人脐静脉血管内皮细胞培养、冻存、复苏与鉴定

目的:探讨人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)体外分离、培养、冻存、复苏与鉴定的可靠方法.方法:采用改良的胶原酶灌注消化法对HUVEC体外分离、培养,按慢冻速融原则对第3代细胞进行液氮冻存、复苏.采用免疫组化Ⅷ因子相关抗原染色和活体细胞荧光DiI-Ac-LDL鉴定.结果:分离的原代HUVEC总数平均为1×106个细胞,最多达3×106个细胞;两种鉴定结果HUVEC均为95%以上阳性;冻存后分3批复苏细胞活性均超过90%.结论:成功建立了人脐静脉血管内皮细胞体外培养、冻存、复苏与鉴定方法,获得了足够数目和纯度的血管内皮细胞,保持了细胞的同源同代性.     

人脐静脉内皮细胞的分离培养和冻存

目的研究体外分离、培养、冻存人脐静脉内皮细胞的有效方法以获得大量人脐静脉内皮细胞，为构建含血管的组织工程皮肤提供种子细胞。方法新鲜脐带内灌注胶原酶消化，获得内皮细胞，用含20％胎牛血清的M199液进行培养。倒置显微镜观察细胞形态，结合Ⅷ因子免疫组化鉴定细胞来源。内皮细胞加入10％甘油的冻存液，分别置于渡氮保存1周和4周，复苏后血球计数板计数，绘制生长曲线。结果脐静脉内灌注胶原酶法可获取高纯度的内皮细胞，与未冻存细胞相比，复苏的细胞活力保持在80％以上，复苏后生长曲线与未冻存细胞相似。结论脐静脉灌注酶消化法可获取大量高纯度的内皮细胞。冻存的内皮细胞复苏后仍保持较高的体外增殖能力，可作为制备含血管的组织工程皮肤的种子细胞来源。     

人脐静脉内皮细胞分离及冷冻保存的技术

目的 研究分离、培养、扩增人脐静脉内皮细胞及进行冷冻保存技术，探讨建立脐带血管内皮细胞库的可能性。方法 新鲜脐带42条，脐静脉内灌注消化酶消化，获得内皮细胞：以含20％的胎牛血清M199液进行培养。采用Ⅷ因子免疫荧光染色及扫描电镜检查，鉴定所获内皮细胞及其纯度：内皮细胞加入含10％DMSO冷冻保存液，置于液氮进行保存，复苏后进行锥虫蓝试验，四氮唑盐(MTT)试验以及细胞凋亡的流式细胞仪检测。结果 血管内灌注消化液法可获取高纯度的内皮细胞，与未冻存细胞相比，复苏的细胞活力保持在95％以上。复苏后的内皮细胞的生长曲线与未冻存细胞的生长曲线无差异。冻存内皮细胞的凋亡率较未冻存细胞高，但无统计学意义。结论 脐静脉灌注酶消化法可获取足够数量及纯度的内皮细胞。冻存的内皮细胞复苏后仍保持较高的活力及体外增殖能力，可作为制备组织工程学血管的种子细胞来源。     

人脐静脉内皮细胞的体外培养及鉴定

目的：探讨人血管内皮细胞体外培养方法,为研究心脑血管疾病发病机制提供实验手段。方法：采用0．1％胶原酶消化、分离体外原代培养脐静脉血管内皮细胞,0．125％胰酶-0．01％EDTA 溶液消化传代。并用光镜和免疫组化等方法进行内皮细胞的形态观察和鉴定。结果：原代培养的内皮细胞在接种后约4h开始贴壁生长,光镜下内皮细胞呈铺路石状镶嵌排列;免疫组化可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。结论：用胶原酶灌注消化脐静脉可获得高纯度的内皮细胞,细胞存活率高,为血管内皮细胞的研究提供了实验模型。     

人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定

目的：摸索人脐静脉内皮细胞体外培养的方法和注意事项。方法：采用0．25％胰蛋白酶分离人脐静脉内皮细胞,含20％FBSDMEM养基培养,待细胞80％融合后,以O．25％胰蛋白酶消化传代,并以倒置显微镜观察内皮细胞的生长情况,以免疫组化方法对内皮细胞进行鉴定。结果：原代培养的细胞在接种4h后开始贴壁生长,3－5天后融合成单层,倒置显微镜下观察细胞呈铺路石状排列,免疫组化显示人第Ⅷ因子相关抗原阳性。结论：用胰蛋白酶消化脐静脉可获得内皮细胞且成活率较高,是一种可靠的方法。     

人脐静脉内皮细胞的分离及原代培养体会

目的:建立一种操作简便、且能够获得数量较多及活力良好的人脐静脉内皮细胞的分离、培养方法。方法:采用0.1%IV型胶原酶灌注消化分离人脐静脉内皮细胞,将其置于含有20%胎牛血清、内皮细胞生长因子及肝素的M199培养基内培养,倒置显微镜观察内皮细胞生长情况,免疫荧光方法鉴定内皮细胞的Ⅷ因子相关抗原。结果:细胞呈梭形或椭圆形生长,单层铺路石状排列或呈漩涡状排列。免疫荧光检测结果显示细胞的胞浆内有大量绿色荧光颗粒,Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。结论:实验建立的人脐静脉内皮细胞分离和培养方法简单、可靠,且能获得足够数量和高纯度的血管内皮细胞,为进一步研究人体大血管内皮细胞的功能奠定了较好的基础。     

原代人脐静脉内皮细胞分离和培养方法的改进

目的建立一套高效、方便、可靠的脐静脉内皮细胞的体外分离和培养方法。方法取剖腹产新生婴儿脐带,加入Ⅰ型胶原酶消化分离人脐静脉内皮细胞,内皮专用培养基EGM-2培养传代。应用相差显微镜观察细胞形态。DiL-Ac-LDL染色证实细胞具有内皮功能。免疫荧光染色证明新分离细胞表达FⅧ相关抗原。流式细胞仪检测细胞表面表达CD31。结果原代培养细胞培养10～15d左右长成单层,细胞呈多角形,铺路石样排列。DiL-Ac-LDL染色阳性,证实细胞具内皮吞噬功能。免疫荧光检测证明细胞特异性表达FⅧ相关抗原。流式细胞仪检测证明细胞表面高表达CD31。结论通过酶灌注法消化脐静脉血管获得细胞,操作简便、高效,EGM-2培养基可保证内皮细胞具有较高纯度,细胞形态学观察和细胞生物学鉴定证明获得人脐静脉血管内皮细胞。     

原代人脐静脉内皮细胞培养方法经验总结

目的 建立分离培养原代人脐静脉内皮细胞的方法。方法 采用0.125%胰酶+0.01%乙二胺四乙酸(EDTA)消化液灌注法,获得原代人脐静脉内皮细胞,用免疫组织化学方法进行细胞鉴定。结果 原代培养的脐静脉内皮细胞呈典型的铺路石样排列;细胞鉴定可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。结论 0.125%胰酶+0.01%EDTA消化法能够获取大量且纯度高的原代人脐静脉内皮细胞,为体外实验提供可靠的细胞模型。     

人脐静脉内皮细胞的原代培养及鉴定

目的:探讨新生儿脐静脉内皮细胞的培养及鉴定方法,建立血管内皮细胞培养模型,为体外研究血管内皮细胞提供实验手段。方法:采用0.1%Ⅱ型胶原酶分离脐静脉内皮细胞,于M199培养基(含15%胎牛血清,促内皮生长因子1%,青霉素100u/ml,链霉素100mg/ml)内培养,待细胞80%融合后,以0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化传代,并以倒置光显微镜观察内皮细胞生长情况,以免疫荧光方法对内皮细胞进行鉴定。结果:原代培养细胞在接种2h后开始贴壁生长,倒置光显微镜下观察细胞呈鹅卵石状排列,免疫荧光显示细胞胞浆内Ⅷ因子相关抗原阳性。结论:用胶原酶灌注消化脐静脉是获得内皮细胞的一种较可靠的方法。     

人脐静脉内皮细胞体外培养方法的改进

目的：建立一种能大量分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC)且操作方便的体外分离、培养方法。方法：采用胶原酶对HUVEC进行消化，加入内皮细胞生长因子和肝素促其生长，以胰蛋白酶消化贴壁细胞，继续传代培养。细胞鉴定采用形态学观察和免疫荧光法。结果：经相差显微镜观察及Ⅷ因子染色证实培养的细胞是内皮细胞。结论：实验建立的HUVEC培养方法简便，细胞获得量多。     

球松素对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用

目的观察球松素对人脐静脉内皮细胞的保护作用。方法采用灌注消化法分离培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）,并对其进行形态学和免疫组织化学染色鉴定。用脂多糖（LPS）诱导建立人脐静脉血管内皮细胞的损伤模型,随后用球松素作用于受损伤细胞,观察其对HUVEC的保护作用。结果倒置显微镜下可见细胞呈梭形,单层铺路石状排列,Factor VIII相关抗原免疫组织化学染色鉴定阳性。100μg/L的LPS对脐静脉内皮细胞生长有明显的抑制作用,可作为人脐静脉内皮损伤模型的造模浓度。球松素能减轻LPS对细胞的损伤（P〈0.05）,并呈剂量依赖关系。结论球松素对LPS所诱导的人脐静脉内皮细胞损伤有保护作用。     

人碱性成纤维细胞生长因子腺病毒表达载体的构建及其在人脐静脉内皮细胞中的表达

目的:构建人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast cell growth factor,bFGF)腺病毒载体,并观察其在体外血管内皮细胞中的表达.方法:采用同源重组的方法,构建重组腺病毒Ad5-bFGF.携有绿色荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)的Ad5腺病毒转染人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),检测最佳转染复数.Ad5-bFGF体外转染HUVEC,免疫细胞化学法、Western印迹法检测bFGF蛋白的表达.结果:Ad5转染HUVEC的最佳转染复数为200,转染率为90%.免疫细胞化学法和Western印迹结果显示bFGF基因以Ad5为载体可以在HUVEC的胞质和胞核表达,并且表达量较未转染的HUVEC明显增加.结论:成功构建了携带bFGF基因的腺病毒载体,体外可以成功表达,为bFGF基因治疗及肿瘤发病机制的研究奠定了基础.     

人脐静脉内皮细胞的原代培养

目的建立一种能大量分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC)且操作方便的体外培养方法。方法采用不同浓度的Ⅱ型胶原酶(0.05%,0.1%和0.2%)对HUVEC进行灌注,并分别孵育不同的时间(10min,13min,15min和18min)进行消化,观察细胞的形态、数量以及生长融合情况。结果采用0.1%的胶原酶消化10-13min为最佳条件,经光学显微镜观察培养的细胞数量较多,生长、繁殖状态良好,培养3d左右细胞可达到融合状态。结论本实验建立的胶原酶法消化HUVEC培养方法简便,细胞获得量较多且生长状态良好。     

登革2型病毒及其NGC株、M株E基因的原核蛋白对HUVEC通透性的影响

目的：研究登革2型病毒（DENV-2）、登革2型病毒国际参考株（NGC）E基因1-476序列原核蛋白、登革2型病毒贵州蚊虫分离株（M）E基因1476序列原核蛋白对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）通透性的影响.方法：将DENV-2 M株和NGC株E基因1-476序列原核表达产物及DENV-2接种于HUVEC单层细胞,用tran-swell法检测HUVEC的通透性,透射电镜观察细胞超微结构的改变.结果：DENV-2、NGC株E基因的原核蛋白、M株E基因的原核蛋白分别在30 min、3h、12 h时对HUVEC通透性的影响最为明显,透射电镜结果显示有细胞超微结构的改变.结论：DENV-2、DENV-2 NGC株E基因原核蛋白、M株E基因原核蛋白对HUVEC通透性、细胞超微结构有明显影响.     

人脐静脉内皮细胞分离、培养及鉴定

目的：寻求一种简单、实用的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）分离及培养方法。方法：在传统HUVECs分离、培养的基础上,进行实验方法的改进,用Ⅰ型胶原酶分离HUVECs;通过倒置显微镜观察HUVECs生长情况,最后使用Ⅷ因子免疫荧光及摄取Dil-Ac-LDL实验鉴定HUVECs,采用流式细胞术检测HUVECs纯度。结果：改进实验工序和精化实验操作后,HUVECs分离不受影响,原代HUVECs3～4d后融合,传代后2～3d融合,倒置显微镜下见细胞呈＂铺路石＂状,有接触性抑制现象,Ⅷ因子及摄取Dil-Ac-LDL实验呈阳性,流式细胞术检查细胞纯度达92.9%。结论：本培养方法操作简便,培养周期短,获得的HUVECs纯度较高,有助于体外研究血管内皮细胞模型的构建。     

肝素对HL-60细胞与人脐静脉内皮细胞粘附作用的影响

目的：研究肝素对HL-60细胞与脐静脉内皮细胞粘附作用的影响。方法：通过原代培养人脐静脉内皮细胞,在静止及动态条件下观察肝素对HL-60细胞与脐静脉内皮细胞的粘附作用的影响。结果：TNF-α处理脐静脉内皮细胞能明显增加HL-60细胞与脐静脉内皮细胞粘附;肝素处理脐静脉内皮细胞及HL-60细胞能明显抑制两者之间的粘附作用。讨论：肝素可抑制体外条件下HL-60细胞与人脐静脉内皮细胞粘附,该结果为进一步研究白细胞粘附机制及筛选抗炎药物提供了条件。     

苦参碱联合热疗抗血管生成作用的实验研究

目的：探讨苦参碱联合应用热疗对体内外血管生成的抑制作用。方法：采用MTT法观察苦参碱联合热疗对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、人结肠癌LOVO细胞增殖的影响;采用transwell板,观察苦参碱对HUVEC迁移的影响;采用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型,观察苦参碱对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的抑制作用。结果：苦参碱在6.25～200μg/ml浓度时,具有抑制HU-VEC增殖的作用（细胞存活率在86.4%～56.1%）,与浓度呈负相关（（相关系数r为-0.955）,此浓度范围内苦参碱对人肠癌细胞株细胞的抑制低于对内皮细胞的抑制,具有明显的差异细胞毒作用;在12.5～25μg/ml浓度时苦参碱对鸡胚尿囊膜血管形成具有显著的抑制作用;在6.25～25μg/ml浓度时对内皮细胞迁移具有显著抑制作用;6.25、12.5、25μg/ml苦参碱联合热疗在体外具有抗血管生成的次加效应。50、100、200μg/ml苦参碱联合热疗在体外具有抗血管生成的协同效应。结论：小剂量苦参碱（6.25～200μg/ml）在体内外具有抑制血管生成作用,联合热疗具有协同或次加效应。     

阿托伐他汀钙抑制高糖诱导的人脐静脉内皮细胞内皮微粒释放及细胞凋亡

目的：探讨阿托伐他汀钙对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）内皮微粒释放和细胞凋亡的影响.方法：取生长良好的HUVEC进行实验.将细胞分为3组：对照组（5.5mmol/L葡萄糖）、高糖组（33.3mmol/L葡萄糖）和阿托伐他汀干预组.干预组首先用不同浓度的阿托伐他汀钙（0.01～10μmol/L）分别作用lh,而后加入33.3mmol/L葡萄糖共同孵育24,48,72h.应用MTT比色法检测细胞的生存率.采用流式细胞仪分别检测HUVEC内皮微粒释放以及细胞凋亡率.应用Griess还原法检测培养细胞上清液中一氧化氮（NO）浓度.结果：阿托伐他汀钙减轻高糖对HUVEC的损伤,阿托伐他汀组细胞形态基本完好.阿托伐他汀钙降低高糖诱导的HUVEC内皮微粒释放和细胞凋亡率,且均具有浓度和时间依赖性（P均〈0.05）.阿托伐他汀钙升高高糖诱导的NO含量,使其趋于正常.此作用在0.1～10μmol/L阿托伐他汀钙浓度区间作用24～48h时效果最明显（P均〈0.05）.结论：阿托伐他汀钙抑制高糖诱导的HUVEC内皮微粒释放及细胞凋亡,并通过调节内皮微粒和NO平衡起到保护HUVEC作用.