乳腺癌组织中DNA依赖蛋白激酶的表达变化

目的探讨乳腺癌组织中DNA依赖蛋白激酶（DNA—PK）的表达变化及其意义。方法采用免疫组化sP法检测56例乳腺癌组织及50例乳腺良性病变组织中DNA—PK的3个亚基DNA—PKcs、Ku70、Ku86的表达情况，同时检测这些组织中雌激素受体（ER）及癌基因c—erbB-2的表达。结果Ku70、Ku86在乳腺癌组织中的表达明显低于乳腺良性病变组织（P〈0，01），而且Ku70和Ku86的表达随乳腺癌病理分级的升高而降低，但DNA-PKcs在两者中的表达则无明显变化。Ku70与Ku86的表达在ER阳性组高于ER阴性组，在c—erbB-2阳性组的表达则低于c-erbB-2阴性组，差异均有极显著性意义（均P〈0．01）。结论Ku70和Ku86的低表达在乳腺癌的发生和发展中有重要意义，且其与ER、c—erbB-2关系密切，对乳腺癌的临床治疗及预后判断有一定的指导意义。     

下调Ku70促进DDB1/2在双链断裂DNA聚集

目的 探讨DNA损伤结合蛋白DDB 1/2复合物在Ku70缺失的条件下与双链断裂DNA(double-strand breaks,DSB)亲和力的变化及下调DDB1对DSB修复的影响.方法 针对人类Ku70构建编码shRNA序列的重组腺病毒并感染细胞,建立Ku70蛋白表达沉默的细胞株,以博来霉素(bleomycin,Bleo)或新制癌菌素(neocarzinostatin,Ncs)诱导DNA双链断裂,利用DNA损伤修复蛋白与损伤染色质的高亲和力,分段提取细胞蛋白组分,Western blot检测DDB1/2在各组分的分布变化.免疫荧光检测诱导DNA双链断裂前后DDB1与损伤染色质亲和力的变化.沉默DDB1,Western blot检测在不同条件下γ-H2AX的去磷酸化效率.结果 人乳腺癌MDA-MB-231细胞Ku70蛋白水平在Ku70shRNA重组腺病毒感染后4d显著下调,6d达到最低.与Ku70正常细胞相比,在Ku70沉默后诱导DSB,Western blot检测结果显示DDB1/2主要分布在与染色质紧密结合的组分,免疫荧光同样表现出其与染色质亲和力增高.并且在Ku缺失的条件下,Western blot显示下调DDB1能显著降低γ-H2AX去磷酸化效率(P＜0.01).结论 下调Ku70可促进DDB1/2在双链断裂DNA聚集,且下调DDB1影响DSB修复,说明DDB1/2可能参与了不依赖于Ku的双链断裂的修复途径.     

沉默Ku70后PARP1参与DNA双链断裂修复

目的研究碱基切除修复途径(base excision repair,BER)关键因子PARP1在Ku70缺失的条件下是否参加DNA双链断裂(double-strand break,DSB)的修复。方法针对人类Ku70构建编码shRNA序列的重组表达载体并转染细胞,建立Ku70蛋白表达沉默的细胞株。以高效的DNA双链断裂诱导剂刺孢霉素calicheamycin诱导DSB形成,在Ku70沉默或联合PARP1抑制剂条件下,通过结晶紫染色法检测DSB对细胞存活率的影响,以及Western blot检测H2AX的磷酸化状态。根据与染色质相互作用的差别,分段提取细胞蛋白组分,Western blot检测PARP1在各组分的分布变化。结果细胞Ku70蛋白水平在Ku70 shRNA干扰后显著下调。Ku70沉默和PARP1抑制剂明显降低细胞在calicheamycin处理后的存活率(P<0.01),两者有明显协同效应。在Ku70沉默的细胞诱导DSB后,PARP1主要分布在与染色质紧密结合的组分。结论在Ku70缺陷时,PARP1可与染色质结合,且抑制其功能影响细胞生存,说明PARP1可能参与了不依赖于Ku的DNA双链断裂修复的替代途径。     

CRL4泛素化酶在卵巢癌中的功能和突变研究

目的 研究泛素化酶CRL4蛋白复合体家族成员CRL4WD40重复序列结构域蛋白70（WDR70）在卵巢癌细胞中的DNA修复功能,以及卵巢癌组织中该泛素化酶基因的突变规律。方法 利用免疫荧光方法,检测CRL4骨架蛋白DDB1及WDR70基因特异性沉默的卵巢癌细胞与其对应的对照组细胞在化疗药物或放射线照射诱导产生DNA双链断裂后,组蛋白H2AX（γH2AX）及单链DNA结合蛋白32（RPA32）磷酸化灶点显示的差异;BrdU标记和染色实验检测WDR70基因对DNA复制是否存在影响,同时利用免疫组化染色检测卵巢癌组织临床病理标本及正常卵巢组织标本中的WDR70和组蛋白H2B单泛素化（uH2B）染色差异,以阐明CRL4的DNA损伤应答特征,RTPCR测定卵巢癌组织中WDR70的基因表达水平,并采用DNA测序确定WDR70突变位点。结果 免疫荧光染色结果显示,CRL4WDR70的不同蛋白亚基（DDB1、WDR70）在细胞周期检验点激活和uH2B介导的DNA末端回切过程中起着不同的作用:DDB1参与以上两个机制的调控,而WDR70只促进末端回切、RPA32在DNA断裂点的招募和同源重组修复。BrdU标记和染色结果显示WDR70基因对DNA复制并不存在影响。免疫组化结果显示,卵巢癌组织临床病理标本及正常卵巢组织标本中的WDR70和uH2B表达存在差异。RTPCR结果显示WDR70基因的全长、5′和3′转录本水平在50%的卵巢癌组织中水平减低,出现多处外显子突变位点。结论 CRL4在DNA修复过程中具有促进H2B单泛素化、促进DNA末端回切和激活细胞周期检验点等多种重要功能,是维持基因组稳定性、遏阻卵巢癌发生的重要抗癌机制。     

DNA—PK亚单位Ku70、Ku80在不同分期乳腺癌中的表达情况

目的探讨不同期别乳腺癌组织中DNA依赖蛋白激酶（DNA dependent protein kinase,DNA-PK）的两个调节亚单位Ku70、Ku80的表达变化情况．方法采用免疫组化SP法检测Ⅰ～Ⅳ期乳腺癌组织各30例中的Ku70、Ku80的表达情况．结果Ku70、Ku80在Ⅰ期乳腺癌组织中呈高表达,在Ⅱ期中的表达有降低趋势（与Ⅰ期比较P〈0．01,与Ⅲ期比较P〉0．05,与Ⅳ期比较P〈0．01）,在Ⅲ、Ⅳ期乳腺癌组织中的表达明显低于Ⅰ期乳腺癌（P〈0．01;P〈0．01）．结论Ku70、Ku80在不同阶段乳腺癌中的表达情况是随着乳腺癌的分期变化而变化,从早期、中期到晚期呈逐渐降低趋势,可能与乳腺癌的分期及预后有一定相关性．     

DNA-PKcs抑制剂在肿瘤治疗中的研究现状

细胞修复DNA损伤的能力与肿瘤的发生发展及治疗效果密切相关。肿瘤治疗中广泛使用的DNA损伤药物和放射治疗都会造成DNA双链断裂这种致命性的损伤,肿瘤细胞主要通过 DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK）参与的一种非同源末端连接（NHEJ）方式来进行修复。DNA-PK全酶由催化亚单位DNA-PKcs和Ku70/Ku80异二聚体两部分组成,对它们活性的抑制能显著降低肿瘤细胞修复DNA双链断裂的能力,进而增强放化疗的敏感性。目前研究主要关注DNA-PKcs抑制剂,其中一些已进入临床研究阶段。本文对多种DNA-PKcs抑制剂在肿瘤治疗中的相关研究进行概括。     

HSnm1B-一种新的端粒结合蛋白

hSnm1B是β—CASP家族中的一员，其基因序列与酵母SNM1有同源性。DNA是其主要作用底物，在DNA损伤修复过程中发挥一定的作用。目前对它的结构和功能及其机制还不十分了解，hSnm1B是β—CASP家族中了解最少的一种蛋白质。2006年6月2日，Brian等公开发表了他们的新发现-HSnm1B，一种新的端粒结合蛋白（Biol Chem，2006，281：15033—15036），认为它可能在端粒的结构和功能方面发挥重要作用。Brian等对Hhnm1A和hSnm1B这两种公认的与DNA结合的蛋白质展开研究，观察它们与端粒之间是否存在相互作用。     

乙肝病毒感染产妇乳汁及唾液HBV-DN1检测分析

目的探讨乙肝病毒感染或携带产妇乳汁、唾液的传染性,为母婴密切接触提供科学依据。方法选取50例乙肝大三阳患者,70例乙肝小三阳患者,对其血清、乳汁、唾液分别进行HBV—DNA检测,另选30例健康产妇作为对照,对其结果进行分析。结果乙肝大三阳患者与乙肝小三阳患者的血清、乳汁、唾液HBV—DNA的阳性率之间均有显著差异（χ2=59,64,69．31,70：13;P均〈O．01）;乙肝大三阳患者血清与乳汁、唾液的HBV—DNA阳性率均无统计学差异（χ2=3．40,1．60;P均〉0．05）;乙肝小三阳患者血清与乳汁、唾液的HBV—DNA．阳性率均有统计学差异（χ2=6．80,4．46;P〈0．05）;乙肝大三阳患者与乙肝小三阳患者两组产妇乳汁和唾液HBV-DNA：阳性率之间无显著差异（χ2=0．38,0．28;P均〉0．05）;产妇乳汁、唾液中HBV—DNA阳性率与血清中HBV—DNA载量呈显著正相关（r=0．961,0．938;P〈0．01）。结论乙肝产妇的乳汁、唾液是否具有传染性与血清中病毒载量有关;乳汁、唾液的HBV—DNA检测从一定程度上可代替血清检测,优点为取材方便,产妇无痛苦易接受,更有安全感。     

DNA修复蛋白Ku70酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活检测

目的构建Ku70蛋白酵母双杂交诱饵载体,为研究Ku70及其相互作用蛋白在乳腺癌中的作用机制奠定基础。方法采用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）法从人宫颈癌HeLa细胞株扩增出Ku70cDNA全长片段,用SalI和EcoRI双酶切Ku70cDNA片段后定向克隆到真核细胞表达载体pGBKT7,获得诱饵质粒pGBKT7-Ku70,经限制性内切酶酶切和测序鉴定后转化到酵母菌株AHl09,在营养缺陷培养基中观察pGBKT7-KuT0的自激活作用,同时利用蛋白质免疫印迹检测诱饵蛋白Ku70的表达。结果Ku70cDNA正确克隆到载体pGBKT,转化到酵母菌株AHl09中的诱饵载体pGBKT7-KuT0经表型筛选证实无自激活作用,蛋白质免疫印迹检测显示pGBKT7-KuT0在酵母细胞中稳定表达诱饵蛋白Ku70。结论成功构建了Ku70蛋白酵母双杂交诱饵载体,并且在酵母菌株AHl09中稳定表达。     

DNA依赖的蛋白激酶研究新进展

DNA依赖的蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase,DNA-PK)有3个亚基组成:Ku80、ku70与DNA依赖的蛋白激酶催化亚单位(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs).Ku70和Ku80又组成Ku异二聚体.这3个亚基在人类细胞中分别由XRCC6基因、XRCC5基因和XR-CC7基因编码.研究发现DNA-PK的功能广泛.现在,XR-CC5/Ku80和XRCC6/Ku70基因对XRCC7/DNA-PKcs的调节研究颇受关注,是因为DNA-PK是磷酸化的蛋白酶,底物包括肿瘤抑制蛋白的p53转录因子(原癌基因)、c-Jun、C-Fos等等,特别在调节DNA转录、复制、修复中起重要作用.不难看出,上述研究与肿瘤的发病机理,基因诊断,治疗密切相关.     

TCT联合高危HPV—DNA定量检测在宫颈疾病筛查中的价值

目的通过液基细胞学（TCT）联合高危型（8个型）人乳头瘤病毒DNA（HR—HPV—DNA）定量检测,探讨其在宫颈疾病筛查中的价值。方法对怀疑有宫颈病变的患者进行（TCT）和HR—HPV—DNA（16,18,31,33,45,52,56,58型）实时荧光定量检测,并将两者结果和病理活检进行对照分析。结果TCT检测与HR—HPV—DNA检测特异性比较有显著差别（P〈0．01）,HR—HPV—DNA检测诊断敏感度高（92％）,但特异性低（75％）;TCT检查特异性高（97％）,敏感性低（83％）;TCT与联合筛查检出率高达100％,两组比较有明显差别（P〈0．01）。结论TCT联合HR—HPV—DNA进行宫颈疾病的筛查,能明显提高检出率和筛查效率,在宫颈癌高危人群中进行大规模的初筛更具价值,适合在条件允许的地方进行开展。     

端粒及端粒长度研究新进展

端粒位于真核细胞染色体末端，它由DNA重复序列和特定的端粒结合蛋白相结合而形成的核染色质组成。端粒DNA是由一小段富含G的简单重复序列，人的端粒DNA序列是由一段高度保守的重复序列d（TTAGGG）n构成的特化区。端粒结合蛋白，主要成分是“端粒重复结合因子”（TRF）。端粒排列成高级的“T-环”结构，像“帽子”一样扣在染色体两端，防止染色体融合、重组、降解，维持其完整性和稳定性。端粒的这种保护功能在基因完整性和细胞生理学其他方面的调节起至关重要的作用。     

Ku70蛋白结构、功能及在人体组织中的异常表达

<正>Ku70蛋白是一种非常丰富的核蛋白,广泛存在于人类、哺乳类动物、线虫、昆虫、酵母、原核生物以及植物体内。现代研究发现,Ku70在DNA双链破裂修复、DNA复制、基因转录调控、端粒结构的维持等多种细胞活动中,均扮演着重要角色。已知的研究发现Ku70蛋白在乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、鼻咽癌、肝癌等多种恶性肿瘤组织中呈阳性表达,而且Ku70蛋白随着肿瘤恶性度的升高表达得越强烈。因此不难发现     

DNA损伤修复因子WDR70的生物学功能及其在人卵巢癌中的突变研究

目的 在细胞水平上分析新发现的DNA损伤修复因子WDR70的生物学功能,确定WDR70基因在人卵巢癌中的突变发生情况,以验证该基因的功能丢失是否与卵巢癌关联。方法 在人细胞中用siRNA干扰WDR70基因表达,或用慢病毒和质粒过表达WDR70的野生型和突变体,通过免疫印迹和免疫荧光等方法研究该基因在DNA损伤后的亚细胞定位和DNA损伤信号通路中的作用;此外,抽提1例正常卵巢组织和16例卵巢癌标本的mRNA进行半定量RT-PCR扩增,对这些标本中的WDR70基因进行测序分析。结果 WDR70基因沉默和过表达其突变体导致同源重组功能蛋白——DNA复制蛋白A （RPA32）磷酸化修饰水平降低和重组酶——重组蛋白A（RAD51）向DNA损伤位点招募的能力减低;WDR70的功能障碍还导致染色体的断裂增多;同时,卵巢癌样本中发现多例WDR70突变型别。结论 在体外系统中,WDR70参与DNA损伤修复过程,沉默或过表达其突变体将导致同源重组修复缺陷和染色体结构的不稳定;在卵巢癌基因组中,WDR70基因频繁出现突变,可能导致相应的DNA修复缺陷和基因组不稳定性的发生。因此,WDR70是一个潜在的卵巢癌抗癌基因。     

靶向Ku70基因siRNA对人肺腺癌细胞顺铂耐药性的逆转作用

目的：研究Ku70与人肺腺癌耐药的相关性,观察调控Ku70表达能否逆转人肺腺癌耐药细胞系（A549/DDP）的耐药性。方法：采用RT-PCR、Western Blotting方法比较Ku70在人肺腺癌亲代细胞（A549）与耐药细胞系（A549/DDP）的表达水平。转染靶向Ku70基因siRNA（si-Ku70）的A549/DDP细胞作为实验组,转染非特异性siRNA（si-Scramble）的A549/DDP细胞作为阴性对照组,同时设空白组(A549/DDP细胞)。加药组在转染后48 h给予顺铂。应用MTT法检测各组细胞在顺铂作用下的生存率,并计算半数抑制浓度（IC₅₀）,采用流式细胞仪定量检测细胞凋亡率;采用分光光度法检测Caspase-3活化程度。结果：Ku70 mRNA和蛋白在A549/DDP细胞表达水平显著高于其亲代A549细胞（P<0.01）;靶向Ku70的siRNA（si-Ku70)明显下调A549/DDP细胞的Ku70 mRNA和蛋白表达水平（P<0.01）;在不同浓度顺铂作用24 h后,实验组细胞的生存率明显低于阴性对照组和空白组（P<0.01）。6 mg/L顺铂作用24 h后,实验组细胞凋亡率及Caspase-3活化程度高于阴性对照组和空白组（P<0.05）。结论：Ku70在人耐药肺腺癌细胞呈现高表达,提示Ku70参与肺腺癌耐药的形成;靶向Ku70siRNA导入人肺腺癌耐药细胞可特异性下调Ku70的表达,促进肺腺癌耐药细胞凋亡,逆转其耐药性,Ku70可能成为逆转肺癌耐药的一个新的分子靶点。     

乙肝病毒基因分型与HBV—DNA水平及HBeAg之间关系的探讨

目的：探讨HBV基因型与HBV—DNA水平及HBeAg之间关系。方法：对85例表面抗原阳性患者进行基因分型、HBV—DNA水平的检测及ELISA法检测HBeAg后进行分析。结果：基因分型为B型9例，C型70例，BC混合型1例，未分型5例。烟台地区HBV基因型以C型为主，占82．3％（70／85）。C型HBV—DNA水平及HBeAg阳性率分别为92．8％（65／70）、62．9％（44／70）.C型HBV—DNA水平显著高于B型，C型HBeAg阳性率明显高于B型。结论：烟台地区HBV基因型主要以C型为主，B型次之，在慢性乙型肝炎患者中性别不是基因型构成差别的因素。C基因型肝脏损害比B型重。     

Ku70和Ku80基因在系统性红斑狼疮患者皮肤上的表达

目的 :研究Ku70和Ku80基因在系统性红斑狼疮 (systemiclupuserythematosus,SLE)患者皮肤表达的变化及其与SLE发病的关系。方法 :利用Ku70、Ku80地高辛标记的cDNAs探针对皮损区、非皮损区及正常对照皮肤进行原位杂交。结果 :Ku70、Ku80mRNAs的表达量从高到低依次为SLE皮损区、SLE非皮损区、正常皮肤。另外还发现在皮肤的层次上真皮浅层单一核细胞Ku70、Ku80mRNAs表达量高于表皮基底层细胞、表皮棘细胞层和颗粒层细胞。结论 :Ku70、Ku80mRNAs的表达在SLE患者皮肤上发病区高于非发病区 ,更大于正常皮肤。Ku70、Ku80mRNAs表达的变化与SLE的发病有关 ,其机制有待进一步研究     

DNA pol β,Ku80与鼻咽癌放射敏感性的关系

目的:研究人鼻咽癌细胞系CNE-2Z亚克隆株F1、S1放射后DNA修复相关基因DNA pol β和Ku80的表达,探讨CNE-2Z存在放射敏感性异质性的可能机理。方法:裸鼠体内移植瘤实验观察F1、S1放射后的体内增殖能力,采用Western blot、免疫细胞化学和免疫组织化学方法检测放射后F1和S1 DNA修复相关蛋白(DNA pol β、Ku80)的表达,Feulgen染色法和图像分析方法检测放射后F1、S1裸鼠体内移植瘤的DNA倍体及细胞周期分布情况。结果:未照射前F1细胞DNA pol β和Ku80的表达高于S1;放射后S1细胞DNA pol β及Ku80表达上调的时间较F1早,上调辐度大于F1。鼻咽癌细胞系CNE-2Z确实存在放射敏感性的异质性,放射后S1体内增殖能力大于F1,较多细胞处于有利于DNA修复的G2/M期(P<0.01)。放射后F1、S1裸鼠移植瘤细胞和组织中,DNA pol β和Ku80蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:本实验进一步证实了鼻咽癌细胞系CNE-2Z确实存在放射敏感性的异质性,F1、S1放射敏感性的差异与两株细胞的DNA修复相关基因(DNA pol β、Ku80)的表达差异所致的DNA SSB、DSB修复的速度和忠实性有关。     

乙型肝炎大三阳患者体液中HBV—DNA含量的测定

目的 探讨乙型肝炎病毒（HBV）经体液传播的相关临床检验学依据。方法通过EHSA方法筛选出230例乙肝表面抗原（HBsAg）、乙肝e抗原（HBeAg）、核心抗体（HBcAb）同时阳性即大三阳患者,并采用荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）定量检测乙型肝炎患者的血液、唾液、乳汁以及尿液中HBV—DNA的含量结果230例大三阳患者中120例同时测其血清和尿液中HBV—DNA含量,阳性率都为100％;80例同时测其血清和唾液中HBV—DNA含量,阳性率都为100％;30例同时测其血清和母初乳中HBV—DNA含量,阳性率都为100％结论在实验中我们发现,患者唾液、尿液及母初乳中的HBV—DNA含量高低同血液中HBV—DNA的含量成一定的线性关系,为乙型肝炎是通过唾液、乳汁及尿液进行传播的理论提供了临床检验学依据。     

HPV16嵌合型疫苗的构建及其免疫效应初探

目的 构建以碳末端锌指结构突变的E7基因为基础，融合HSP70的嵌合型DNA疫苗，检测其诱导的特异性T淋巴细胞增殖活性，初步评价此疫苗对HPV相关肿瘤的治疗作用。方法 利用PCR法定点突变E7基因碳末端的锌指结构，以其为基础融合热休克蛋白70，克隆入pcDNA．3．1-质粒构建嵌合型DNA疫苗。DNA测序，确认E7基因突变位点及DNA疫苗阅读框架。用脂质体法将pcd—E7-HSP转染A549细胞，经G418筛选后，提取RNA，RT—PCR检测E7基因表达。DNA疫苗免疫C57BL6小鼠。取其脾细胞与E7蛋白在体外共同培育，MTT法检测T淋巴细胞增殖活性。结果 E7基因突变位点及阅读框架均正确，E7基因可检测到表达。疫苗免疫后C57BL/6小鼠脾细胞增殖活跃。结论：E7基因锌指结构的突变及融合HSP70能够诱导特异性的细胞免疫应答。