阴道分离的念珠菌体外抗真菌药物敏感性分析

目的 探讨念珠菌在女性阴道黏膜所致的不同表现与其对抗真菌药物敏感性之间的关系。方法 应用NCCLSM27-A方案推荐的微量液体稀释法,测定对来自外阴阴道念珠菌健康携带者、外阴阴道念珠菌病和复发性外阴阴道念珠菌病的念珠菌对抗真菌药物的敏感性。结果 8种抗真菌药对光滑念珠菌和克柔念珠菌的MIC值几乎均比白念珠菌高。来自复发性外阴阴道念珠菌病患者的菌株MIC值较高,而健康带菌者菌株的MIC值较低。耐药菌株主要来源于复发组,健康带菌者来源的白念珠菌菌株对伊曲康唑、氟康唑、酮康唑和制霉菌素未见有耐药菌株出现。结论 外阴阴道念珠菌病治疗中应重视非白念珠菌的耐药性,长期或间断应用抗真菌药物治疗,可能诱导耐药株的产生。     

阴道念珠菌随机扩增多态性DNA分型研究

目的 对分离自外阴阴道念珠菌病患者阴道的念珠菌进行基因分型,并对不同菌株间的亲缘关系作相似性分析。方法 用形态学及生化方法对分离到的致病性念珠菌进行鉴定,然后采用随机扩增多态性DNA技术(RAPD)对45株临床分离株基因组DNA进行扩增,并将DNA扩增带型进行聚类分析。结果 30株白念株菌可以分成7群共19个亚群,15株非白念珠菌(包括光滑念珠菌6株,克鲁斯念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌各3株)至少可鉴定到种水平。白念珠菌种内不同菌株间的相似性系数在90%以上,不同念珠菌种间的相似性系数介于80%~90%。结论 外阴阴道念珠菌病的主要致病菌是白念珠菌,用RAPD技术可将之分成不同的基因组型别。     

外阴阴道念珠菌病复发前后分离菌株基因型分析

目的 比较从外阴阴道念珠菌病患者复发前后分离菌株的RAPD指纹图谱的异同。方法 通过流行病学调查表来收集病例和采集样本。所有临床分离菌株均经芽管形成试验、念珠菌显色培养基（CHROMagar Candida） 和API20C系统鉴定，然后用RAPD技术对2株白念株菌标准菌株和来自24例患者连续2次及1例患者连续3次分离出的临床菌株共51株菌株进行基因分型。结果 引物4的RAPD扩增结果表明，66.7%的患者再次发作前后菌株的扩增带型一致。引物7的RAPD扩增结果为，58.3%的患者复诊前后菌株的扩增带型一致。25例患者中有4例患者前后2次分离的菌种从白念珠菌替换成光滑念珠菌。结论 从外阴阴道念珠菌病患者分离的菌株半数以上在再次发作前后无明显基因型上的差别，仅有部分菌株会在复发前后基因型发生改变。     

皮肤念珠菌病患者多部位分离菌株DNA分型研究

目的 比较皮肤念珠菌病患者不同部位分离菌株基因相似性,推测皮肤念珠菌病多部位感染的可能途径。方法 采用PCR扩增引物P-Ⅰ和P-Ⅱ扩增出白念珠菌染色体25SrDNA片段和特征性的基因片段重复序列片段,结合两种扩增结果进行分型,并将870bp大小的特征性的基因片段重复序列片段用限制性内切酶EcoRⅠ和ClaⅠ消化。结果 来自19例皮肤念珠菌病患者的41株白念珠菌被分为6型,同一患者不同部位分离菌株基因型相似,不同个体间基因型有差异。结论 分离自皮肤念珠菌病患者不同部位的致病菌株基因型相同,提示其发病可能与外源性再发感染无关。     

念珠菌性外阴阴道炎患者身体不同部位白念珠菌基因型研究

目的 研究念珠菌性外阴阴道炎患者身体不同部位的白念珠菌基因型分布情况。方法 采用PCR方法扩增白念珠菌包含Ⅰ类内含子的编码rRNA的25SrDNA区,根据扩增条带大小进行基因分型:A型(~450bp),B型(~840bp),C型(~450bp和~840bp)。结果 60例念珠菌性外阴阴道炎患者中,54例由白念珠菌感染所致,其中表现为非复发性感染者39例,复发性感染者15例;同时从2个或2个以上部位分离到白念珠菌的病例共32例(32/54),其中非复发性念珠菌性外阴阴道炎19例(19/39),复发性念珠菌性外阴阴道炎13例(13/15)。从54例白念珠菌性外阴阴道炎患者的阴道、肛门、口腔部位共分离到92株白念珠菌,其中A型80株,B型8株,C型4株。同一患者不同部位基因型相同者24例(24/32),不同者8例(8/32)。结论 在白念珠菌性外阴阴道炎中,主要以A型白念珠菌为主,B型、C型所占比例较少,且多分离自非阴道部位。在复发性念珠菌性外阴阴道炎患者中,身体其他部位念珠菌的定植率高于非复发性念珠菌性外阴阴道炎,肠道菌库理论在念珠菌性外阴阴道炎的反复发作中,具有一定的作用。     

外阴阴道念珠菌病患者阴道念珠菌对抗真菌药物的敏感性测量

了解外阴阴道念珠菌病病原菌对抗真菌药物的敏感性,采用API法对分离自临床外阴阴道念珠菌病患者的120株念珠菌进行菌种鉴定;参照美国国家实验室标准委员会(NCCLS)M-27A方案(1997),采用微量法检测120株临床试验菌株、5株参考株及1株质量控制株对6种常用抗真菌药物的敏感性。结果显示:120株分离自外阴阴道念珠菌病患者的念珠菌中,白念珠菌105株(87.5%),非白念珠菌15株(12.5%);氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B、酮康唑、特比萘芬及5-氟胞嘧啶对120株临床菌株的最小抑菌浓度(MIC)均数(μg/mL)分别为:9.474±2.329,0.305±0.062,0.599±0.062,0.855±0.377,9.970±3.324和14.819±5.180。提示氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B和酮康唑对念珠菌显示一定的敏感性。外阴阴道念珠菌的主要菌种为白念珠菌。     

微孔板双探针杂交法快速鉴别都柏林念珠菌和白念珠菌

目的 建立微孔板双探针杂交法,快速鉴别都柏林念珠菌和白念珠菌,并应用于临床分离株的快速鉴定。方法 利用真菌保守区核糖体基因和可变区内转录间隔区基因为靶序列,应用生物素标记的通用引物进行念珠菌DNA的PCR扩增,并将该PCR产物分别与固定在微孔板上的都柏林念珠菌和白念珠菌特异性探针杂交,经酶联显色反应测其A值。结果 能特异地鉴别白念珠菌和都柏林念珠菌标准菌株。对108株常规培养方法从临床标本分离的白念珠菌检测,结果显示106株菌株仅白念珠菌探针检测阳性,另2株菌株仅都柏林念珠菌探针阳性。结论 微孔板双探针杂交法能快速、特异地鉴别都柏林念珠菌和白念珠菌。     

白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶基因在急性念珠菌性外阴阴道炎中的表达

目的 了解白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶(Sap)基因在人类阴道白念珠菌感染时的表达情况。方法 收集9例阴道念珠菌检测阴性及20例阴道念珠菌感染者的阴道分泌物,通过用特异引物系列进行RT-PCR反应来评价Sap1~Sap6在人体阴道环境中的表达情况。结果 Sap2和Sap5在阴道白念珠菌感染者中是最主要的表达基因;Sap3和Sap4在所有检查者中均被检测到;所有6种Sap基因在某些阴道念珠菌病患者中同时被检出。结论 Sap基因可能与阴道念珠菌病的发病机制有关。     

微卫星基因分型法分析生殖器白念珠菌感染的传播特点

目的 建立适用于株间鉴别的白念珠菌快速微卫星基因分型方法,探索生殖器白念珠菌感染特点.方法 采集39例女性和27例男性生殖器念珠菌病患者生殖器、肛管和口腔的白念珠菌分离株.以三色荧光标记引物,PCR扩增白念珠菌保守基因CDC3、EF3和HIS3微卫星序列,经聚丙烯酰胺凝胶电泳,行微卫星多态性基因分型.结果 三基因联合分析显示,男女生殖器白念珠菌感染者共获18种基因型,主要致病菌株基因型为116:124、122:131、160:200,占感染者的50%以上.3种共有基因型占71%.女性患者中肛管部位菌株基因型与生殖器部位完全一致的占80%,男性则仅占3.8%.女性患者口腔部位的菌株基因型与生殖器部位完全一致的仅占2.7%,男性未见口腔和生殖器一致的菌株基因型.71%的夫妻共患者间生殖器白念珠菌基因型完全相同,其中80%的致病菌株基因型为两性皆感染的主要致病性白念珠菌.结论 改良的白念珠菌微卫星多态性基因分型法能够特异、准确、稳定和快速地进行菌株间鉴别.生殖器白念珠菌感染存在优势基因型.     

从母婴分离的念珠菌DNA分型研究

目的 探讨念珠菌在母婴间垂直传播的可能途径.方法 采用分子生物学方法,对11对分离于分娩前母亲阴道分泌物及其新生儿口腔并经常规形态学和生化学鉴定为同种念珠菌的母婴分离株,再次进行大亚基rDNA的D1/D2区域DNA序列鉴定.采用电泳核型和随机扩增DNA多态性进行分型研究,以确定是否为同一来源的菌株.结果 11对22株菌,其中8对母婴分离株的16株菌的DNA序列经DDBJ Gene Bank(登录号U45776)搜索与白念珠菌参考株Cal_Y12983具有100%的同源序列,被确认为白念珠菌;另2对的4株菌和1对的2株菌的DNA序列经DDBJ Gene Bank搜索与Cgra_Y65(U44808)和C.krusei Y-5396(U76347)具有100%的同源序列,分别被确认为光滑念珠菌和克柔念珠菌.电泳核型分析,每一对白念珠菌和克柔念珠菌的母婴分离株都具有完全相同的谱带.每一对光滑念珠菌的母婴分离株尽管产生1、2条不同谱带,但仍被认为是来源于同一个体,因为主要谱带是相同的.RAPD DNA带谱分析,对母婴分离株除1对2株菌的DNA谱带略有不同外,其余10对皆具有同样的DNA谱带.结论 1111株婴儿株与其母亲株分子生物学特征完全相同,可认为是经母亲产道垂直传播所致.     

系统性白念珠菌病患者血清中芽管抗体的检测

目的 探讨一种诊断深部白念珠菌病的新方法.方法 以间接免疫荧光法测定白念珠菌系统感染患者血清中芽管抗体的滴度,并与常规真菌检测结果及菌株磷脂酶活性相比较.结果 血清中芽管抗体检测与常规检测方法(镜检+培养)阳性率比较,有较好的一致性(P<0.001).磷脂酶活性测定结果显示,感染组患者分离株较定植组的磷脂酶活力差异有统计学意义(P<0.05);磷脂酶活性与芽管抗体滴度具有相关性,P<0.001.结论 检测白念珠菌芽管抗体在系统件白念珠菌感染诊断中具有一定的诊断意义.     

常见致病性念珠菌的PCR-RFLP鉴定研究

目的 研究常见致病性念珠菌的分子鉴定方法,为深部念珠菌病的分子诊断奠定基础。方法 对常见9种致病性念珠菌的11株标准株和39株临床株的核糖体DNA内转录间隔区进行聚合酶链反应扩增,对扩增产物进行MspⅠ、HaeⅢ和DdeⅠ三种内切酶的酶切分析。结果 9种念珠菌聚合酶链反应扩增后产生5种不同分子量的条带,扩增产物经MspⅠ、DdeⅠ和HaeⅢ酶切后分别产生8种、5种和4种特异性带型。结论 聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性方法在鉴定常见的致病性念珠菌中稳定、可靠、特异,是传统方法的有益补充。     

白念珠菌性阴道炎动物模型的构建

目的 构建白念珠菌性阴道炎的小鼠模型。方法 采用ICR雌性小鼠,预先给其皮下注射苯甲酸雌二醇以造成小鼠的假发情,再给予小鼠阴道内注射约5×10⁴个白念珠菌稳态芽生孢子,动态观察其阴道分泌物生成及镜检情况;并进行阴道灌洗液的真菌载量分析以及阴道组织病理观察。结果 与未雌激素化的小鼠比较,雌激素化小鼠阴道灌洗液的真菌载量分析显示自第2天开始可分离出高水平的计数结果并直到接种后21d;阴道组织病理结果发现自第4天至实验结束均可见到阴道粘膜浅层有菌丝生长,并有炎性细胞浸润。结论 此动物模型可以作为一个研究念珠菌性阴道炎发病机制的手段。     

两种培养基体外诱导白念珠菌菌丝相形成的比较

目的 寻找白念珠菌菌丝相理想的体外培养条件.方法 分别采用RPMI1640和DMEM培养基,在37℃条件下培养对氟康唑敏感性不同的16株白念珠菌,计算并比较白念珠菌菌丝相在两种培养基中的形成率.结果 在DMEM培养基中白念珠菌菌丝相的形成率低于在RPMI 1640培养基中的形成率.RPMI 1640培养基(pH7.5),37℃传代培养7d(转种12次)后,16株白念珠菌菌丝相细胞形成率均达99%以上.在DMEM培养基中,于同一观察时间,氟康唑剂量依赖性敏感和耐药株的菌丝相形成率低于氟康唑敏感株.结论 RPMI1640培养基(pH7.5),37℃传代培养7d(转种12次)是获得白念珠菌菌丝相的理想条件.     

八角茴香挥发油抗念珠菌活性的体外研究

目的 探讨八角茴香挥发油体外抗念珠菌活性及与氟康唑在联合抑菌实验中的相互作用。方法 参照NCCLSM27-A方案中的微量液基稀释法检测八角茴香挥发油对130株临床分离念珠菌的最小抑菌浓度(MIC)与最小杀菌浓度(MFC),并以氟康唑作为质控药物;同时采用棋盘微量稀释法对18株念珠菌进行了八角茴香挥发油与氟康唑的体外联合抑菌实验。结果 八角茴香挥发油对临床分离念珠菌的MIC及MFC分别为白念珠菌1517.16μg/mL与2248.55μg/mL、光滑念珠菌1169.24μg/mL与2338.49μg/mL、近平滑念珠菌1320.03μg/mL与1741.79μg/mL、热带念珠菌1203.50μg/mL与2407.01μg/mL、克柔念珠菌1516.32μg/mL与2144.40μg/mL及季也蒙念珠菌1072.64μg/mL与2144.40μg/mL。八角茴香挥发油与氟康唑联用对氟康唑敏感株及耐药株均表现出较好的协同相加作用,而且未发现有拮抗作用,两组间分数抑菌浓度指数(FICI)差异无显著性(P=0.67)。结论 八角茴香挥发油对临床常见致病性念珠菌有程度相似的抗菌作用;八角茴香挥发油与氟康唑联用对念珠菌主要表现为协同相加作用。     

复方壳多糖真皮替代物体外抗菌作用的研究

目的 研究复方壳多糖真皮替代物对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、白念珠菌的体外抑菌作用。方法 制备复方壳多糖真皮替代物和复方胶原凝胶真皮,分别为实验组和对照组,各取50μL滴加在涂满细菌或真菌的平板,每种菌实验组和对照组样本各6个,孵育24h后观察抑菌环。结果 复方壳多糖真皮替代物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌具有抑菌作用,抑菌环均大于复方胶原凝胶真皮替代物,差异有统计学意义。两组对白念珠菌无抑菌作用。结论 复方壳多糖真皮替代物是有体外抗细菌作用的组织工程产品。     

重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子与伊曲康唑联合对白念珠菌抗菌作用的实验研究

目的 研究重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)与伊曲康唑联合抗白念珠菌的作用。方法 体内实验:制备系统性白念珠菌感染小鼠模型,用不同剂量伊曲康唑单独或与rhGM-CSF联合应用于感染小鼠,观测其28d内的存活情况。体外实验:分离鼠外周血中性粒细胞及腹腔巨噬细胞,分别将其与不同浓度的伊曲康唑及伊曲康唑加rhGM-CSF与白念珠菌共同培养,通过计数菌落形成单位(cfu)来判定伊曲康唑单独或与rhGM-CSF联合应用的抗白念珠菌效果。结果 伊曲康唑1.0mg/kg与rhGM-CSF25μg/kg联合应用能显著延长小鼠28d内的存活期,效果与单用伊曲康唑2.5mg/kg相等,而rhGM-CSF25μg/kg与伊曲康唑5mg/kg联合应用时效果相当于单用伊曲康唑10mg/kg。体外实验亦显示rhGM-CSF与伊曲康唑联用能减少白念珠菌数量。结论 rhGM-CSF与伊曲康唑联合应用对抗小鼠系统性白念珠菌感染有较好的协同作用。     

全染色体DNA杂交技术分析八种念球菌基因组DNA同源性

用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分离8种念珠菌染色体DNA并进行Southern转印,以白念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌的全染色体DNA做探针与PFGE转移膜进行杂交.结果表明,除白念珠菌与近平滑念珠菌间基因同源性较高外,其余各念珠菌间DNA同源性并非如以前认为的那样高,而且同源序列几乎均位于rDNA所在的染色体上.