申克孢子丝菌随机扩增 DNA多态性研究

目的 了解申克孢子丝菌的基因学特征,研究DNA分型与菌种来源和临床表现的关系。方法 以随机扩增DNA多态性方法对来源于不同地区及不同临床类型的24株申克孢子丝菌进行DNA多态性分析。结果 （1）筛选出3个具有较好扩增征段的引物,即引物OPAA11：5′-ACCCGACCTG-3′,OPD18：5′-GAGAGCCAAC-3′,OPBO7:5′-GGTGACGCAG-3′。（2）24株菌的DNA带型不完全相同,具一定遗传变异性。（3）不同菌株同一引物扩增均见一共有DNA片段,（4）播散型DNA带型与皮肤淋巴管型不同,结论 随机扩增DNA多态笥方法可用于申克孢子丝菌的DNA分型,其带型与菌株的地区来源和临床表现有关。     

卡氏枝孢霉与阿耶罗枝孢瓶霉的随机扩增DNA多态性研究

研究卡氏枝孢霉与阿耶罗枝孢瓶霉的ＤＮＡ多态性，了解两菌在ＤＮＡ型别与形态学及菌种来源地域的相互关系。采用溴苯提取法提取ＤＮＡ，以随机扩增ＤＮＡ多态性方法对来自五个国家的２１株分离株（１９株卡氏枝孢霉，２株阿耶罗枝孢瓶霉）进行研究。结果：①１０个随机引物筛选出３个具有较好ＤＮＡ扩增的引物。②１９株卡氏枝孢霉的ＤＮＡ带型具有较大的遗传相似性，阿耶罗枝孢瓶霉的ＤＮＡ带型与卡氏枝孢霉略有不同，但与中国株具有较大相似性（８５％的遗传相似性）。③卡氏枝孢霉的遗传相似性与菌株的来源地域关系密切，同一国家的菌株具有相似的ＤＮＡ带型，位于树状图的同一树组中。结论：随机扩增ＤＮＡ多态性研究发现卡氏枝孢霉具有一定的种内差异，其ＤＮＡ带型与菌株的来源地域关系密切，阿耶罗枝孢瓶霉的ＤＮＡ带型与某些株卡氏枝孢霉更相似。本研究方法简便、快速，可用于流行病学及基因学特征的研究     

从花斑糠疹皮损分离的马拉色菌随机扩增多态性DNA研究

目的 用随机扩增多态性DNA方法研究分离自花斑糠疹的马拉色菌种间和株间差异,了解随机扩增多态性DNA分析（RAPD）与生理生化方法在菌种分型上的差异及菌株DNA型别和菌种间的关系。方法 用氯化苄法提取马拉色菌标准株（10株7个种）和临床分离株（47株）的基因组DNA,其中临床株分离自34例花斑糠疹患者,经形态学和生理生化方法鉴定为5个种（合轴马拉色菌、糠秕马拉色菌、钝形马拉色菌、球形马拉色菌、限制马拉色菌）,用4种随机引物（S22、S24、S25、S33）对菌株DNA做PCR随机扩增,NTSYS软件自动生成树状分支图。结果 绝大多数标本均可被4种引物扩增而获得清晰条带,其中2种引物（S22、S24）的条带更为稳定、清晰。共82条DNA片段被扩增,所有菌株均可见种间和株间多态性。有4例患者皮损同时分离出不同种的菌株显示遗传相似性高,在树状图中归入一类。结论 来自同一宿主的不同菌株遗传趋同现象提示马拉色菌的种特异性、菌种演化与宿主间存在密切关系。     

申克孢子丝菌基因型与临床表现型关系研究

目的了解申克孢子丝菌的基因学特征，探索其基因型特征与临床表现型的关系。方法收集不同临床型别孢子丝菌病的申克孢子丝菌分离株并提取DNA，再用随机扩增DNA多态性方法（RAPD）进行PCR扩增。结果①共选用10个随机引物进行扩增，筛选出4个具有较好扩增片段的引物。②不同菌株同-引物扩增均见-共有DNA片段。③不同临床型孢子丝菌病的申克孢子丝菌分离株带型有差异。结论随机扩增DNA多态性研究发现申克孢子丝菌具有一定的种内差异，其DNA带型与菌株的临床型有关。     

红色毛癣菌基因型稳定性的研究

目的探讨红色毛癣菌基因型的稳定性。方法采用随机引物PCR法和探针与DNA印迹杂交法。以CTAB法提取DNA。随机引物为OPAA11[5-′ACCCGACCTG-3′],印迹法以NS5和ITS4(真菌的特异性引物)为引物,以红色毛癣菌的标准株为模板,扩增出rDNA的部分18S区、ITSⅠ区、5.8S区和ITSⅡ区为探针,并用随机引物法将探针用P32标记,与EcoRⅠ酶切的基因组DNA杂交。结果①AP-PCR法:红色毛癣菌扩增的主要带型是2.2,1.7,1.3,0.9,0.7 kb,所试红色毛癣菌传代前后扩增带型均无变化。②探针与DNA印迹杂交法:原代(1代)与传代后的(2,3,4代)杂交带型一致,11株红色毛癣菌均表现为3条带,分两型(分子量分别为2.4,3.9,5.9 kb和2.4,4.4,6.5 kb)。结论红色毛癣菌基因型稳定。     

12株马内菲青霉随机扩增DNA多态性研究

目的 了解马内菲青霉的基因学特征,为该菌的DNA分型提供依据。方法 采用氯化苄提取法提取基因组DNA.用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对12株临床分离的马内菲青霉菌株进行DNA指纹图谱分析。结果 ①共选用40个随机引物进行扩增,筛选出4个具有稳定、清晰DNA扩增带型的引物。即引物P₂₃:5'-AGTCAGCCAC-3',P₁₀₃:5'-AGACGTCCAC-3',P₁₀₅:5'-AGTCGTCCCC-3',P₁₂₀:5'-GGGAGACATC-3'.②12株菌株DNA图谱主要带型相同,扩增片段呈多态性。相似率44.4%～97.3%.③12株菌可分5个不同的组群。结论 RAPD技术可以用于马内菲青霉的基因分型。     

红色毛癣菌的基因分型研究

目的 探讨探针与DNA印迹杂交法对红色毛癣菌的基因分型并分析其基因型与来源地区的相关性。方法 用溴化十六烷基三甲铵（CTAB）法提取DNA，以皮肤癣菌的特异性引物NS5[5′-AACTAAAGGAATTGACGGAAG-3′]与ITS4[5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′]为引物，以红色毛癣菌的标准菌株为模板，用PCR法扩增出其rDNA部分18S区，ITSI区，5.8S区和ITSⅡ区为探针，用随机引物法将探针标记^32P，用EcoRI酶切基因组DNA，采用DNA印迹的标准流程将酶切的基因组DNA与探针杂交；显示的不同带型，以此作为红色毛癣菌基因分型的依据。结果 所试49株红色毛癣菌（南京21株，大连26株，北京2株）分为20型（A-T型），其中A-C型占48.98%。南京株绝大多数为3条带，大连株大部分为4条带。结论 用ITS区域探针与DNA印迹杂交法对红色毛癣菌基因组分型敏感性强，分辨力高；南京与大连两地区红色毛癣菌DNA分型具有明显差异，DNA分型对红色毛癣菌病的流行病学，临床疗效的判定以及指导用药均具有重要价值。     

不同地区申克孢子丝菌基因分型研究

目的:探讨申克孢子丝菌基因分型特征与菌种来源的关系。方法:采用随机扩增DNA指纹方法(RAPD)对来源于不同地区的31株申克孢子丝菌临床分离株进行DNA多态性分析。结果:①筛选出4个具有较好扩增片段的引物。②31株菌的DNA带型不完全相同,具有一定的遗传变异性,与菌株的地区来源有关。③同一患者不同部位取材的菌株间DNA型可不同。结论:随机扩增DNA多态性方法可用于申克孢子丝菌的DNA分型,其DNA带型与菌株的地区来源有关。     

任意引物聚合酶链反应对致病性地霉株间分型的鉴定

目的采用任意引物聚合酶链反应(AP-PCR)对部分致病性地霉进行分子生物学方面的鉴定。方法用E.Z.N.A.YeastDNA Kit提取地霉菌基因组DNA,采用任意引物S034(5′-TCTGTGCTGG-3′),S040(5′-GTTGCGATCC-3′),S167(5′-CAGCGACAAG-3′),S368(5′-GAACACTGGG-3′)对临床上致病性白地霉、林生地霉皮损株和血液株的基因组DNA进行扩增,对各病原菌的DNA指纹的特征进行分析。结果扩增产物电泳分析发现不同种真菌的DNA经扩增后显示不同的DNA带型,尤其是使用引物S040,S167和S368扩增产生的DNA带型种间差异较明显;分离自不同感染部位的同种不同株真菌的DNA经扩增后显示的主要DNA带型也有明显差异,如使用引物S040和S368扩增产生的DNA带型种内差异较明显。结论以任意引物S034,S040,S167,S368为基础的AP-PCR技术可作为临床上致病性地霉的种间及种内鉴定的简单、快速、可靠的方法。     

应用AP-PCR鉴定浅部真菌病病原菌菌种

目的研究应用任意引物聚合酶链反应(AP-PCR)对浅部真菌病病原菌进行分子生物学鉴定的意义。方法应用OPAA11(5′-ACCCGACCTG-3′),OPAA17(5′-GAGCCCGACT-3′),OPD18(5′-GAGAGC-CAAC-3′)和OPU15(5′-ACGGGCCAGT-3′)四种随机引物,随机扩增从浅部真菌病患者的皮屑或甲屑标本中提取的真菌DNA。结果从各标本提取所得的红色毛癣菌、许兰毛癣菌、紫色毛癣菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣菌及石膏样小孢子菌DNA经OPAA11,OPAA17,OPD18或OPU15扩增后,产生的电泳带型在不同菌种间存在明显差异。结论 AP-PCR对于浅部真菌病病原菌的鉴定具有诊断价值。     

外阴阴道念珠菌病患者临床分离菌株的菌种及基因型分析

目的 探讨初发型、复发型外阴阴道念珠菌病患者及健康带菌者阴道分离的念珠菌菌种及菌株基因型与初发及复发的关系。方法 选择分别来自健康带菌者、外阴阴道念珠菌病患者和复发性外阴阴道念珠菌病患者。首先经菌种鉴定,然后用RAPD技术对来自3组人群的菌株进行基因分型。结果 临床分离株菌种鉴定结果为白念珠菌83株,非白念珠菌共14株。从9个随机引物中筛选出的2条引物(引物4和引物7)对初发组、复发组及健康带菌组分离株的扩增带型多数未表现出与菌株来源的联系,但少数菌株依来源不同表现出了一定区别。引物4和引物7可将来源于不同临床分型的97株菌及2株标准菌株分成19型和21型。结论 外阴阴道念珠菌病致病菌以白念珠菌为主,非白念珠菌中以光滑念珠菌为主。     

Genetic diversity among Trichophyton mentagrophytes isolates using random amplified polymorphic DNA method.

Trichophyton mentagrophytes is a common cosmopolitan dermatophyte species composed of two varieties: T. mentagrophytes var. interdigitale (anthropophilic form) and T. mentagrophytes var. mentagrophytes (zoophilic form). We used a random amplified polymorphic DNA (RAPD) method to study the genetic diversity of 46 clinical isolates of the T. mentagrophytes complex collected from 38 patients with different geographical origins (Europe, Africa, South America). The T. mentagrophytes were isolated either from a unique lesion for 31 patients, including two patients living together, or from at least two sites for seven patients. Only one primer of 15 primers tested showed DNA polymorphism in the isolates, producing 23 distinct patterns belonging to three clusters. There was no specific cluster grouping isolates from the same geographical origin. The same pattern is shared by all the four T. mentagrophytes var. mentagrophytes and 13 of 42 T. mentagrophytes var. interdigitale. An identity of strains responsible for several lesions in seven individuals suggests an homogeneous T. mentagrophytes population in the case of multiple lesions. In contrast, the dissimilarity of two strains recovered from two patients living together argues against person-to-person transmission in that case. This study indicates that RAPD can be successfully applied to show genetic diversity among T. mentagrophytes isolates.     

甲真菌病患者多部位红色毛癣菌感染分离株DNA同源性分析

目的 探讨甲真菌病患者多部位红色毛癣菌感染分离株基因型的差异。方法 采用PCR扩增红色毛癣菌rDNA非转录间隔区（NTS）中TRS1片段,并用随机引物OPAA11随机扩增DNA,检测基因多态性。比较同一患者不同感染部位分离菌株的基因型差异。结果 共分离30株红色毛癣菌,按照PCR扩增TRS1区指纹图分为5型,随机引物OPAA11扩增指纹图分为11型,基因型分布与感染部位关系不大。在10例受试患者中,PCR扩增TRS1区显示,7例不同感染部位分离得到的菌株基因型有差异;随机引物OPAA11扩增显示,8例不同感染部位分离得到的菌株基因型有差异。结论 甲真菌病患者不同部位红色毛癣菌感染可能为不同菌株引起,提示部分甲真菌病患者不同部位皮肤癣菌感染可能存在不同菌株的感染。     

淋球菌的RAPD基因分型研究

目的探索RAPD指纹图谱测量淋球菌临床分离株间的遗传距离,建立淋球菌基因分型方法。方法采用随机扩增多态性DNA技术,应用6组随机引物对待测淋球菌现场分离样本株的基因组DNA进行图谱分析,相似性距阵构建和进化树分析。结果同一地区的淋球菌分离株之间存在相当大的DNA多态性,但有一定亲缘关系。TreeV iew[w in32]统计软件分析结果也支持这一结果。结论RAPD可用于鉴别淋球菌临床分离株流行病学关联,是一种实用而敏感的分子技术,有助于了解菌株来源,菌株间的克隆相关性及抗生素耐药性菌株的传播特点。     

32株孢子丝菌临床株两种基因分型方法比较

目的 确定哪种孢子丝菌基因分型的方法分辨力更高,所分基因型与临床表现及地域分布相关性更好。方法 以32株不同地区及临床类型的孢子丝菌菌株为研究样本,分别进行mtDNA RFLP分型,基因组DNA RAPD分型和rDNA RFLP-Southern blotting杂交分型,并进行比较。结果 mtDNA-RFLP方法将受试菌株分为5型,分别对应Ishizaki等命名的1,4,6,7,20五种基因型;RAPD方法将受试菌株分为7种基因型（I-VII型）; rDNA RFLP-Southern blotting杂交方法将受试菌株分为15种基因型（A-O型）,且其所分基因型与菌株的南北方分布及临床表现有一定相关性。结论 三种孢子丝菌基因分型方法中,rDNA RFLP-Southern blotting杂交方法分辨力较高,所分基因型与临床表现及地域分布相关性更好。     

马拉色菌扩增DNA多态性研究

应用RAPD法对不同来源的马拉色菌进行DNA分型。结果发现47株马拉色菌临床分离株可分为6型,其DNA型别与孢子形态之间无绝然对应关系,不同地区的马拉色菌DNA带型之间似无明显差异。马拉色菌DNA型别与其所致临床病型之间无明显对应关系。但可能存着一定的优势关系。     

白念珠菌菌丝相随机扩增多态性DNA分析

目的　以白念珠菌菌丝相为研究对象 ,比较对氟康唑敏感程度不同的白念珠菌之间随机扩增多态性DNA(RAPD)图谱的差异。方法　用随机引物 5′ TCACCACGGT 3′对同一亲本来源的 16株白念珠菌菌丝相基因组DNA进行扩增 ,扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳并拍照。结果　菌株CA 1～CA 13的电泳带型一致 ,均有 6条电泳带 ;CA 14～CA 17的电泳带型一致 ,均有 7条电泳带 ;CA 14～CA 17比CA 1～CA 13多 1条约 45 0bp的电泳带。 结论　氟康唑耐药株白念珠菌菌丝相基因组DNA的RAPD图谱与氟康唑敏感菌株的有差异     

多发性红色毛癣菌病患者不同部位菌株的分子鉴定

目的 用形态学、生物化学和分子生物学方法鉴定和分析从一例多发性皮肤癣菌病患者6个患病部位分离的菌种和菌株相关性。方法 6个部位的分离株先用形态学和生化方法鉴定,再用PCR扩增ITS（内转录间隔区）经序列分析证实全为红色毛癣菌。利用红色毛癣菌特异的随机扩增多态性（RAPD）和串联重复亚单位1和2（Trs-1/Trs-2）的PCR扩增产物判断6菌株基因结构的异同。结果 RAPD可将6株红色毛癣菌分为5个带型。Trs-1扩增产物可将6株菌分为3个带型,并能区分RAPD未能区分的菌株。结论 用RAPD、Trs-1/Trs-2的PCR扩增发现此多发性红色毛癣菌病患者6个感染部位的菌株均不相同,提示同一患者感染的多源性和多克隆性。