细菌脂多糖作用下角膜上皮细胞Toll样受体2、4动态变化研究

目的:观察角膜上皮细胞在细菌脂多糖作用后不同时间Toll样受体(TLR)2、4表达的动态变化,初步明确TLR在角膜细菌感染和保持免疫稳态中的作用。方法:培养永生化人角膜上皮细胞系,分别用10ng/ml和1μg/ml的细菌脂多糖(LPS)刺激,作用2h、4h、8h后检测TLR2、4的表达,4h、8h、12h后检测细胞分泌IL-6能力。结果:不同浓度LPS刺激后,细胞TLR2、4的mRNA表达水平在不同时点均明显增高,但随着刺激时间延长,细胞表面蛋白表达和IL-6的分泌水平则呈现先升后降的趋势。结论:人角膜上皮细胞(HCE)能够表达功能性的TLR2、4,并且在接受刺激后,TLR蛋白表达和炎症因子分泌具有负反馈抑制。     

Triggering of toll-like receptors 2 and 4 by Aspergillus fumigatus conidia in immortalized human corneal epithelial cells to induce inflammatory cytokines

Background Cornea epithelial cells play eady and crucial roles in the initiation of ocular surface responses to pathogens. Participation of toll-like receptor （TLR） 2 and TLR4, which are major forms of fungi receptors, may be involved in Aspergillus fumigatus induced immune responses. The objective of the present study was to examine whether inactive Aspergillus fumigatus conidia induce NF-KB activation and production of proinflammaory cytokines, and whether the expression of TLR2 and TLR4 were amplified by conidia in cultured immortalized human corneal epithelial cells （THCEs）. This may contribute to our knowledge of the mechanism by which the host cornea can successfully defend against invasive fungi. Methods Aspergillus fumigatus conidia were used to challenge THCE cells. THCE cells were harvested after 0.5, 1, 2 or 4 hours incubation. Real-time quantitative PCR was performed to determine the expression of TLR2, TLR4, TNF-a and IL-8. Western blotting was performed to determine the expression of NF-KB. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was performed to determine the expression of TNF-a and IL-8. And the release of TNF-a and IL-8 in the cell supematant were also assessed by ELISA with or without pretreatment with TLR2 and TLR4 neutralizing antibodies. Results Aspergillus fumigatus conidia elicited the expression of TLR2, TLR4, TNF-a and IL-8 mRNA in THCEs. Exposure of THCE cells to Aspergillus fumigatus conidia resulted in NF-KB activation, which increased at 30 minutes （increased from 11.35±2.74 in the controls to 19.12±3.48, p〈0.05） and thereafter increased steadily up to 4 hours after challenge （P 〈0.01）. Concomitant with NF-KB activation, secretion of TNF-α and IL-8 in conidia-challenged cells was increased in a time-dependent manner. Incubation of THCE cells with TLR2 antibody or TLR4 antibody before conidia challenge resulted in inhibition of conidia-induced TNF-α and IL-8 secretion （P 〈0.05）, TLR2 antibody and TLR4 antibody together significantly increased inhibit     

肺炎嗜衣原体包涵体膜蛋白Cpn0147诱导单核细胞分泌TNF-α和IL-8

目的　探讨肺炎嗜衣原体（Cpn）包涵体膜蛋白Cpn0147诱导人单核细胞分泌炎症因子的分子机制。方法　用去除内毒素活性的不同浓度Cpn0147重组蛋白（1.0、10.0、30.0和50.0　μg/mL）刺激THP-1细胞0～48　h,ELISA检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-8（IL-8）的分泌水平;实时定量PCR检测TNF-α和IL-8　mRNA的表达;用Toll样受体2（TLR2）和TLR4中和抗体处理THP-1细胞,或采用TLR2和TLR4　siRNA沉默其表达,ELISA检测THP-1处理前后TNF-α和IL-8分泌的变化。结果　Cpn0147可诱导THP-1细胞表达TNF-α和IL-8的mRNA和蛋白;同时,不同时间点Cpn0147对TNF-α和IL-8的诱导水平有所不同,Cpn0147作用2～6　h后即可诱导TNF-α和IL-8分泌,12　h时达到峰值,随后逐渐下降。采用TLR2和TLR4中和抗体封闭THP-1细胞后,TNF-α和IL-8分泌水平明显减少,采用TLR2和TLR4　siRNA干扰其表达后,TNF-α和IL-8的分泌也得到了类似的结果。结论　Cpn0147　可能通过TLR2和TLR4介导TNF-α和IL-8分泌。     

重组人角膜上皮素对人角膜上皮细胞黏附的影响

目的 研究比较改良前后重组人角膜上皮素对人角膜上皮细胞黏附的影响.方法 培养人角膜上皮细胞,将野生型角膜上皮素蛋白和诱变型重组角膜上皮素蛋白浓度调整为10,20,30,100μg/mL,分别预孵化96孔酶标板,每种浓度6个孔.包被18 h,孵育2 h.加入人角膜上皮细胞的细胞悬液调整浓度为每孔3×105,每组都设2%BSA预孵化的细胞板对照组.全自动定量绘图酶标仪检测吸光度.结果 诱变型重组人角膜上皮素比野生型角膜上皮素拥有更高的促角膜上皮细胞黏附作用,以剂量依赖式方式促进人角膜上皮细胞的黏附.在诱变型重组人角膜上皮素浓度达到10μg/mL时,开始促进人角膜上皮细胞黏附,随着浓度的增高,作用增强;浓度达到30μg/mL时,促进作用达到高峰.结论 诱变型人角膜上皮素比野生型角膜上皮素拥有更高的促角膜上皮细胞黏附作用,为进一步临床应用提供了理论基础.     

非小细胞肺癌患者DC-CIK过继免疫治疗前后外周血TLR4表达的变化

目的观察细胞因子诱导的杀伤细胞（DC-CIK）过继免疫治疗前后非小细胞肺癌（NSCLC）患者外周血单个核细胞（PBMC）Toll样受体4（TLR4）mRNA表达变化,及脂多糖刺激下PBMC分泌细胞因子的变化,探讨TLR4在DC-CIK过继免疫治疗中的作用。方法对50例采用DC-CIK治疗的NSCLC患者,运用RT-PCR检测治疗前后PBMCTLR4mRNA表达变化,ELISA法检测治疗前后NSCLC患者PBMC在脂多糖刺激下细胞因子（IL-6、IL-8及TNF-α）分泌的变化。结果DC-CIK治疗后NSCLC患者PBMCTLR4mRNA的表达水平较治疗前显著降低（t=6.272,P＜0.01）;脂多糖刺激下PBMC分泌IL-6（t=17.407,P＜0.01）、IL-8（t=15.244,P＜0.01）及TNF-α（t=12.428,P＜0.01）显著减少。结论DC-CIK过继免疫治疗可能通过降低PBMCTLR4mRNA的表达,提高机体抗肿瘤免疫功能。     

多种中药单体对人结肠癌HT-29细胞株TLR4 mRNA表达和IL-8分泌的影响

【目的】观察不同中药单体对人结肠癌细胞株HT-29细胞Toll样受体信使核糖核酸(TLR4 mRNA)表达及白细胞介素8(IL-8)分泌的影响。【方法】选用人结肠癌细胞株HT-29细胞,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HT-29细胞的TLR4 mRNA的表达;酶联免疫吸附法(ELISA)检测HT-29细胞的IL-8分泌。【结果】黄芪甲苷组和大黄素组可抑制干扰素-γ(IFN-γ)诱导的TLR4 mRNA表达,而姜黄素组、柚皮苷组和栀子苷组则对TLR4 mRNA表达无显著性影响;大黄素能显著性降低IFN-γ 脂多糖(LPS)所诱导的HT-29细胞IL-8的产生。【结论】大黄素抗炎细胞分子机制可能与其能抑制IFN-γ诱导的HT-29细胞TLR4 mRNA表达和IFN-γ LPS诱导的IL-8分泌有关。     

LncRNA MEG3表达量与脂多糖诱导支气管上皮细胞增殖及凋亡和炎症因子分泌的关系

【摘要】 目的 探讨长链非编码RNA母系表达基因3（LncRNA MEG3）对脂多糖（LPS）诱导的支气管上皮细胞增殖、凋亡及炎症因子分泌的影响。 方法 体外培养支气管上皮细胞16HBE,LPS处理16HBE细胞建立炎症损伤模型。采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测白细胞介素-8（IL-8）与白细胞介素-1β（IL-1β）的含量;甲基噻唑基四唑（MTT）检测细胞增殖率;流式细胞术检测细胞凋亡率;实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测LPS诱导的16HBE细胞中MEG3的表达水平。取对数生长期支气管上皮细胞,用50 μg/mL的LPS处理细胞24 h作为LPS组,正常培养的细胞作为NC组,将Si-MEG3、Si-con、pcDNA-MEG3、pcDNA转染主支气管上皮细胞48 h,随后使用50 μg/mL的LPS处理细胞24 h,分别命名为LPS+si-MEG3组、LPS+si-con组、LPS+pcDNA-MEG3组、LPS+pcDNA组。通过MTT与流式细胞术检测细胞增殖能力及凋亡能力的改变;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved caspase-3）、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9（Cleaved caspase-9）、细胞周期蛋白1（CyclinD1）的蛋白表达量。 结果 与NC组相比,LPS组IL-8、IL-1β水平、细胞凋亡率及Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白的表达水平均显著升高（P＜0.05）,细胞增殖率及CyclinD1蛋白、MEG3的表达水平均显著降低（P＜0.05）;干扰MEG3表达可促进LPS诱导的支气管上皮细胞凋亡及抑制细胞增殖,与LPS+si-con组相比,LPS+si-MEG3组支气管上皮细胞中MEG3的表达水平、细胞增殖率、CyclinD1蛋白相对表达量显著降低（P＜0.05）,IL-8、IL-1β水平、细胞凋亡率、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白相对表达量显著升高（P＜0.05）;与LPS+pcDNA组相比,LPS+pcDNA-MEG3组支气管上皮细胞中IL-8、IL-1β水平、细胞凋亡率及Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9蛋白的相对表达水平均显著降低（P＜0.05）,MEG3的表达水平、细胞增殖率及CyclinD1的表达水平均显著升高（均P＜0.05）。 结论 LncRNA MEG3过表达能够促进LPS诱导的支气管上皮细胞增殖,抑制细胞凋亡,减少炎症因子分泌。     

大黄素对角膜基质细胞分泌细胞因子的干预作用

目的观察大黄素对体外培养的人眼角膜基质细胞分泌白细胞介素6（IL 6）的干预作用。方法四甲基偶氮唑蓝（MTT)法检测不同浓度大黄素对人眼角膜基质细胞活性的影响。绿脓杆菌脂多糖(LPS）刺激角膜基质细胞（LPS组),并用大黄素进行干预（大黄素预处理组）。分别于LPS刺激前（0?h）,刺激后1、2、4、8?h收集各组细胞及细胞上清液。Western blot检测不同时点角膜基质细胞κB抑制因子 α(IκB α)蛋白的表达及大黄素的作用,酶联免疫吸附实验（ELISA）检测不同时点角膜基质细胞IL 6蛋白的分泌及大黄素的作用。结果不同浓度大黄素对角膜基质细胞的活性没有影响。与0?h相比,LPS刺激角膜基质细胞1?h时,胞浆IκB α蛋白表达出现下降,其电泳条带随着刺激时间的延长而逐渐变暗,4?h时最暗。LPS刺激后各时点IκB α蛋白表达较LPS刺激前均明显下降（P＜0.01）。LPS刺激可引起人眼角膜基质细胞IL 6蛋白分泌增多,刺激后8h达峰值,LPS刺激细胞后各时点细胞分泌IL 6均较刺激前明显增加（P＜0.01）。大黄素预处理后,与LPS组相比较,角膜基质细胞表达IκB α蛋白下降、细胞分泌IL 6减少（P＜0.01）。结论绿脓杆菌LPS可引起人眼角膜基质细胞IκB α降解,引起细胞因子表达,在角膜炎的过程中可能起一定的作用。大黄素能有效抑制LPS诱导的人角膜基质细胞IκB α降解,从而减少相应细胞因子的分泌。     

大黄素对脂多糖诱导的角膜基质细胞表达细胞因子的影响

目的 观察大黄素对脂多糖(LPS)诱导的角膜基质细胞表达细胞因子的影响.方法 原代培养角膜基质细胞,选取第4代细胞进行实验.根据在LPS刺激角膜基质细胞前是否先用40μmol/L大黄素培养细胞30min,将细胞分为大黄素+LPS组和LPS组,分别在10μg/L LPS刺激角膜基质细胞前以及刺激后1、2、4、8 h收集细胞;或先用0、5、10、20和40 μmol/L的大黄素培养细胞30 min后,再用10μg/L LPS刺激8 h.Western blot检测角膜基质细胞κB抑制因子-α(IκB-α)蛋白的表达;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测角膜基质细胞白细胞介素(IL)-6和IL-8的mR-NA表达.结果 LPS刺激角膜基质细胞后1、2、4、8h,细胞表达IκB-α蛋白均较刺激前明显下降(P<0.01);大黄素对LPS引起的角膜基质细胞IκB-α蛋白的降解有不同程度的抑制作用,且该作用呈一定的浓度依赖性(P<0.05).LPS刺激引起角膜基质细胞IL-6和IL-8 mRNA表达升高,刺激后各时间点IL-6和IL-8 mRNA表达均较LPS刺激前明显升高,呈一定时间依赖性(P<0.01);大黄素对LPS诱导的角膜基质细胞IL-6和IL-8 mRNA表达有明显抑制作用,且该作用呈一定浓度依赖性(P<0.05).结论 大黄素能抑制体外培养的角膜基质细胞表达IL-6和IL-8,可能与其抑制IκB-α降解、促进NF-kB活化有关.     

Toll样受体在不同转移能力人乳腺癌细胞株中的差异表达及意义研究

目的探讨Toll样受体在不同转移能力人乳腺癌细胞株中的差异表达及意义。方法分别选取高转移能力人乳腺癌细胞株MDA-MB231与低转移能力人乳腺癌细胞株MCF-7,采用RT-PCR、实时荧光定量PCR及细胞免疫荧光检测测定其蛋白水平及TLR1-TLR10mRNA水平,比较两株细胞TLRs表达情况及差异性。结果人乳腺癌细胞株MCF-7mRNA、MDA-MB-231 mRNA、蛋白水平均存在TLRs广泛表达;两种细胞株TLR4、TLR6、TLR8及TLR9 m RNA水平表达存在明显的差异性(P0.05);MDA-MB-231的TLR4、TLR6、TLR7及TLR5水平明显高于MCF-7(P0.05)。结论 TLRs在不同转移能力人乳腺癌细胞株中表达广泛但水平存在差异,其中TLR4受体差异表现最为明显,考虑TLRs表达差异与乳腺癌细胞转移能力相关。     

炎症信号受体Toll基因在人肺腺上皮细胞和血管内皮细胞的表达

目的 研究炎症信号受体Toll mRNA在人单核吞噬细胞系（THP-1）、脐静脉血管内皮细胞（UVECs)和肺腺上皮细胞系（SPC-A-1）的表达情况。方法 分别设计人TLR2和TLR4两对特异引物,从THP-1、UVECs和SPC-A-1提取总RNA,采用一步法RT-PCR和地高辛标记的Northern杂交技术检测TLR2和TLR4在3种细胞的表达。结果 RT-PCR和Northern杂交显示,3种细胞均表达TLR4受体,但仅THP-1和人UVECs表达TLR2受体。结论 本实验结果表明除单核吞噬细胞外,大血管内皮细胞和肺腺上皮细胞亦表达Toll受体基因,提示在炎症反应中Toll信号受体可能介导这些细胞效应分子基因转录激活的信号传导。     

炎症信号受体Toll基因在人肺腺上皮细胞和血管内皮细胞的表达

目的　研究炎症信号受体 Toll m RNA在人单核吞噬细胞系 (THP- 1)、脐静脉血管内皮细胞(UVECs)和肺腺上皮细胞系 (SPC- A- 1)的表达情况。方法　分别设计人 TL R2 和 TL R4两对特异引物 ,从 THP- 1、UVECs和 SPC- A- 1提取总 RNA,采用一步法 RT- PCR和地高辛标记的 Northern杂交技术检测 TL R2 和 TL R4在 3种细胞的表达。结果　 RT- PCR和 Northern杂交显示 ,3种细胞均表达 TL R4受体 ,但仅 THP- 1和人 U VECs表达 TL R2 受体。结论　本实验结果表明除单核吞噬细胞外 ,大血管内皮细胞和肺腺上皮细胞亦表达 Toll受体基因 ,提示在炎症反应中 Toll信号受体可能介导这些细胞效应分子基因转录激活的信号传导。     

Role of Toll-like receptor 4 and human defensin 5 in primary endocervical epithelial cells

Background Endocervical epithelial cells play early roles in the defense of upper female genital tract to pathogens. Toll-like receptors （TLRs） and human defensins （HD） have recently been identified as fundamental components of the innate immune responses to bacterial pathogens. We aimed to use in vitro model of human primary endocervical epithelial cells （HPECs） to investigate their roles in innate immune response of the endocervix. Methods TLR4 expression and distribution in HPECs and endocervix were investigated by immunofluorescence （IF）. Cultured HPECs were divided into lipopolysaccharide （LPS） group which were treated by LPS for 0, 24 and 48 hours, and control group without treatment. At each time point, the levels of HD5, IL-6 and TNF-a in supernants were determined by ELISA. TLR4 and HD5 expressions of cells were detected by Western blotting simultaneously. HD5 expression pattern was also compared between the HeLa cell line and HPECs. Results Endocervix tissue surface and HPECs expressed TLR4. After incubated with LPS, HPECs expressed significantly higher levels of TLR4 than control group, especially after 24 hours （P 〈0.01）, however decreased after 48 hours with a similar level of TLR4 expression compared with control group. LPS could upregulate the secretion of HD5, IL-6 and TNF-a in a time-dependent manner （24 hours： P 〈0.05; 48 hours： P 〈0.01, compared with control group）. Intracellular HD5 expression levels decreased over time. HD5 expression patterns in HPECs were different from HeLa cell line. Conclusions To respond to LPS stimulation, HPECs may function in the mucosal immune defense through TLR4 activation and HD5 secretion. HPEC is considered a significant model for immunological study.     

Toll样受体4在人肺泡上皮细胞株中的表达及其在细胞炎症反应中的作用

目的 明确人Ⅱ型肺泡上皮细胞是否表达Toll样受体4(TLR4),探讨TLR4在慢性阻塞性肺疾病(COPD)气道炎症中的作用.方法 将人Ⅱ型肺泡上皮细胞系A549细胞分为正常对照组、转染腺病毒E1A质粒(E1A+组)和转染不含有腺病毒E1A的空白质粒组(E1A-组),分别以不同浓度的脂多糖(LPS,0、0.1、1、10μg/ml)、白细胞介素1β(IL-1β,0、0.1 ng/ml)、香烟提取物(CSE,0、10%、20%、40%)刺激.刺激后12、24 h,用反转录聚合酶链反应技术检测各组细胞IL-8 mRNA和TLR4 mRNA的表达,用蛋白质印迹技术测定核因子κB(NF-κB)亚单位P65蛋白的表达.结果 10μg/ml LPS、0.1 ng/ml IL-1β或20%CSE刺激24 h后,E1A+组IL-8 mRNA表达量(2.82、1.87、4.70)明显高于正常对照组(0.95、0.78、1.02,均P<0.05)和E1A-组(0.97、0.81、1.12,均P<0.05).10μg/ml的LPS刺激后12、24 h,E1A+组细胞TLR4 mRNA表达水平分别为4.52、7.99,明显高于正常对照组(1.91、3.81,均P<0.05)和E1A-组(2.00、3.88,均P<0.05);IL-1β也可增加TLR4 mRNA表达.CSE刺激对各组细胞TLR4 mRNA表达水平均无明显影响.3种刺激因子均可引起各组细胞NF-κB亚单位P65蛋白表达水平增高.结论 人Ⅱ型肺泡上皮细胞表达TLR4,LPS、IL-1β引起IL-8释放可能与TLR4介导的NF-κB激活有关.     

脂多糖对正常人肝内胆管上皮细胞TLR4-NF-кB通路的影响

目的：探讨脂多糖( LPS)对正常人肝内胆管上皮细胞( HiBECs)中TLR4-NF-кB通路的影响。方法 HiBECs常规细胞培养后,加入不同浓度的LPS(0．1、1、4、8、10μg/mL),刺激不同时间(3、6、9、12、24 h),用Realtime RT-PCR分析细胞内TLR4和NF-κB mRNA表达水平。结果 LPS刺激HiBECs后TLR4和NF-κB mRNA表达水平均增加,HiBECs在受到LPS(4μg/mL)刺激后TLR4和NF-κB mRNA表达水平随时间延长而增加,于6小时达高峰,之后下降。以相同时间(6 h)刺激HiBECs后,TLR4和NF-κB mRNA表达水平随LPS浓度增高而增加,LPS浓度为4μg/mL时达高峰,之后下降。结论 LPS可以激活HiBECs中的TLR4-NF-кB通路,并且有时效和量效依赖关系。     

细菌脂多糖、脂蛋白和DNA对小鼠肺泡巨噬细胞体外激活的协同作用

目的 通过体外实验,从受体水平观察细菌脂多糖(LPS)、细菌脂蛋白(BLP)和细菌DNA对肺泡巨噬细胞的协同刺激效应及其可能机制。方法 分离培养小鼠肺泡巨噬细胞,随机将细胞分为7组,分别为LPS组、CpG-ODN组、BLP组、LPS CpG-ODN组、LPS BLP组、LPS CpG-ODN BLP组和培养基对照组。刺激6h后,收集上清和细胞,上清用于TNF-α检测,细胞用于提取总RNA,通过RT-PCR检测主要模式识别受体(PRRs)CD14、SR、TTLR2、TLR4,TLR9的表达。结果 LPS、BLP和CpG-ODN不仅体外能协同增加肺泡巨噬细胞释放TNF-α等细胞因子,而且具有协同增强效应细胞表面模式识别受体的表达,以三者同时存在时,协同作用最强。结论 细菌内毒素、细菌脂蛋白和细菌DNA在体外不仅能上调相互的模式识别受体,而且具有协同增强其他细菌结构成分对相应受体的刺激作用。