TWEAK在肝癌细胞系高/低淋巴道转移株中表达的初步分析

[目的]研究肿瘤坏死因子样弱凋亡因子（TWEAK）在小鼠腹水型肝癌细胞系高／低淋巴道转移株（Hca—F／Hca—P）中的表达及差异。[方法]分别提取Hca—F和Hca—P细胞的总RNA，通过RT—PCR在mRNA水平检测TWEAK基因的表达；提取Hca—F和Hca—P细胞的总蛋白，用蛋白印迹法从蛋白表达水平验证差异表达。[结果]RT—PCR检测到两株细胞均在358bo处出现特异性扩增的条带，并且Hca—F的条带亮度低于Hca—P，图像分析显示，Hca—F细胞中TWEAK的转录子含量低于Hca—P细胞（P〈0．05）；蛋白免疫印迹法验证两株细胞表面均有TWEAK蛋白的表达，Hca—P强于Hca—F，与基因芯片的结果一致。[结论]TWEAK在鼠腹水型肝癌细胞系Hca—F和Hca—P均有表达，且Hca—F中较低，而在Hca—P中表达较高。这说明了TWEAK可能与淋巴道转移有关，同时可能参与了细胞的凋亡与组织分化。     

小鼠高低转移性肝癌微卫星不稳定性的研究

目的：了解小鼠高、低转移性肝癌细胞系Ｈｃａ／１６Ａ３－Ｆ（Ｆ）和Ｈｃａ／Ａ２－Ｐ（Ｐ）发生微卫星不稳定性（ＭＳＩ）情况,探讨它们与肝癌发生及转移之间的关系。方法：随机选择３号和１６号染色体上１５个多态微卫星标记,采用聚合酶链式反应－简单重复序列多态性（ＳＳＬＰ）和单链构象多态性（ＳＳＣＰ）方法对Ｆ和Ｐ细胞系进行分析。结果：Ｆ和Ｐ细胞系有信息的微卫星位点其等位基因与Ｃ３Ｈ相同,且存在多位点ＭＳＩ。结     

小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移瘤株Hca-F的再克隆技术

[目的 ]探讨小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移瘤株Hca -F的再克隆技术。 [方法 ]采用有限稀释法对已使用多年的小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移瘤株Hca -F进行再克隆 ;6 15小鼠皮下接种 ,检测再克隆瘤株淋巴结转移能力。 [结果 ]共分离出 3个不同的瘤株 ,Hca -F - 2 - 2 4c6 ,Hca -F -3-d4 ,Hca -F - 3-a4 ,流式细胞仪检测证明 3株瘤细胞均为单克隆细胞。动物实验证明三株瘤细胞淋巴结转移率分别为 95 .5 % ,87% ,4 2 .5 %。 [结论 ]有限稀释法操作简单 ,克隆的形成率高     

E-选择素基因多态性与冠心病相关性研究

目的：探讨E-选择素基因多态性与中国人群冠心病发病的关系。方法：93例年龄≤60岁的冠心病患者和97例年龄性别匹配的非冠心病对照者，运用聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR—SSCP)和直接测序技术对E-选择素基因全部外显子及其两翼的部分内含子进行筛查。结果：发现3个E-选择素基因多态性：2号外显子5’非翻译区存在G98→T所致的G98T多态性(G／T等位基因)；4号外显子EGF结构域中仔在A561→C所致的Sel128Arg多态性(A／C等位基因)；11号外显子膜结构域中存在一个新的A1856→G所致的A1856G多态性(A／G等位基因)。在冠心病组中，T和C等位基因频率显著高于对照组(P=0．01，P=0．03)。结论：T和C等位基因可能是中国人群中年龄≤60岁冠心病患者的遗传危险因素。     

P15逆转肝癌多药耐药的机制研究

目的：探讨P15逆转肝癌多药耐药（MDR）的可能机制．方法：①采用顺铂（CCDP）诱导法,建立肝癌HepG2细胞动态MDRHepG2／CDDP细胞模型;②在动态MDRHepG2／CDDP细胞模型中,RT—PCR检测P15mRNA的表达,WesternBlot检测P15蛋白的表达;③建立稳定转染P15正义表达载体的HepG2／CDDP—P15细胞系及转染pcDNA3．1（＋）空载体的HepG：／CDDP—PC对照细胞系;④流式细胞仪检测转染细胞HepG2／CDDP—P15,HepG2／CDDP—PC和亲本HepG2／CDDP的细胞周期及阿霉素（ADR）的蓄积和潴留;⑤WesternBlot检测耐药经典分子MRP-1和P-糖蛋白（P—gP）的表达．结果：HepG2／CDDP动态耐药细胞模型建立成功;P15的mRNA表达水平随着HepG2／CDDP耐药细胞株耐药表型的增强逐渐下降;上调p15基因的表达可显著提高HepG2／CDDP耐药细胞株细胞内ADR的蓄积和潴留,促进G1期细胞阻滞,抑制肿瘤细胞增殖,下调MRP-1,P-gP蛋白的表达．结论：P15与肝癌细胞MDR关系密切,其表达水平随着肝癌耐药细胞株耐药表型的增强而逐渐下降;上调P15的表达,可有效逆转肝癌HepG2／CDDP耐药细胞株的耐药表型．     

小鼠脊髓发育遗传参数的研究

目的：进行小鼠脊髓发育形态学数据测定，研究遗传参数。方法：取4种近交系小鼠，A／J；C57BL／6J；DBA／2J；129xl／SvJ以及A／J与C57BL／6J杂交的F1和F2代重组个体，多聚甲醛灌注后进行脊髓重量、颈膨大截面积、灰质百分比的测定。结果：数据显示在4个近交系中，A／J与C57BL／6J脊髓发育差别最大，A／J为小脊髓(平均重65．21mg，截面积2．69mm^2；C57BL／6J为大脊髓，平均重81．58mg，截面积3．06mm^2)。在该近交系与重组小鼠中，脊髓发育的遗传度为30％～40％，最少控制基因数为2～4。结论：小鼠中脊髓发育存在超显性现象，通过小鼠脊髓形态测定获得了发育相关的遗传参数，为脊髓发育数量性状基因座(QTL)和控制基因的确认提供了资料。     

人胃癌细胞系BGC—823的遗传不稳定性

目的：研究人胃癌BGC－823细胞系的遗传不稳定性。方法：应用染色体G－分带、核型分析和PCR及银染技术。结果：BGC－823细胞系染色体众数为亚三倍体。规律性出现3个标记染色体，1号染色体短臂部分缺失。部分核型出现双微小体。微卫星位点D9s171为纯合性缺失，D9s1604为杂合性缺失。结论：BGC－823细胞系在染色体水平和DNA水平均表现遗传不稳定性。     

转移性肝癌患者性激素受体变化的临床意义

目的：探讨性激素受体在转移性肝癌中改变的临床意义；方法：用放射配体结合法测定２１例转移性肝癌和２３例原发性肝癌外周血白细胞雌激素受体（ＥＲ）和白细胞雄激素受体（ＡＲ）；结果：转移性肝癌ＥＲ水平明显低于原发性肝癌ＥＲ（Ｐ〈０．０１）。两组ＡＲ水平无显著差异（Ｐ〉０．０６）。两组ＥＲ置信区域基本不重叠；结论：转移性肝癌可能系非激素依赖性肿瘤，ＥＲ６００位点／细胞可作为区分转移性肝癌和原发性肝癌判断标准     

疏肝清热消积颗粒对 H22荷瘤小鼠细胞免疫及生存期的影响

目的：观察疏肝清热消积颗粒对H22荷瘤小鼠免疫状态及生存期的影响。方法取昆明种小鼠48只，随机分为空白对照组A，阴性对照组A，槐耳颗粒对照组A及高剂量组A、中剂量组A、低剂量组A，除空白对照组A外，以接种H22小鼠肝癌细胞建立肝癌模型，造模同时分别给药：空白对照组A、阴性对照组A分别喂蒸馏水，槐耳颗粒对照组A喂槐耳颗粒，高、中、低剂量组A分别喂疏肝清热消积颗粒18．75、12．5、6．25 g／kg，14 d后进行外周血T淋巴细胞亚群检测，取脾脏细胞以MTT法测定ConA诱导下T淋巴细胞增殖活性。另取昆明种小鼠36只，同样造模分组，分为空白对照组B、阴性对照组B、槐耳颗粒对照组B及高剂量组B、中剂量组B、低剂量组B，按以上方法给药14 d后观察生存期。结果免疫情况：阴性对照组A CD3＋／总单个核细胞较空白对照组A低（P＜0．05）；疏肝清热消积颗粒高剂量组A CD3＋／总单个核细胞、CD3＋CD4＋／CD3＋、CD3＋CD8＋／CD3＋比阴性对照组A高（P＜0．05）；高剂量组A、空白对照组A T淋巴细胞增殖活性高于阴性对照组（P＜0．05）。生存期：高剂量组B荷瘤小鼠生存期较阴性对照组B长（ P＜0．05）；中剂量组B、低剂量组B、槐耳颗粒对照组B荷瘤小鼠生存期较阴性对照组B均有一定延长，但差异无统计学意义（P＞0．05）。结论高剂量疏肝清热消积颗粒可能可以改善H22荷瘤小鼠的免疫功能，有助于抑制肝癌细胞生长，从而延长生存期。     

不同转移潜能的人前列腺癌细胞原位转移模型的建立与比较

目的 建立不同转移潜能的人前列腺癌细胞转移模型，并比较其结果。方法 利用人前列腺癌细胞系PC3单克隆细胞株裸鼠皮下移植瘤，通过外科原位移植技术植入BALB／c-nu／nu雄性裸小鼠，建立人前列腺癌高、低转移细胞株转移模型；并观察比较两细胞株转移模型的原位成瘤率、自发转移率、两细胞株形态学特征和转移抑制基因CD44s的表达。结果 人前列腺癌高转移细胞株裸鼠原位种植后原位成瘤率100％，主动脉旁淋巴结转移率为100％，低转移细胞株裸鼠原位种植后原位成瘤率100％，主动脉旁淋巴结转移率为40％，两者主动脉旁淋巴结转移率差异有显著性（P〈0．05）。高、低转移细胞株形态学特征亦不同。CD44s蛋白在人前列腺癌高转移性单克隆细胞株PC3-H中的表达强度低于低转移性单克隆细胞株PC3-L。结论 遗传背景相似的人前列腺癌高、低转移细胞株原位移植转移模型为研究人前列腺癌转移机制提供了有力工具。     

层粘连蛋白对两株小鼠肝癌克隆细胞系体外附壁及浸润的影响

Ｈｃａ－Ｆ和Ｈｃａ－Ｐ细胞系是从小鼠癌中分离出来的具有不同转移能力的两株克隆。在Ｃ３Ｈ／ｈｅｊ小鼠实验组显示，Ｆ细胞比Ｐ细胞具有较强的侵袭力和淋巴道转移能力。在体外附壁实验中，Ｆ细胞比Ｐ细胞更易贴附于层粘连蛋白上，而且，在后者加上Ⅳ型胶原基质后，Ｆ细胞的贴壁能力更增强；纤维连接蛋白加上Ⅳ型胶原可促进Ｐ细胞贴壁。     

肝癌细胞系MHCC97亚群中甲胎蛋白的表达差异

目的：探讨甲胎蛋白（AFP）在不同肝癌细胞亚群中的表达差异．方法：应用流式细胞荧光激活分选法将肝癌细胞分成边缘群（SP）及非边缘群（Non—SP）2个细胞亚群,采用免疫细胞化学方法观察AFP在2个不同肝癌亚群中的表达变化及含量．结果：SP细胞仅占细胞总体的1．8％,SP细胞AFP表达明显高于Non—SP细胞（P〈0．01）．结论：AFP在肝癌细胞中表达有差异,强阳性多数分布在SP细胞亚群中,进一步证实了肿瘤的异质性．     

索拉菲尼诱导的肝癌耐药细胞株的建立及基因表达分析

目的 建立索拉菲尼诱导的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)耐药细胞株,筛选出耐药细胞株中的高表达基因,进一步探讨肝细胞癌中与索拉菲尼耐药的相关基因.方法: 选取人肝癌细胞株PLC及Huh7,采用药物间歇诱导法分别建立索拉菲尼诱导的耐药细胞株,运用高通量测序技术(RNA-Seq)测定两株耐药细胞株中高表达基因,运用生物信息学数据库分析高表达基因与肝癌临床生物学指标相关性,筛选出肝癌耐药机制中可能参与的基因.结果: 通过基因测序得到两株肝癌耐药细胞株中的高表达基因,在设定的限定条件下进行进一步筛选, 限定条件为两株耐药细胞中共同表达的基因且表达差异倍数大于4倍,差异具有统计学意义(P<0.05),发现两株耐药细胞共同表达前12位基因符合限定条件,进一步运用Ualcan数据库分析12个基因与肝癌组织表达水平,分期,分级及生存的关系,筛选出符合条件的基因CBX4.结论: 成功构建了索拉菲尼诱导的肝癌耐药细胞株,并筛选出与索拉菲尼耐药相关基因CBX4,为进一步耐药机制探讨提供依据.     

索拉菲尼诱导的肝癌耐药细胞株的建立及基因表达分析

目的 建立索拉菲尼诱导的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)耐药细胞株,筛选出耐药细胞株中的高表达基因,进一步探讨肝细胞癌中与索拉菲尼耐药的相关基因.方法: 选取人肝癌细胞株PLC及Huh7,采用药物间歇诱导法分别建立索拉菲尼诱导的耐药细胞株,运用高通量测序技术(RNA-Seq)测定两株耐药细胞株中高表达基因,运用生物信息学数据库分析高表达基因与肝癌临床生物学指标相关性,筛选出肝癌耐药机制中可能参与的基因.结果: 通过基因测序得到两株肝癌耐药细胞株中的高表达基因,在设定的限定条件下进行进一步筛选, 限定条件为两株耐药细胞中共同表达的基因且表达差异倍数大于4倍,差异具有统计学意义(P<0.05),发现两株耐药细胞共同表达前12位基因符合限定条件,进一步运用Ualcan数据库分析12个基因与肝癌组织表达水平,分期,分级及生存的关系,筛选出符合条件的基因CBX4.结论: 成功构建了索拉菲尼诱导的肝癌耐药细胞株,并筛选出与索拉菲尼耐药相关基因CBX4,为进一步耐药机制探讨提供依据.     

Cathepsin B、uPA和uPAR基因在肝细胞肝癌中的表达、相互关系及作用

目的：探讨肝细胞肝癌（HCC）组织中组织蛋白酶B（CB）、尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）及其受体（uPAR）基因的表达、相互关系及作用，并分析其机制。方法：应用RT—PCR方法测定71例肝组织标本，包括对照组（C）12例，HCC组34例和癌旁组织（PTT）组25例的CB mRNA、uPA mRNA、uPAR mRNA表达，分析其间的相关性。结果：HCC组CB mRNA、uPA mRNA、uPAR mRNA表达均明显高于C组和PTT组，差异有显著性（P〈0．01），PTT组与C组间差异均无显著性（P〉0．05）。CB mRNA与uPA mRNA（r=0．805），CB mRNA与uPAR mRNA（r=0．786），uPA mRNA与uPAR mRNA（r=0．874）之间均存在显著的正相关关系（均P〈0．01）。结论：肝癌组织CB mRNA、uPA mRNA、uPAR mRNA均呈现高表达，它们之间可能相互诱导，协同促使肝癌的侵袭和转移。     

Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1促进肝癌细胞的转移

目的:探讨Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1(ROCK1)在肝癌中的表达及在肝癌侵袭中的作用?方法:荧光定量PCR(real-time PCR)检测肝癌及癌旁组织中ROCK1的mRNA表达水平,同时检测肝癌细胞系及正常人肝细胞中ROCK1mRNA表达水平,免疫组织化学染色(IHC)法检测肝癌及癌旁组织中ROCK1蛋白的表达量,并通过在肝癌细胞株中过表达及干扰ROCK1分析ROCK1蛋白对肝癌细胞转移的作用?结果:60对样本中有42对ROCK1的mRNA表达水平在肝癌组织中高于癌旁组织,免疫组织化学染色提示肝癌组织中ROCK1蛋白表达量高于癌旁组织?在体外肝癌细胞的功能实验中,过表达ROCK1能促进HepG2细胞的侵袭和转移,而干扰ROCK1的表达能减少SMMC-7721细胞的侵袭和转移?结论:ROCK1在肝癌组织中高表达,过表达ROCK1能促进肿瘤的侵袭及转移,ROCK1可能成为临床治疗中抑制肿瘤侵袭和转移的靶点?     

Enhanced expression of HLA class I molecules in human hepatocellular carcinoma cells transduced with gamma-interferon gene.

OBJECTIVE To investigate the expression of exogenous gamma-interferon gene in human hepatocellular carcinoma cells following retroviral transduction and the effect on the expression of surface HLA class I molecules.

METHODS Retroviral vector pLXSN was used to introduce human gamma-interferon (IFN-gamma) gene into four different human hepatocellular carcinoma cell lines (HCC). The G418-resistant colonies were isolated and cloned. The integration and expression of IFN-gamma gene were determined by PCR and RT-PCR analysis. A bioassay method was used to test the amount of IFN-gamma secreted by gene modified HCC cells. The expression of HLA class I molecules in HCC cells were analyzed by flow cytometry using indirect fluorescence staining.

RESULTS Four different HCC cell lines were successfully transduced with human IFN-gamma gene using retroviral vector. The integration and expression of IFN-gamma gene were shown only in the transduced cells. All four genetically modified HCC cells can secrete varied amount of IFN-gamma and demonstrate a significant up-regulation of surface HLA class I antigens. One specific HLA class I antigen, HLA-A2, has almost the same degree of increase as that of the total HLA class I molecules after transduction with IFN-gamma gene.

CONCLUSIONS Gene modification with IFN-gamma gene can significantly enhance the expression of HLA class I molecules in HCC cells and may increase its immunogenicity. These gene modified tumor vaccines can be helpful in tumor biotherapy.

     

小鼠骨髓间充质干细胞接种小鼠肝癌组织诱发肝癌细胞坏死

目的:观察小鼠骨髓间充质干细胞(mesenehymal stem cells,MSCs)移植对H22原位肝癌移植小鼠生存期的影响,探讨小鼠骨髓MSCs在肝癌微环境中是否向肝细胞分化和可能的抗肿瘤机制.方法:体外利用贴壁培养法联合免疫磁珠阴性分选CD45-、CD11b-细胞法制备BALB/c小鼠骨髓MSCs,流式细胞仪行细胞表面标志鉴定,采用绿色荧光染料羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯[5(6)-carboxyfluoresce indiacetate N-succinimidyl ester,CFSE]对其标记后备用.随机取12只8周龄BALB/c小鼠,肝脏原位注射法建立小鼠H22原位肝癌移植模型,建模1周后随机分为MSCs移植组和对照组,开腹亢视下分别注射入肝癌组织和/或同一肝叶的正常肝组织内.观察荷瘤小鼠生存期,利用免疫荧光法和激光共聚焦技术检测小鼠肝组织白蛋白表达,并行常规组织学检查.结果:MSCs移植组平均生存期为25 d(95%可信区间:22～28 d),对照组平均生存期为21 d(95%可信区间:20～23 d),但组间生存期差异无统计学意义(P=0.0713).激光共聚焦显微镜观察到在肿瘤边缘和瘤体内可见CFSE标记细胞有白蛋白表达;另与对照组相比,MSCs移植组肝癌组织内出现大片坏死.结论:小鼠骨髓MSCs可在原位肝癌移植小鼠模型的肝脏定植,并且能分化为具有肝细胞功能的肝细胞样细胞,同时可能诱发肿瘤细胞坏死,机制有待进一步研究.