05),心肌组织SOD和GSH-Px活力、Bcl-2和p-ERK1/2蛋白表达显著降低(P0. 05)。与MIRI组比,PEL组和MAPK抑制剂+PEL组大鼠血清AST和CK含量、心肌细胞凋亡率、心肌梗死面积、心肌组织MDA和LDH含量、Bax蛋白表达均显著降低(P 0. 05),心肌组织SOD和GSH-Px活力、Bcl-2和pERK1/2蛋白表达均显著升高(P 0. 05); MAPK抑制剂组无显著差异(P 0. 05)。与MAPK抑制剂组比,MAPK抑制剂+PEL组血清AST和CK含量、心肌细胞凋亡率、心肌梗死面积、心肌组织MDA和LDH含量、Bax蛋白表达均显著降低(P 0. 05),心肌组织SOD和GSH-Px活力、Bcl-2和p-ERK1/2蛋白表达显著升高(P 0. 05)。结论 PEL可能通过激活MAPK/ERK1/2信号通路减轻心肌缺血再灌注损伤。     

ERK1/2信号传导通路介导碱性成纤维细胞生长因子诱导人晶状体上皮细胞中环氧合酶2的表达

背景：碱性成纤维细胞生长因子在各种白内障形成中都起着重要的作用,可促进晶状体上皮细胞的增殖并化生为纤维细胞,但其信号通路尚不清楚。目的：探讨ERK1/2信号转导通路在碱性成纤维细胞生长因子诱导的人晶状体上皮细胞环氧合酶2表达中的作用。方法：使用10μg/L的碱性成纤维细胞生长因子干预培养的人晶状体上皮细胞0,1,3,6,12,24h,RT-PCR检测刺激不同时间人晶状体上皮细胞环氧合酶2mRNA的表达,Western blot检测细胞中环氧合酶2及磷酸化ERK1/2的表达。在阻断实验中应用特异性ERK1/2的阻断剂PD98059阻断ERK信号转导通路1h,再用10μg/L碱性成纤维细胞生长因子刺激细胞6h,Western blot检测细胞中环氧合酶2的表达。结果与结论：碱性成纤维细胞生长因子刺激后的人晶状体上皮细胞中环氧合酶2mRNA及其蛋白的表达显著增加（P〈0.01）,同时碱性成纤维细胞生长因子诱导人晶状体上皮细胞磷酸化ERK1/2活性增强,表达水平随作用时间而增加,30min时达到最高峰（P〈0.01）,6h后恢复至基线水平;PD98059可抑制人晶状体上皮细胞环氧合酶2的表达（P〈0.01）。说明ERK1/2信号转导通路参与了碱性成纤维细胞生长因子诱导的人晶状体上皮细胞中环氧合酶2的表达,在后发性白内障的形成过程中起着重要作用。     

透骨消痛胶囊调节Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路抑制骨关节炎炎症反应的机制研究

目的:探讨透骨消痛胶囊调节Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路抑制骨关节炎炎症反应的作用机制。方法:取4周龄SD雄性大鼠的双侧膝关节软骨,经Ⅱ型胶原酶消化法获得大鼠软骨细胞,并采用Ⅱ型胶原免疫组化法对所得细胞进行鉴定;取第2代软骨细胞分为空白组、模型组(10 ng/mL LPS干预8 h)、抑制剂组(10 ng/mL U0126先干预30 min后再加入10 ng/mL LPS干预8 h)、透骨消痛胶囊组(10 ng/mL LPS+300μg/mL透骨消痛胶囊一同干预8 h)。采用Western blot检测软骨细胞中Ras、Raf、p-ERK1/2、MEK1/2、MMP-3和MMP-13蛋白表达,qPCR检测软骨细胞中MEK1/2、ERK1/2、MMP-3和MMP-13基因表达及miR-27b、miR-34a和miR-146a表达。结果:(1)软骨细胞经Ⅱ型胶原免疫组化处理后,阳性组细胞胞浆被染为棕黄色,阴性组不显色,表明所提取细胞为软骨细胞。(2)与空白组相比,模型组中Ras、Raf、MEK1/2、MMP-3和MMP-13蛋白表达明显升高(P0.01,P0.05),p-ERK1/2蛋白表达量也升高,但差异无统计学意义(P0.05);与模型组相比,抑制剂组与透骨消痛胶囊组Ras、Raf、MEK1/2、p-ERK1/2、MMP-3、MMP-13蛋白表达均下降(P0.01,P0.05);透骨消痛胶囊组与模型组相比,MEK1/2蛋白表达降低,但差异无统计学意义(P0.05)。(3)与空白组相比,模型组中MEK1/2、ERK1/2、MMP-3、MMP-13基因表达明显升高(P0.01);与模型组相比,透骨消痛胶囊组与抑制剂组上述基因表达均下降(P0.01,P0.05)。(4)模型组miR-27b的表达低于空白组(P0.01),抑制剂组、透骨消痛胶囊组miR-27b的表达高于模型组(P0.01);模型组miR-34a、miR-146a的表达均高于空白组(P0.01,P0.05),而抑制剂组、透骨消痛胶囊组均低于模型组(P0.01,P0.05)。结论:透骨消痛胶囊通过调控Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路中关键因子及miR-27b、miR-34a和miR-146a的表达,调节软骨细胞炎症反应,从而抑制骨关节炎炎症,保护关节软骨。