定量PCR检测对侵袭性真菌感染肺组织标本病原真菌的诊断价值

目的探讨应用定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测技术诊断侵袭性真菌感染(invasive fungal infection,IFI)肺组织标本病原真菌的临床意义。方法收集2010年6月至2016年6月间我院行手术切除且病理诊断为真菌感染的肺组织标本33例和同期非真菌感染的正常肺组织标本10例为研究对象,设计针对真菌的通用引物和针对隐球菌属和曲霉菌的特异性引物,采用PCR技术和双脱氧链终止法(Sanger法测序)检测石蜡包埋肺切除组织中的真菌。结果实验组33例真菌感染的肺组织标本PCR检测结果均为阳性,与病理诊断相符,Sanger测序可以鉴定真菌到种别。PCR检测与Sanger测序敏感性差异无统计学意义(P>0.05),PCR检测与Sanger测序特异性差异无统计学意义(P>0.05);PCR检测与镜检的种属鉴定率差异有统计学意义(P<0.05),PCR检测与Sanger测序的种属鉴定率差异无统计学意义(P>0.05)。结论定量PCR检测用于诊断侵袭性真菌感染肺组织标本敏感性高、特异性好,具有一定参考意义。     

血清乳胶凝集试验对肺隐球菌病的临床诊断价值

目的 评价乳胶凝集试验检测血清隐球菌荚膜多糖抗原对肺隐球菌病的临床诊断价值.方法 2000年7月至2007年7月期间,根据临床表现及影像特征,疑诊肺部隐球菌感染的患者27例,全部进行血清乳胶凝集试验和肺活检组织病理检查.结果 经病理证实肺隐球菌病9例,乳胶凝集试验全部阳性,非隐球菌感染患者18例,乳胶凝集试验全部阴性.乳胶凝集试验的敏感性和特异性均为100%.结论 血清乳胶凝集试验对肺隐球菌病具有很高的诊断价值.     

新型隐球菌聚合酶链反应的检测方法

目的：从基因角度为新型隐球菌性脑膜炎的快速诊断提供一种新方法．方法：应用聚合酶链反应技术检测和鉴定脑脊液中的新型隐球菌特异性基因．结果：对引物的特异性试验证明具有较高的特异；对引物的敏感性试验可扩增出１０个菌细胞；用墨汁复染、分离培养、ＰＣＲ技术，对１５例脑膜炎患者的脑脊液同时进行检测，结果分别为：６６．６％、８６．６％、９３．３％．结论：以新型隐球菌特异性基因片段进行体外扩增，对新型隐球菌性脑膜炎的早期诊断具有重要的临床意义．     

支气管肺泡灌洗液隐球菌荚膜多糖抗原胶体金法对肺隐球菌病的诊断价值

目的探讨支气管肺泡灌洗液(BALF)中的隐球菌荚膜多糖抗原胶体金免疫层析法(CrAg-LFA)检测对肺隐球菌病的诊断价值。方法应用前瞻性研究方法收集2015年3月至2018年10月厦门大学附属中山医院、福建医科大学附属第二医院、福建医科大学附属漳州市立医院、福建医科大学附属泉州第一医院4家住院患者,经肺组织活检病理确认的非人类免疫缺陷病毒感染患者分为肺隐球菌病组72例,非肺隐球菌病组236例。患者均行血清和BALF CrAg-LFA检测及微生物培养。结果肺隐球菌病组中,血清CrAg-LFA阳性54例,阴性18例,培养隐球菌阳性1例,阴性71例;BALF CrAg-LFA阳性67例,阴性5例,涂片或培养隐球菌阳性9例,阴性63例。非肺隐球菌病组中,血清CrAg-LFA弱阳性1例,阴性235例;血清培养97例,无隐球菌生长;BALF CrAg-LFA检测236例,均阴性,培养121例,无隐球菌生长。血清CrAg-LFA检测的敏感性为75.0%,特异性为99.6%,阳性预测值为98.2%,阴性预测值为92.9%;BALF CrAg-LFA检测的敏感性为93.6%,特异性为100.0%,阳性预测值为100.0%,阴性预测值为97.9%。肺隐球菌病组BALF CrAg-LFA检测的敏感性高于血清,差异有统计学意义(χ~2=8.745,P0.05)。结论 CrAg-LFA检测快速、简单,对肺隐球菌病的诊断BALF比血清有更大的临床意义,BALF CrAg-LFA阳性结果等同于微生物学阳性的诊断价值。     

荧光定量PCR和环介导等温扩增方法检测隐球菌CAP10基因的比较研究

目的建立荧光定量PCR和环介导等温扩增技术(LAMP)检测隐球菌荚膜相关蛋白基因(CAP10)的方法,并比较和评价两种方法的优缺点。方法针对新型隐球菌CAP10基因序列,使用在线软件设计引物,并构建质粒标准品,优化反应条件后用荧光定量PCR和LAMP两种方法检测定量的质粒,分析其敏感性和特异性,并检测临床标本。结果荧光定量PCR检测CAP10质粒的敏感性为6.8×101拷贝,LAMP方法的敏感性为6.8×103拷贝,PCR检测阳性率比LAMP方法高。两种方法特异性好,对脑膜炎奈瑟菌、白色念珠菌、热带念珠菌、黄曲霉、黑曲霉和大肠埃希菌的检测结果均为阴性。结论成功建立了检测CAP10基因的荧光定量PCR方法敏感性和特异性高,但是需要特殊仪器;LAMP方法敏感性较低,但其操作简单,无需特殊仪器和设备,加入核酸染料即能观察结果。两者均适用于新型隐球菌感染的检测。     

真菌抗原检测在侵袭性肺真菌病诊断中的价值

目的探讨真菌抗原检测在侵袭性肺真菌病诊断中的价值。方法对120例肺部真菌感染住院患者中病理确诊和临床诊断侵袭性肺真菌病的83例住院患者进行回顾性调查。结果 120例患者中经过病理确诊侵袭性肺真菌病17例,临床诊断肺侵袭性真菌病66例,拟诊真菌性肺炎37例。其中侵袭性肺念珠菌34例[血清甘露聚糖抗原检测诊断念珠菌肺炎20例(58.82%)],侵袭性肺曲霉菌病15例[血清半乳甘露聚糖抗原检测阳性诊断曲霉菌肺炎8例(53.33%)],侵袭性肺隐球菌病3例[隐球菌荚膜多糖抗原检测诊断隐球菌肺炎2例(66.67%)]。血清甘露聚糖抗原检测诊断念珠菌肺炎确诊的20例与真菌镜检、培养等方法诊断的34例比较,阳性率较低(58.82%,20/34);血清半乳甘露聚糖抗原检测阳性诊断曲霉菌肺炎确诊的8例与真菌镜检、培养和组织病理学检查等方法诊断的44例比较,阳性率较低(20.45%,8/44);血清隐球菌荚膜多糖抗原检测阳性诊断隐球菌肺炎确诊的2例与真菌镜检与培养和组织病理学检查等方法诊断的3例比较,阳性率较高(66.67%,2/3);半乳甘露聚糖抗原法敏感性18.18%,特异性92.86%;隐球菌荚膜多糖抗原法敏感性40.00%,特异性75.00%;甘露聚糖抗原检测法敏感性58.82%,特异性85.71%。结论真菌抗原可用于侵袭性肺真菌病的早期检测,辅助肺真菌病的早期诊断。     

纤维支气管镜肺活检诊断肺隐球菌病17例临床分析

目的 探讨纤维支气管镜肺活检诊断肺隐球菌病的临床表现、病理学特点及其相互关系,并对该病的病因及发病机制进行简略探讨.方法 分析纤维支气管镜肺活检的17例肺隐球菌病例的组织切片,对其临床表现、病理学特点、组织化学及免疫组织化学检测状况进行研究.结果 肺隐球菌病临床及影像学表现均无特异性.纤维支气管镜下为充血、水肿,表面附有灰白色黏液胶样物.病理组织学特征主要为隐球菌性炎性肉芽肿或凝固胶样非干酪状坏死,周围纤维组织增生及淋巴细胞浸润等改变.结论 肺隐球菌病的确诊有赖于病理组织学检查;纤维支气管镜肺活检是该病早期诊断的重要手段;病灶区T淋巴细胞增多提示患者预后好,反之预后差.     

多重聚合酶链反应快速检测脑膜炎中的病原体

目的 建立脑膜炎多重PCR检测系统,以在一次扩增中快速、特异地同时检出新型隐球菌、结核杆菌、脑膜炎双球菌,用于脑膜炎病原体感染的快速诊断。方法 根据新型隐球菌URA保守序列、脑膜炎双球菌基因组中特定的H.8外膜蛋白基因序列、结核分枝杆菌基因组中的IS986插入基因序列片段,分别设计出3对特异性寡聚核苷酸引物,采用多重PCR技术,同时检出脑脊液中的新型隐球菌、结核杆菌、脑膜炎双球菌。结果 应用多重PCR反应体系,对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果：我重PCR扩增的预期结果为：单一菌感染出现一条特异性扩增区带;混合感染应出现2条或3条特异性扩增区带,经实验达到预期的扩增结果;对15份已明确诊断的脑脊液标本,分法均能扩增出预期的目的片段。符合率达100%,对20例临床脑脊液标本的PCR扩增结果分别为：新型隐球菌15%（3/20）、结核肝菌20%（5/20）、脑膜炎双球菌10%（2/20）。结论 多重PCR有效地为临床病原体的混合感染,以及原因不明的脑膜炎患的快速诊断,提供了快速、准确的诊断手段。有效地减少了脑膜炎的误诊和漏诊,更提高了检验效率。     

肺部隐球菌病误诊4例X线分析

目的探讨肺部隐球菌病的X线及CT诊断及鉴别诊断。方法回顾性分析4例经手术病理、CT穿刺活检证实为肺部隐球菌感染的临床资料。结果1例位于肺内胸膜下,表现为类圆形块影;3例表现为肺内斑片状、结节状及纤维化病灶。结论CT引导下穿刺活检是诊断肺隐球菌感染简便有效的方法。     

肺隐球菌病20例临床分析

目的探讨肺隐球菌病的早期诊断方法。方法回顾性分析20例肺隐球菌病患者的临床表现、影像学及各实验室检查结果。结果5例经开胸肺活检确诊,3例由经皮肺穿刺确诊,12例由经支气管镜肺活检（TBLB）确诊。结论肺隐球菌病临床表现、影像学及实验室检查均无特异性,确诊有赖于痰、气管镜下肺泡灌洗液、病灶毛刷直接涂片或培养、TBLB、经皮肺活检等综合检查。     

Alu-LTR PCR检测整合型HIV-1实验方法的优化

目的对Alu-LTRPCR检测整合型HIV-1的实验方法进行优化。方法收集20例HIV-1感染患者及10例健康对照者的抗凝血标本,纯化CD4+T细胞并提取DNA,根据整合型HIV-1DNA的特点设计引物,首轮PCR5′端引物来自于人类保守的Alu序列,3′端引物来自于HIV-1LTRU5区序列,扩增片段包含了整合位点上游的人类基因组DNA序列和整合的HIV-1LTR的序列。第二轮引物针对HIV-1LTRU3区的序列。在首轮PCR基础上,PCR产物稀释后进行第二轮PCR。结果经过优化的Alu-LTRPCR,20例HIV病人全部检测到整合的HIV-1。结论经优化后,Alu-LTRPCR检测整合型HIV-1的实验方法的灵敏度明显提高。     

人脂联素真核表达质粒构建及其在LX-2中的表达

目的构建人全长脂联素真核表达质粒,转染人肝星状细胞系(LX-2),观察其表达及分泌情况,为脂联素在肝纤维化作用的基础及临床研究提供实验数据。方法提取人脂肪组织mRNA,用RT-PCR扩增出添加酶切位点的人全长脂联素基因片段,双酶切扩增出的目的基因片段及空载体质粒P7,将酶切后的片段进行连接、转化构建质粒。用FuGENE HD将构建成功的质粒转染LX-2细胞,用免疫荧光观察其转染效率及细胞定位,Western blotting检测脂联素蛋白表达。结果酶切及测序证实成功构建人全长脂联素真核表达质粒,免疫荧光检测转染效率约为40%,Western blotting检测到30000处存在目的蛋白表达,与预期相对分子质量一致。结论成功构建的人全长脂联素真核表达质粒能有效转染LX-2细胞及表达脂联素蛋白。     

芪参活血颗粒联合氟康唑对深部白色念珠菌感染小鼠免疫功能的影响

目的研究芪参活血颗粒联合氟康唑对深部白色念珠菌感染小鼠免疫功能的影响。方法建立小鼠深部白色念珠菌感染的动物模型,用随机数字表法分为空白对照组、模型组、中西药结合组和西药组,观察各组不同时间点实验动物血白介素-2(IL-2)水平及单核细胞表面MHCⅡ类分子表达水平的变化。结果芪参活血颗粒能显著增强单核细胞表面MHCⅡ类分子表达,提高外周血IL-2水平。结论芪参活血颗粒联合氟康唑治疗深部白色念珠菌感染的作用优于单纯使用氟康唑,芪参活血颗粒通过调节免疫力增强机体抗感染能力是其可能的作用机制之一。     

用PCR法检测真菌性鼻窦炎分泌物中的真菌

目的比较真菌内转录片段(ITS)PCR检测方法与培养的敏感性,探讨真菌ITSPCR检测方法的敏感性与特异性及其在真菌性鼻窦炎诊断中的意义。方法取18例临床诊断为真菌性鼻窦炎患者的鼻窦内分泌物,分别做真菌ITSPCR及培养,比较2种方法阳性率的差异及检出真菌的相符率。同时以20例临床诊断为非真菌性慢性鼻窦炎的鼻窦内分泌物为对照。结果18例真菌性鼻窦炎的标本中,ITSPCR方法检测真菌阳性的例数为14例(78%);传统培养的阳性例数为8例(44%)。20例慢性鼻窦炎ITSPCR方法检测阳性例数为1例(5%)。结论ITSPCR方法对于真菌性鼻窦炎的真菌病原快速诊断很有价值,并能通过测序明确感染菌种,是一种高敏感和高特异性的方法。     

视交叉上核脑片与NIH/3T3成纤维细胞共培养模型的建立

目的建立视交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)脑片与NIH/3T3成纤维细胞共培养的分子时钟诱导模型。方法选用7日龄SD大鼠,分离SCN脑片或皮层脑片,分别与NIH/3T3细胞共培养,分为SCN共培养组和对照组皮质共培养组,6d后连续24h每间隔6h收集NIH/3T3细胞,抽提细胞总RNA,实时定量RT-PCR检测时钟基因Per1mRNA水平。结果SCN共培养组Per1的表达均表现明显的节律性(P=0.001),对照组大脑皮质共培养组Per1基因表达均无明显节律性变化。结论成功建立SCN脑片与NIH3T3细胞共培养模型并诱导细胞内分子时钟的节律性表达,为研究SCN调控外周组织细胞生物节律提供有力工具。     

pcDNA3.1(+)-CYP2J3真核表达载体的构建及在大鼠心肌细胞的表达

目的克隆大鼠CYP2J3基因,与pcDNA3.1(+)真核表达质粒载体连接,转染大鼠心肌细胞检测其表达。方法提取大鼠肝脏组织总RNA,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和重叠延伸聚合酶链式反应(OE-PCR)的方法扩增大鼠CYP2J3基因,与双酶切的pcDNA3.1(+)连接,构建pcDNA3.1(+)-CYP2J3真核表达载体。转染大鼠心肌细胞,用RT-PCR的方法鉴定其在大鼠心肌细胞的表达。结果得到CYP2J3基因全长序列和真核表达载体pcDNA3.1(+)-CYP2J3。RT-PCR结果显示,转染pcDNA3.1(+)-CYP2J3后的大鼠心肌细胞CYP2J3基因有稳定表达。结论克隆大鼠CYP2J3基因、pcDNA3.1(+)-CYP2J3真核表达载体构建及在大鼠心肌细胞的表达均获成功,为进一步研究CYP2J3基因在细胞中的功能奠定了基础。     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测人c-myc基因方法的建立

目的构建含有c-myc基因的重组质粒并以其为模板,建立以SYBR GreenⅠ染料为荧光指示剂的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术检测c-myc的标准曲线,为FQ-PCR准确检测c-myc奠定基础。方法用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法从人食管鳞癌组织的总mRNA中反转录扩增c-myc cDNA,将纯化的PCR产物与pGEM-T Easy载体进行连接,转化宿主菌DH-5α,然后挑选阳性克隆重组质粒,分别用PCR扩增、限制性核酸内切酶EcoRⅠ酶切进行鉴定并测序分析。用紫外分光光度计测质粒浓度,计算拷贝数制备FQ-PCR浓度梯度标准品。最后对质粒标准品进行FQ-PCR检测。结果PCR扩增、酶切鉴定及测序分析均证实c-myc重组到pGEM-T Easy载体上。建立了人c-myc标准曲线,其对数与相应的Ct值(循环阈值)具有良好的相关性,相关系数r2=-0.99～-1,斜率为-3.1～-3.6。结论所构建的人c-myc质粒标准品应用SYBR GreenⅠ荧光染料技术建立的标准曲线线性关系好,灵敏性和特异性高,准确可靠,此方法可作为FQ-PCR检测c-myc基因的标准方法。     

一个小型人酪氨酸羟化酶基因启动子的分离和活性分析

目的探讨酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)基因上游调控区的功能。方法PCR法扩增人TH基因上游片段,插入pGL3-Basic质粒,构建一个表达荧光素酶的报告基因。将报告基因瞬间转染MES23.5、293及Cos7细胞,用Dual Luciferase Assay法测定目的DNA片段的启动子活性。结果测序结果表明,分离的DNA片段长度为520bp,与人TH基因-493/+27区一致。与pGL3-Basic质粒相比较,构建的报告基因在3种细胞中显著表达(P<0.01)。结论TH基因-493/+27区具有明显的启动子活性,构建的报告基因有助于研究TH基因表达的调节。     

大鼠ACE2腺病毒载体的构建及其在INS-1细胞中的表达

目的构建携带大鼠血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)基因的重组腺病毒表达载体并确定其对INS-1细胞的感染效率。方法采用RT-PCR方法,从大鼠肾脏组织中扩增出ACE2基因的全长cDNA序列,将ACE2基因定向克隆到穿梭质粒载体pShuttle-GFP-CMV,经与腺病毒骨架质粒pAdxsi载体同源重组后得到携带大鼠ACE2基因的重组腺病毒(pAdxsi-GFP-CMV-ACE2),采用PCR的方法对重组腺病毒进行鉴定,转染HEK293细胞进行包装和扩增,氯化铯密度梯度离心法纯化,半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infective dose,TCID50)方法测定重组腺病毒的滴度。体外转染INS-1细胞,绿色荧光观察绿色荧光蛋白(GFP)和Western blotting检测ACE2蛋白的表达。结果克隆得到大鼠ACE2基因,经PCR鉴定和测序证实结果正确,成功构建得到高滴度的重组腺病毒,并能高效感染INS-1细胞。结论成功构建了表达ACE2的复制缺陷型重组腺病毒,为深入研究ACE2基因在胰岛细胞中的生物学功能提供了一定的工作基础。