兔软骨细胞的分离及其与Ⅰ/Ⅱ型复合胶原膜共培养实验研究

目的  探讨体外分离兔软骨细胞的方法并观察其与Ⅰ/Ⅱ型复合胶原膜共培养时的生物活性。方法  取4周龄的新西兰大耳兔,处死后在无菌条件下取关节软骨。通过胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化软骨细胞。倒置相差显微镜下观察软骨细胞特点,制作细胞爬片行甲苯胺蓝染色。将第3代兔软骨细胞与Ⅰ/Ⅱ型复合胶原膜共培养,噻唑蓝（MTT）法和糖胺聚糖含量测定法检测软骨细胞在胶原膜上的细胞活性,扫描电镜观察软骨细胞在复合胶原膜上的生长情况。结果  分离出的原代软骨细胞初为卵圆形,贴壁后变成三角形或多边形,可被甲苯胺蓝染色。软骨细胞在Ⅰ/Ⅱ型复合胶原膜上生长良好。结论  两部酶法可获得大量软骨细胞,MTT法和扫描电镜证实软骨细胞可在复合胶原膜上正常扩增。

     

脂肪干细胞与不同脱细胞基质的组织相容性研究

目的  研究SD大鼠脂肪干细胞与不同脱细胞膀胱基质（BAMG）的体外生物相容性，为进一步把细胞支架复合物回植动物体内提供有利的实验基础。方法  取SD大鼠双侧腹股沟处脂肪组织经过相应处理后得到原代脂肪组织，进行成骨、成脂诱导染色及流式细胞术检测CD29、CD34、CD44及CD45，对脂肪干细胞进行鉴定，同时制备鼠及新西兰兔BAMG，采用2次沉淀法将脂肪干细胞静态接种于不同BAMG表面，观察细胞在材料表面的生长状况，并绘制细胞生长曲线。结果  细胞材料体外复合培养5 d后行HE染色后观察可见SD大鼠脂肪干细胞在SD大鼠BAMG表面生长状态较其在新西兰兔BAMG表面生长状态好，且细胞形态舒展成长梭形，细胞生长曲线与SD大鼠原代脂肪干细胞基本一致。结论  SD大鼠脂肪干细胞接种于SD大鼠BAMG复合物表面生长状况相比于其接种于新西兰兔BAMG复合物表面更加良好，具有更好的生物相容性。为进一步把细胞支架复合物回植动物体内提供有利的实验基础。

     

骨髓间充质干细胞促进皮肤创口愈合及Wnt信号通路在愈合过程中的作用

目的  研究骨髓间充质干细胞（BMSCs）对皮肤创口愈合及Wnt信号通路在愈合过程中的作用。 方法  原代培养Sprague Dawly大鼠BMSCs并CD29、CD44、CD90、CD45细胞表面标志物鉴定;构建SD大鼠皮肤创口损伤模型;实验分组：磷酸缓冲盐溶液（PBS）对照组、BMSCs组,分别将PBS、BMSC细胞皮下注射到创口周围,观察创口愈合情况,计算创口愈合率;蛋白免疫印迹法检测Wnt1和β-catenin基因表达水平。 结果  第3代BMSCs形态多为梭形、多突形。BMSCs可均一表达CD29、CD44、CD90,其阳性率分别为87.29%、91.66%和76.18%;而CD45呈阴性,其阳性率为3.14%。BMSCs可显著促进大鼠创口愈合;BMSCs组大鼠创面愈合率均高于PBS组,差异有统计学意义。蛋白免疫印迹结果BMSCs促进Wnt1和β-catenin基因蛋白表达。结论  BMSCs能促进创口愈合,其促进作用可能与Wnt信号通路有关。

     

结肠癌患者肿瘤微环境中T细胞亚群与肿瘤细胞转移的关系

 摘要：目的  探讨结肠癌患者肿瘤微环境中T细胞亚群与肿瘤细胞转移的关系。方法  前瞻性收集该院收治的结肠癌患者89例,所有患者行结肠癌切除术,收集术中肿瘤标本,检测肿瘤组织中CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和调节性T细胞。分析CD4+ T细胞、CD8+ T细胞及调节性T细胞与患者临床特征关系。结果  随着TNM分期的增加,CD4+ T细胞和调节性T细胞增加,CD8+ T细胞降低（P <0.05）。高分化、中分化及低分化患者调节性T细胞分别为（6.59±1.87）%、（7.27±1.81）%和（8.12±1.92）%,差异有统计学意义（P <0.05）。合并淋巴结转移患者CD4+ T细胞增高,CD8+ T细胞降低,调节性T细胞升高（P <0.05）。腺癌、黏液癌期未分化癌调节性T细胞分别为（6.82±1.88）%、（7.28±1.82）%和（8.22±1.91）%,差异有统计学意义（P <0.05）。结论  肿瘤微环境中T细胞亚群失衡与肿瘤细胞的转移相关,调节微环境中T细胞水平或可改善患者临床预后。

     

神经营养因子-3通过Wnt通路促进人骨髓间充质干细胞生长和成骨分化的研究

目的  阐明神经营养因子-3（NT-3）促进人骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的能力,并分析Wnt通路的作用机制。方法  正常培养的人骨髓间充质干细胞为对照组;NT-3刺激的人骨髓间充质干细胞为NT-3组;加入ICG-001作用30 min后,用NT-3刺激者为Wnt抑制剂组,每组进行成骨诱导实验。利用噻唑蓝细胞增殖、酶联免疫吸附试验、Western blot检测、茜素红染色等实验分别检测各组人骨髓间充质干细胞增殖、细胞凋亡、碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白-1（BMP-1）等蛋白表达及钙结节形成能力。结果  与对照组比较,NT-3组间充质干细胞（MSC）增殖吸光度值增高（P <0.01）;NT-3组碱性磷酸酶活性、BMP-1等蛋白表达或茜素红染色效果均高于对照组（P <0.01）;与NT-3组比较,Wnt抑制剂组MSC增殖吸光度值降低（P <0.01）;而Wnt抑制剂组的碱性磷酸酶活性、BMP-1等蛋白表达均低于NT-3组（P <0.01）。结论  NT-3通过Wnt通路,促进人骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化。

     

小鼠CD45-CD31+肺侧群细胞诱导分化的研究

摘要：目的  探讨在体外诱导分化肺侧群细胞（SP）的特性。方法  取小鼠肺组织，流式细胞术分选小鼠白细胞分化抗原（CD）45-/CD31+肺SP；免疫荧光检测分选肺SP三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2（ABCG2）的表达；逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测肺SP中ABCG2、酪氨酸激酶2（Tie2）及血管性血友病因子（vWF）的表达。细胞体外分化诱导14 d后，免疫荧光检测细胞vWF的表达；RT-PCR检测分化诱导前后细胞中ABCG2和vWF的表达。结果  流式细胞术成功分选出CD45-/CD31+肺SP细胞，免疫荧光检测其表达ABCG2；RT-PCR检测SP表达ABCG2和Tie2，不表达vWF。主群细胞表达vWF；分化诱导前的肺SP表达ABCG2；分化诱导后的肺SP表达vWF。结论  CD45-/CD31+肺SP是血管内皮细胞的祖细胞，具有干细胞分化特性。在体外培养可分化为血管内皮细胞。

     

慢病毒转染和电转染原代C57BL/6小鼠神经干细胞的比较

摘要：目的  比较慢病毒与电转染两种技术转染小鼠原代神经干细胞的优劣，获得神经干细胞高效转染的方法。方法  从C57BL/6小鼠脑组织中提取神经干细胞，进行原代培养；分别进行慢病毒转染和电转染，通过观察绿色荧光蛋白在细胞中的表达，比较两种转染方法的转染效果，并用噻唑蓝（MTT）法计算相对存活率，比较两种方法转染后对细胞的影响。结果  慢病毒与电转染两种转染技术转染神经干细胞48 h后，慢病毒的转染率为（77.6±6.6）%，高于电转染法转染率[（29.2±4.8）%]，两者比较，差异有统计学意义（P <0.05）；转染72 h后，慢病毒转染的细胞荧光表达量为（60.0±3.6）%，电转染细胞的荧光表达量仅剩（12.8±2.4）%；MTT法结果显示，电转染组细胞相对存活率为（75.8±2.3）%，慢病毒转染组细胞相对存活率为（70.1±1.4）%，两者比较，差异无统计学意义（P >0.05）。结论  对于原代神经干细胞转染，慢病毒转染法比电转染法具有更高的转染效率及长久稳定性，转染后细胞存活率与电转染法接近，因此慢病毒转染法更能满足研究者的需求。

     

牙周膜干细胞膜片构建的生物性牙根生物学活性研究

目的  将经过鉴定的人牙周膜干细胞（hPDLSC）膜片分别与支架材料预处理牙本质片（TDM）和羟基磷灰石/磷酸三钙（HA-TCP）进行体外共培养,评价不同支架对干细胞分化的影响。方法  将单层牙周膜干细胞膜片与2种不同支架材料TDM和HA-TCP分别共培养1周,植入裸鼠皮下,通过扫描电镜和组织学动态观察复合体显微结构变化。结果  细胞膜片与TDM边界处结合更为紧密;边界大量矿物沉积和纤维样组织生成;而在HA-TCP组只有单一的走形相对规则的纤维组织生成,未有明显矿化沉积生成。结论  复合的hPDLSC/TDM组更适合具有生物学特点的干细胞发挥其特性,在合适的微环境下使hPDLSC向成牙周组织方向定向分化。

     

浅谈皮肤间充质干细胞的培养与鉴定

目的：从人皮肤组织中成功分离培养出皮肤间充质干细胞（SMSCs）,并将其诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及血管内皮细胞。体外长期传代培养SMSCs仍保持良好的干细胞特性,这为SMSCs的深入研究与心血管系统细胞移植提供了新的细胞来源。方法：分离、培养SMSCs,传至第5代用流式细胞仪进行表面标志鉴定;取第5代细胞分别向脂肪、成骨细胞、软骨细胞及血管内皮细胞诱导分化。结果：倒置相差显微镜下细胞呈成纤维细胞状形态,细胞表面标记物CD29、CD44、CD73、CD90、CD105呈高表达,而CD34、CD45和HLA-DR表达阴性。经诱导分化后,细胞均可分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和血管内皮细胞。结论：从人体皮肤组织中可成功分离、培养出SMSCs并能成功定向诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和血管内皮细胞,为细胞移植治疗心血管疾病提供新的原料来源。     

高胆固醇对小鼠原代成骨细胞Akt/NF-κB信号通路的影响

目的  观察高胆固醇对原代成骨细胞Akt/NF-κB信号通路的影响。方法  将小鼠原代成骨细胞按1×105接种于6孔板上,待细胞融合至80%左右,分别加入0μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml和50μg/ml的胆固醇溶液培养基继续培养24 h。采用蛋白质免疫印迹法（Western blot）的方法,检测成骨细胞核转录因子kappa B（NF-κB）和蛋白激酶B（Akt）的蛋白表达;采用实时荧光定量PCR方法,检测成骨细胞中人白细胞介素1α（IL-1α）、人白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的信使RNA（mRNA）表达;采用酶联免疫吸附法,检测细胞培养上清中IL-1α、IL-6和TNF-α的蛋白水平。结果  胆固醇诱导成骨细胞中NF-κB的增加和Akt磷酸化水平降低,增加IL-1α、IL-6与TNF-α的mRNA和蛋白表达,且呈一定的剂量依赖性。结论  高胆固醇可以通过Akt/NF-κB信号通路及其介导的炎症因子表达参与成骨细胞的调节。

     

两种分离胎盘间充质干细胞方法的比较

目的：寻找从胎盘组织中分离培养间充质干细胞的最佳方法。方法：分别采用外植块贴壁法和酶消化法从胎盘组织中分离间充质干细胞,并对其形态、免疫表型、生长动力检测和多向分化能力进行检测。结果：流式细胞术和诱导分化实验表明酶液消化法分离得到的贴壁细胞表型符合间充质多能干细胞特征,且在合适诱导条件下能向造骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化,而外植块贴壁法获得的贴壁细胞弱表达CD29和CD105,仅能向脂肪细胞分化。结论：酶消化法可有效的从胎盘组织中分离间充质干细胞,增殖能力强,具备多向分化能力。     

脂肪干细胞原代培养及诱导成肌细胞的实验研究

目的 探讨大鼠脂肪干细胞(ADSC)的培养及诱导分化为成肌细胞的方法 .方法 取SD大鼠脂肪组织,酶消化法分离、培养ADSC,免疫荧光和流式细胞仪检测相关表面抗原CD90、CD105和CD34的表达.取培养至第2代处于对数生长期细胞,分别用含5-氮杂胞苷(5-aza)的诱导培养液(诱导组)和基础培养液(对照组)进行培养.诱导时间为7、14、21、28和35 d,倒置相差显微镜观察细胞的生长情况和形态变化,免疫荧光和流式细胞仪检测成肌细胞特异性抗原desmin和myosin的表达.结果 成功从大鼠脂肪组织分离、培养出ADSC,相关表面抗原表达检测证实其干细胞特性.诱导组细胞诱导28 d后呈现成肌细胞特有的"漩涡"样生长形态,单个细胞表现出多核化;免疫荧光和流式细胞仪检测显示,desmin和myosin的表达率在诱导28 d时达最高,分别为52.57%和50.04%,而诱导前和对照组细胞均呈阴性表达.结论 成功从大鼠脂肪组织分离、培养ADSC,含5-aza的诱导培养液可将其诱导分化为成肌细胞,诱导 28 d成肌细胞特异性抗原表达率最高.     

子宫内膜基质干细胞的成骨及成软骨诱导分化研究

目的研究子宫内膜基质干细胞在特定培养条件下向成骨及成软骨细胞分化,探讨其作为骨组织工程的种子细胞的可行性。方法取15例因子宫肌瘤行全子宫切除术患者的内膜组织,磁珠分选法获得子宫内膜基质干细胞,用成骨诱导和成软骨诱导培养基诱导,组织化学染色检测其向成骨和成软骨细胞分化的情况。结果从人子宫内膜组织中培养出基质干细胞,能稳定增殖传代。在成骨诱导培养基诱导下子宫内膜基质干细胞茜素红染色出现钙结节;成软骨诱导培养基诱导下,阿利新兰染色呈阳性。结论从子宫内膜组织中可获得具有多向分化潜能的基质干细胞,并能在体外稳定增殖传代,经诱导后可分化为成骨细胞和成软骨细胞,有可能成为骨组织工程较理想的种子细胞之一。     

人脐带间充质干细胞分离培养建立及其生物学特性观察

目的:建立从人的脐带组织中分离和培养脐带间充质干细胞(UC-MSCs)的方法,并探讨UC-MSCs的生物学特性。方法:分别采用原代贴壁培养法和酶消化法(胶原酶Ⅱ和胰酶)分离培养UC-MSCs,瑞氏染色观察细胞形态,流式细胞术检测第3代以后的UC-MSCs表面特异标志物表达,MTT法检测P7细胞增殖情况。UC-MSCs同外周血单个核细胞共培养后,用MTT法测定细胞增殖率,Hoechst与PI双染色,观察UC-MSCs对健康人淋巴细胞增殖的影响。结果:原代贴壁培养法1周左右可见成纤维样细胞从组织块边缘爬出,成簇生长;酶消化法3~5天可见成纤维样细胞均匀生长。传代培养后,UC-MSCs均呈长梭形、旋涡状生长;细胞核大,核仁清晰;免疫表型:CD29阳性率为(95.71±2.23)%,CD31和CD34阳性率分别为(2.47±0.54)%和(3.24±0.34)%;第7代UC-MSCs仍具有较强的分裂增殖能力。UC-MSCs对淋巴细胞的增殖反应具有抑制作用,呈细胞数量剂量依赖性,而淋巴细胞对UC-MSCs的生长未见影响。结论:从人脐带中成功分离培养的细胞具有UC-MSCs生物学特性。     

人脐带间充质干细胞原代培养方法的改良

目的: 探讨体外组织块培养原代人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)的改良方法,并观察其形态,免疫表型,成脂成骨分化等生物学特性。方法: 从健康足月儿获得脐带,将血管剥离后,余下的结缔组织剪成小块,分别用传统植块法和改良植块法分离培养原代hUC MSCs。MTT法检测细胞增殖情况并绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞免疫表型,成脂成骨诱导分化检测其分化潜能,化学染色鉴定诱导分化结果。结果： 改良植块法脐带组织贴壁培养3～4 d即可从组织块边缘长出长梭形成纤维样原代细胞,5～6 d后细胞可长满80%,比传统植块法原代细胞培养周期缩短了一半以上时间,细胞传代后流水状或漩涡状生长,MTT法显示细胞增殖能力强,流式细胞仪检测提示CD90, CD105,CD73,CD166,CD29,CD44均阳性表达,阳性率均在95%以上,CD45和HLA-DR均阴性表达,阳性率低于2%;诱导分化实验及化学染色结果证实, 该细胞具有成脂和成骨多向分化潜能。结论：应用与酶消化法相结合的改良植块法可以获得hUC-MSCs,比传统植块法缩短了原代培养周期,提高了细胞培养效率,所获得细胞贴壁生长,增殖能力强,表达间充质干细胞相关免疫表型,具有多向分化潜能,可在科研和临床应用中作为种子细胞来源。     

人骨髓间充质干细胞分离培养及多向分化的实验研究

目的:探索体外分离子与培养人骨髓间充质干细胞的方法,同时研究其细胞生物学特性,分析其作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法:分离人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stemcells,hBMSCs),通过常规培养,在体外观察其生长特性、抗原表达等特征;然后通过条件培养基定向诱导,观察其分化潜能。结果:人骨髓间充质干细胞在体外可以大量增殖,常规培养条件下,原代培养需要2～3周,转代后生长速度加快;应用流式细胞仪检测MSCs的表面抗原,CD44、CD29、CD105阳性,CD45、CD06、CD34以及HLA-DR阴性;在相应条件培养基的诱导作用下,MSCs可以分化为成骨细胞、软骨细胞以及神经细胞。结论:人骨髓间充质干细胞可以从骨髓中分离并在体外培养增殖,同时在体外具有多向分化潜能,可以分化成为骨细胞,符合骨组织工程种子细胞的要求。     

兔脂肪干细胞的体外成脂成骨诱导及BrdU标记情况的初步研究

目的探索兔脂肪间充质干细胞体外分离培养的方法及生物学特性,并探讨5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记脂肪间充质干细胞的效果。方法取兔颈后脂肪采用胶原酶消化方法分离培养干细胞,诱导培养基定向成脂、成骨细胞诱导及组织化学鉴定。采用BrdU法标记干细胞,免疫组化法鉴定其体外标记情况。结果兔脂肪组织中可以分离培养出生长旺盛的干细胞,定向诱导后表现出成脂,成骨细胞的特性。BrdU可标记干细胞的核,体外标记率达95%。结论兔脂肪干细胞易于体外分离培养,具有较强的自我更新能力及多向分化的潜能。BrdU对脂肪干细胞的标记效果满意,操作简单易行。     

低温冻存对人脂肪间充质干细胞生物学特性的影响

目的: 比较人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,hADSCs)冻存前和复苏后的生物学特性,为今后建立低温干细胞库提供实验支持。方法： 采用0.1%Ⅰ型胶原酶消化法从腹部大网膜脂肪组织中分离hADSCs,体外培养扩增,将处于均一稳定生长状态的第3代hADSCs置于液氮中分别冻存1、3和6个月,复苏后台盼蓝染色检测细胞存活率,采用MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞表面抗原,成脂成骨诱导后鉴定多向分化能力,RT PCR检测成脂特异性基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ-2(peroxisome proliferator activated receptorγ-2,PPARγ-2)和成骨特异性基因骨钙素(osteocalcin,OC)的表达情况。结果： 随冻存时间的延长细胞存活率略有下降,但差异无统计学意义(P＞0.05)。MTT结果显示冻存前后细胞增殖能力均很强。流式细胞检测结果显示冻存前后细胞均高表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166,低表达CD45和HLA-DR。冻存前后hADSCs均具有向脂肪细胞和骨细胞分化潜能,且RT-PCR结果显示,PPARγ-2和骨钙素mRNA的表达冻存前后差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论： 经液氮冻存后的hADSCs具有高存活率,生物学特性保持稳定且仍具有多向分化潜能。     

人脐带间充质干细胞分离扩增方法的优化

【目的】 探究一种高效稳定分离、扩增人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）的方法。【方法】取材脐带20条,获得Wharton’s Jelly组织,分别用酶联合消化法（12例）和酶序贯消化法（8例）来分离、提取hUC-MSCs,比较两种方法分离hUC-MSCs的成功率、原代培养时间及获得的细胞数量;利用低糖DMEM（LG-DMEM）完全培养基和LD-Mesen培养基（MesenPro RSTM与LG-DMEM的混合培养基）分别培养hUC-MSCs,比较两种培养体系的扩增效率。对所获取细胞的免疫表型以流式细胞术进行鉴定,并诱导成脂、成骨分化验证其多向分化潜能。【结果】 酶联合消化法和酶序贯消化法成功率分别为100%（12/12）和12.5%（1/8）,二者相比有显著统计学差异（P=1.03×10-4）,前者原代培养平均时间为（14.17±1.14）d,获得细胞（1.30±0.14）×106个。2×105个hUC-MSCs用LD-Mesen和LG-DMEM两种体系培养12d后,扩增所得的细胞数分别为(14.86±0.08)×106和(5.08±0.08)×106,二者有显著统计学差异（P=1.38×10-8)。hUC-MSCs高表达CD73、CD105、CD90、CD29、CD44,不表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR;并可向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化。【结论】 酶联合消化Wharton’s Jelly组织并以LD-Mesen体系进行扩增可高效获取hUC-MSCs,效率明显优于传统方法。     

优化组织块法体外培养新生SD大鼠原代成骨细胞与鉴定

分别采用传统组织块法、传统酶消化法和优化组织块法进行新生SD大鼠原代成骨细胞体外分离和培养,并对培养出的细胞予以鉴定和比较。优化组织块法可短期内培养出大量纯度高的成骨细胞,具有典型的形态特征和成骨能力,碱性磷酸酶(ALP)染色、Ⅰ型胶原免疫荧光均呈阳性,ALP检测活性可达92%。该法优于其他两种方法,提供了一种切实可行、操作简单的体外原代成骨细胞培养方法。