t-PA基因慢病毒表达载体的构建及其在内皮祖细胞中的表达研究

目的:构建t-PA基因慢病毒表达载体并转染脐血来源的内皮祖细胞,评估其转染后功能变化情况。方法:RT-PCR获得t-PA cDNA,将真核表达质粒pcDNA3.1(+)和t-PA基因片段分别双酶切,构建pc DNA3.1(+)/t-PA质粒。对其进行酶切鉴定和测序,使目的基因连接入载体质粒中,构建成重组慢病毒载体质粒,制备包装病毒质粒转染内皮祖细胞。倒置荧光显微镜下观察转染24h后内皮祖细胞中绿色荧光蛋白的表达情况,RT-qPCR和Western blot检测转染后t-PA基因的表达水平。采用Brdu标记细胞DNA、BCA蛋白定量、MTT分析法检测内皮祖细胞DNA合成能力、总蛋白含量和细胞存活率。结果:成功构建了含有t-PA基因cDNA序列的慢病毒表达载体p Lenti6.3-t-PA,DNA测序结果完全正确,倒置荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达,内皮祖细胞转染重组慢病毒后t-PA表达水平比未转染组显著增高(P0.01)。t-PA慢病毒表达载体转染内皮祖细胞后,内皮祖细胞DNA合成能力、细胞总蛋白含量、细胞存活率均较对照组无明显变化。结论:成功构建t-PA基因慢病毒表达系统,转染内皮祖细胞后对其DNA合成、总蛋白合成、细胞存活率无明显影响。     

稳定表达人有机阳离子转运体1的细胞模型构建

 目的 建立能稳定表达人有机阳离子转运体1（human organic cation transporter1, hOCT1）野生型及两个突变体的马丁达比狗肾上皮（Madin-Darby canine kidney, MDCK）细胞模型。方法 从人肝组织中提取hOCT1野生型基因,经定点突变获得hOCT1_P341L,hOCT1_M420del两个突变型基因,构建表达质粒pcDNA3.1(+)-hOCT1,pcDNA3.1(+)-hOCT1_P341L,pcDNA3.1(+)-hOCT1_M420del。将质粒转染MDCK细胞,通过G418筛选获得抗性克隆,并通过hOCT1的荧光底物(4-二甲氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶 (ASP+)筛选得到具有较高活性的MDCK-hOCT1细胞。经反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)及经典底物N-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)的摄取实验,鉴定筛选得到的单克隆细胞株hOCT1 mRNA的表达及功能。结果 本实验获得的hOCT1野生型及2个突变体细胞模型与转染空载体的MDCK细胞相比,其 hOCT1 mRNA表达量显著增高,对经典底物MPP+的摄取为转染空载体细胞的12.5,13.7,12.0倍,hOCT1抑制剂可显著抑制细胞对MPP+的摄取。结论 建立的细胞模型可用于hOCT1抑制剂及底物的筛选。     

构建与表达结核杆菌Hsp65和hGMCSF表达质粒

目的应用分子生物学技术，构建pIHsp65GM双顺反子表达质粒，并在真核细胞中表达。方法以结核分枝杆菌H37Rv株基因组为模板经PCR扩增出Hsp65基因，同时从质粒pORFhGMCSF中扩增出基因佐剂hGMCSF，分别克隆到真核表达载体pIRES的多克隆位点A（McsA）和B（MCSB）中，构建pIHsp65GM真核表达质粒，并转染HepG2细胞中表达和检测。结果酶切鉴定提示插入的基因片段大小分别为1．64kb和0．47kb，测序分析表明克隆的Hsp65和hGMCSF序列与GenBank上公布序列一致；免疫组织化学方法检测到表达Hsp65的阳性细胞；ELISA方法检测到pIHsp65GM转染组细胞培养上清中hGMCSF的表达，与空对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。结论成功构建和表达了pIHsp65GM质粒。     

uPA基因的克隆

目的：构建uPA真核细胞表达质粒。方法根据GenBank中uPA的序列,利用RT—PCR从人卵巢癌组织进行扩增uPA基因全长片段,将其克隆人真核表达质粒pcDNA3．1／myc—his（-）B,建立uPA的表达质粒pcDNA3．1-uPA,后并对克隆的全长片段进行DNA序列测定。结果经与GenBank分布的序列进行分析比较证实,构建的真核表达重组质粒pcDNA3．1-uPA含有uPA全长cDNA编码序列。结论uPA能被成功地从人卵巢癌组织中克隆,构建了真核细胞表达质粒pcDNA3．1-uPA,测序表明其携带有uPA的全长序列,为进-步研究uPA在卵巢癌侵袭转移中的作用打下基础。     

半边旗中二萜类化合物5F诱导人胰腺癌细胞凋亡机制的探讨

目的:观察研究半边旗中二萜类化合物5F(11a-羟基-15-氧-16-烯-贝壳杉烷-19酸)诱导人胰腺癌细胞株AsPC-1凋亡的效果及其机制。方法:用脂质体转染法将P53E向凋亡之因子基因(PUMA)反义核酸(反义PUMAcDNA)的真核表达载体pcDNA3.1-PUMAAS和空载体pcDNA3.1-导入AsPC-1细胞,G418筛选阳性细胞,获得稳定转染的阳性克隆。将转染载体的AsPC-1阳性克隆细胞和未转染载体的AsPC-1细胞分别暴露于浓度为8.875,37.5,142μmol/L的5F中作用72h。RT-PCR和Western blotting检测不同组细胞经5F作用72h后的PUMA表达;MTT检测细胞生长抑制,流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡,Hoechst 33258荧光染色法和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法检测细胞的凋亡。结果:5F促进AsPC-1细胞凋亡,抑制细胞生长,并有明显的剂量依赖性,在细胞凋亡的同时伴有PUMA表达的上调;当细胞转染PUMA反义核酸抑制PUMA表达后,受5F作用的细胞出现PUMA蛋白表达明显降低,同时伴有细胞凋亡的抑制及细胞的明显增殖。...     

BCSG1基因RNAi表达载体的构建与鉴定

目的:构建乳腺癌特异性基因(BCSG1)RNAi重组质粒,并检测其在三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-321中对BCSG1基因表达的干扰效果和对细胞增殖的影响。方法:将两组干扰片段BCSG1-R1、BCSG1-R2及阴性对照片段BCSG1-C分别克隆入pGenesil-1穿梭质粒,经酶切鉴定及测序后,将测序正确的克隆转染入大肠杆菌DH5α中进行扩增Real-time PCR检测重组质粒转染MDA-MB-321细胞后,各组细胞内BCSG1-mRNA表达水平,Transwell细胞侵袭实验检测重组质粒对MDA-MB-321细胞侵袭能力的影响。结果:成功将干扰片段和阴性对照片段克隆入pGenesil-1质粒,构建出pGenesil-1-BCSG1-R1、pGenesil-1-BCSG1-R2和pGenesil-1-BCSG1-C重组质粒。与对照组相比,BCSG1-R1和BCSG1-R2组的BCSG1-mRNA表达水平明显下调(P0.05);干扰后,MDA-MB-321细胞侵袭能力明显下降(P0.05)。结论:成功构建BCSG1-RNAi重组质粒,可有效下调三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-321内BCSG1的表达及细胞的侵袭能力。     

pCMV-tag2B-CD258质粒的构建和初步表达鉴定

目的构建肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)成员CD258的真核表达质粒,诱导并鉴定其表达。方法将克隆获得的CD258全长cDNA片段插入带有报告基因的真核表达质粒pCMV-tag2B中,构建CD258的重组表达载体pCMV-tag2B-CD258,经DNA测序证明CD258的cDNA片段的插入方向和其全长cDNA的碱基顺序,用脂质体Lifefectamine2000将重组质粒转染人前列腺癌IA8细胞系,诱导其表达,G418筛选阳性克隆,用Western Blot进行鉴定。结果pCMV-tag2B-CD258经双酶切表明有相应大小的DNA片断,序列分析证实为正确的有完整读码框的CD258基因,用脂质体转染法可将pCMV-tag2B-CD258导入IA8细胞并成功表达,目的蛋白经Western Blot鉴定具有生物学活性。结论重组质粒pCMV-tag2B-CD258能表达具有生物学活性的CD258蛋白,为研究CD258在前列腺癌中的功能打下了基础。     

ADAM17-siRNA对MCF-7人乳腺癌细胞增殖的影响

目的利用RNAi使解聚素-金属蛋白酶17(ADAM17)基因沉默,观察AD-AM17 mRNA在人MCF-7乳腺癌细胞中的表达及其对细胞增殖的影响。方法利用脂质体介导ADAM17-siRNA转染MCF-7细胞,采用实时荧光聚合酶链反应(Real-time PCR)检测ADAM17 mRNA表达的水平;MTT法检测细胞增殖的活性;流式细胞仪检测细胞周期。结果 ADAM17 mRNA在MCF-7细胞中高表达,转染特异性ADAM17-siRNA后,其表达显著被抑制,同时MCF-7细胞增殖能力也明显下降,细胞进入S和G2/M期的比例降低,绝大多数细胞停留在G0/G1期。结论 ADAM17-siRNA可通过脂质体有效转染MCF-7人乳腺癌细胞,转染后的MCF-7细胞增殖能力明显下降,这种作用与阻止癌细胞进入增殖周期有关。     

异长春花碱抑制人乳腺癌细胞转移侵袭的作用及其机制

目的 探讨异长春花碱抑制人乳腺癌细胞转移侵袭的作用及其机制.方法 人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-435细胞分别用异长春花碱1、10 μmol/L处理后,MTS法检测细胞黏附能力,Transwell法检测细胞侵袭能力,ELISA法检测细胞转移生长因子-β (TGF-β)分泌的变化,明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9活性,Western blotting法检测肿瘤细胞E-钙黏素、N-钙黏素、MMP-2、MMP-9、p-JNK及p-Akt蛋白的表达,RT-PCR法检测肿瘤细胞E-钙黏素、N-钙黏素及MMP-2、MMP-9基因的表达,双荧光素酶报告基因实验考察AP-1和核因子-κB (NF-κB)活性的变化.结果 异长春花碱1、10 μmol/L给药后,细胞黏附能力:MCF-7细胞分别下降34.8％、66.8％,MDA-MB-435细胞分别下降42.6％、72.3％;侵袭能力:MCF-7细胞分别下降44.4％、72.2％,MDA-MB-435细胞分别下降47.7％、86.4％; TGF-β分泌:MCF-7细胞分别下降28.2％、52.1％,MDA-MB-435细胞分别下降39.0％、55.1％;E-钙黏素基因表达:MCF-7细胞分别上调86.5％、181.6％,MDA-MB-435细胞分别上调116.6％、160.7％; N-钙黏素基因表达:MCF-7细胞分别下降33.7％、74.1％,MDA-MB-435细胞分别下降57.6％、76.9％; MMP-2基因表达:MCF-7细胞分别下降71.6％、88.4％,MDA-MB-435细胞分别下降57.4％、69.4％; MMP-9基因表达:MCF-7细胞分别下降15.0％、84.0％,MDA-MB-435细胞分别下调22.1％、73.0％;E-钙黏素蛋白表达显著上调,N-钙黏素蛋白表达明显下调,MMP-2和MMP-9及p-JNK、p-Akt蛋白表达显著下降;AP-1活性:MCF-7细胞分别下降27.7％、68.2％,MDA-MB-435细胞分别下降34.8％、71.4％; NF-κB活性:MCF-7细胞分别下降18.4％、44.8％,MDA-MB-435细胞分别下降24.4％、51.9％.结论 异长春花碱可抑制人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-435细胞体外侵袭能力,其机制可能与下调肿瘤转移相关信号通路及上皮间质转化表达有关.     

辣椒碱对乳腺癌MCF-7细胞增殖及p21和FBI-1表达的影响

目的:观察辣椒碱对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响及可能的分子机制。方法:设立辣椒碱组以及空白组,采用细胞计数试剂盒-8法(CCK-8)检测辣椒碱(50,100,150,200,250,300μmol·L-1)处理MCF-7细胞24,48,72 h后的细胞活性;克隆形成实验检测辣椒碱(100,150,200μmol·L-1)处理MCF-7细胞18 h再更换为完全培养基继续培养14 d后的克隆形成能力;实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测辣椒碱(100,150,200μmol·L-1)处理MCF-7细胞24 h后细胞中细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子p21(p21)和人类免疫缺陷病毒短转录诱导物连接因子-1(FBI-1)mRNA表达水平;蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测辣椒碱(100,150,200μmol·L-1)处理MCF-7细胞24 h后细胞中p21和FBI-1蛋白的表达水平。结果:与空白组比较,辣椒碱(50,100,150,200,250,300μmol·L-1)在体外对MCF-7细胞活性具有明显的抑制作用(P0.05,P0.01),并且这种抑制作用呈浓度和时间依赖效应;与空白组比较,辣椒碱(100,150,200μmol·L-1)均能显著抑制MCF-7细胞的克隆形成能力(P0.01);与空白组比较,辣椒碱(100,150,200μmol·L-1)能显著上调MCF-7细胞中p21 mRNA和蛋白的表达水平(P0.01),下调FBI-1 mRNA和蛋白的表达水平(P0.01)。结论:辣椒碱干预在体外对乳腺癌MCF-7细胞增殖具有抑制作用,潜在机制可能与其上调细胞中p21 mRNA和蛋白的表达水平,下调细胞中FBI-1 mRNA和蛋白的表达水平有关。     

淫羊藿苷及其拟代谢物的雌激素样作用研究

目的:用雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)表达阳性细胞株人乳腺癌细胞MCF-7检测淫羊藿苷及其拟代谢物的雌激素样活性[1]及构效关系。方法:用MTT法,增殖细胞核抗原(Proliferating CellNuclear Antigen,PCNA)免疫组化法检测其对体外培养MCF-7细胞增殖及细胞周期的影响;Real-timeRT-PCR法检测ERα、ERβ和PS2 mRNA表达水平变化。结果:淫羊藿素促进MCF-7增殖,而淫羊藿苷、淫羊藿次苷I和脱水淫羊藿素促增殖效应不明显;淫羊藿素10-9mol.L-1组PCNA阳性表达强于其它三组;淫羊藿素极显著增加ERα和PS2 mRNA的表达水平。所有受试物均不促进ERβmRNA表达。淫羊藿素促进ERα蛋白表达强于其它三组。结论:淫羊藿素有明显的雌激素样作用,而淫羊藿苷及其它两种受试物雌激素样作用不明显。四种受试物均不促进ERβmRNA表达。     

MPP~+对PC12细胞中细胞色素c和caspase-3表达的影响及镇肝熄风汤的调控作用

目的:研究甲基-苯基-吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)对PC12细胞细胞色素C(Cytc)和caspase-3蛋白表达的影响及镇肝熄风汤载药脑脊液的干预作用。方法:不同浓度的镇肝熄风汤载药脑脊液预处理体外培养的PC12细胞后30min后,加入250μmol/L MPP+共孵育24h。采用实时定量PCR检测PC12细胞caspase-3mRNA的表达,采用ELISA法检测PC12细胞细胞浆中Cyt c浓度变化。结果:MPP+诱导24h,PC12细胞中caspase-3mRNA表达明显增多,细胞浆中Cyt c浓度也明显升高,而镇肝熄风汤载药脑脊液能剂量依赖性地抑制MPP+诱导的caspase-3mRNA表达增多和细胞浆中Cyt c浓度升高。结论:MPP+诱导PC12细胞caspase-3mRNA表达和Cyt c浓度的增加,镇肝熄风汤其增加具有抑制作用。     

金雀异黄素对人乳腺癌细胞体外生长的抑制作用

目的:研究金雀异黄素(genistein)对人乳腺癌细胞系的体外生长作用及其作用机理。方法:选用人乳腺癌细胞系MCF-7(雌激素受体阳性细胞,ER+)和MDA-MB-231(雌激素受体阴性细胞,ER-)体外培养、MTT比色法、生长曲线和雌激素受体(ER)免疫组化染色等。结果:genistein能明显地抑制MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞的体外增殖,而且在一定浓度范围内均呈剂量依赖性,IC50分别是32.5,46.8μmol·L^-1。同时能拮抗外源性雌激素对MCF-7细胞的生长刺激作用,而对MDA-MB-231细胞的生长抑制作用与雌激素的存在与否无关。ER免疫组化染色结果表明,经过30μmol·L^-1 genistein处理的MCF-7细胞,细胞核内的阳性颗粒与对照组相比明显减弱(P<0.001)。结论:genistein能明显抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞的体外生长,且呈剂量依赖性;genistein对MCF-7细胞的生长抑制作用是通过ER途径来介导的,而对MDA-MB-231细胞是通过非ER途径来介导的。     

靶向VEGF—hTERT基因siRNA表达载体抑骨肉瘤生长的实验研究

目的：观察靶向VEGF-hTERT基因siRNA表达载体对骨肉瘤细胞增殖的影响和对裸鼠骨肉瘤生长的影响。方法：构RNA干扰腺病毒载体rA-hTERT和rAd-VEGF,单独和联合转染人骨肉瘤细胞系MG-63细胞后实时荧光定量PCR检测hTERT和VEGF基因表达情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;人骨肉瘤细胞系MG-63细胞于裸鼠成瘤后使用siRNA表达载体治疗,观察肿瘤的生长状况及组织病理学改变。结果：①转染后48h,rAd-hTERT对hTERT基因mRNA的抑制率约84%,对VEGF基因表达无明显抑制（P〉0.05）;rAd-VEGF对VEGF基因mRNA的抑制率约82%,对hTERT基因表达无明显抑制（P〉0.05）;rAd-hTERT-VEGF干扰组对hTERT基因表达抑制率约87%,VEGF基因表达抑制率约83%,联合干扰与单基因干扰相比,对hTERT-VEGF基因的表达抑制差异无显著性（P〉0.05）。②干扰组转染后l～6d均能促进细胞凋亡,联合干扰细胞凋亡率与单基因干扰细胞凋亡率相比,差异均有显著性（P〈0.05）。裸鼠实验中,基因组肿瘤的生长均受到明显抑制,且联合干扰组与单基因组比较有显著性差异（P〈0.05）。对骨肉瘤的肺转移联合干扰组有显著的抑制作用。结论：靶向VEGF-hTERT基因siRNA表达载体对骨肉瘤细胞系MG-63细胞和裸鼠骨肉瘤的生长及转移均有明显的抑制作用。     

实时定量PCR检测羟基喜树碱对乳腺癌细胞TIMP-3表达的影响

目的:观察羟基喜树碱处理乳腺癌细胞MCF-7中TIMP-3表达的改变,在mRNA水平探讨羟基喜树碱在乳腺癌治疗中的潜在新靶点。方法:以乳腺癌细胞MCF-7为研究模型,细胞暴露于羟基喜树碱浓度为10、40、80mg/L的培养液中24h,PBS组为对照组。采用SYBR荧光实时定量PCR法检测TIMP-3表达,相对定量采用比较CT值法。结果:不同浓度的HCPT,TIMP-3 mRNA表达水平均高于对照组且均与其有显著差异(P0.05),其中以40mg/L组促进TIMP-3表达为最强。与前期的基因芯片研究结果相符合。结论:HCPT可诱导乳腺癌细胞MCF-7中TIMP-3表达增多。     

农药氰戊菊酯与雌二醇联合作用对乳腺癌MCF-7细胞的影响

目的:旨在通过乳腺癌MCF-7细胞对农药氰戊菊酯和雌二醇联合作用进行研究,评价氰戊菊酯和雌二醇联合作用的环境雌激素活性。方法:MTT法检测氰戊菊酯和雌二醇联合对MCF-7细胞生长的作用;用流式细胞仪检测氰戊菊酯和雌二醇联合对MCF-7细胞周期分布情况;采用Western Blot法测定氰戊菊酯和雌二醇联合对MCF-7细胞ERK1/2,P-ERK1/2蛋白表达的影响。结果:MTT结果显示,氰戊菊酯与雌二醇联合后能促进MCF-7细胞增殖,但增殖作用比单独应用氰戊菊酯或雌二醇效应低,两者呈拮抗作用;流式细胞仪分析氰戊菊酯和雌二醇联合作用后与空白组比较,增殖效应不明显;Western Blot结果显示,氰戊菊酯和雌二醇联合对ERK1/2蛋白无明显影响,但可以促进P-ERK1/2蛋白的表达,但与氰戊菊酯和雌二醇单独作用比较,P-ERK1/2蛋白的表达较弱。结论:氰戊菊酯与雌二醇联合作用于MCF-7细胞,增殖效应低于单独作用组,两者联用具有拮抗作用,可通过对ERK信号传导通路的影响而发挥促进细胞增殖的作用。     

软坚消瘤片药物血清对乳腺癌MCF-7细胞生长的机制研究

目的：通过观察软坚消瘤片药物血清对乳腺癌MCF-7细胞的芳香化酶和雌激素受体基因的表达、细胞增殖周期及细胞凋亡的影响,探讨软坚消瘤片治疗乳腺肿块性疾病的可能机制。方法：制备软坚消瘤片含药动物血清,以体外培养的MCF-7细胞为研究对象,以qRT-PCR法检测乳腺癌细胞芳香化酶（CYP19）及雌激素受体（ER）mRNA表达水平;流式细胞术（FCM）测定细胞增殖周期和凋亡水平;MTS实验测定细胞生长曲线。结果：与空白对照组比较,含药血清组作用细胞24h后能明显抑制乳腺癌细胞株MCF-7的CYP19mRNA、ERmRNA表达水平,表达水平分别降低0.32和0.09倍;药物血清作用48h后S期和G2/M期细胞所占比例降低,尤以G2/M期最为显著,相应的G0/G1期细胞增加,药物血清抑制了细胞增殖的正常进行;凋亡实验示细胞早期凋亡率增加,药物血清组总体凋亡率高于对照组;药物血清作用细胞48h以后细胞生长曲线幅度开始明显低于对照组,在96h时抑制效果最明显。结论：软坚消瘤片药物血清影响乳腺癌MCF-7细胞的雌激素合成及其作用发挥,同时抑制一定时段的细胞生长。     

ent-贝壳杉烯糖酯类衍生物的合成及其抗肿瘤活性的研究（英文）

目的：对含有exo-亚甲基环戊酮或α-亚甲基内酯药效团的ent-贝壳杉烯类化合物进行结构修饰,以改善其活性及水溶性。方法：以甜菊苷为原料,在4位羧基接入单糖而得到目标化合物,并使用MTT法对目标化合物进行抗肿瘤活性测试。结果：化合物1b对细胞株HepG2,Bel-7402,A549,MCF-7,MDA-MB-231均表现出了较好的抑制活性,IC50分别为0.12,0.91,0.35,0.08,0.07μmol·L–1。另外,化合物3c对HepG2（IC50=0.01μmol·L–1）具有较强的抑制作用。结论：化合物1b和3c可以作为潜在的抗肿瘤化合物进行深入研究。     

bFGF基因修饰骨髓间充质干细胞在大鼠脊髓损伤模型中的表达

目的：探讨bFGF基因修饰骨髓间充质干细胞（Bone Marrow—derived）。方法：96只清洁级成年雄性Sprague—Darley大鼠,随机分为目的基因bFGF修饰BMSCs组（pcDNA3．1-bFGF组）、空载质粒pcDNA3．1修饰BMSCs组（pcDNA3．1组）、骨髓间充质干细胞组（BMSCs组）和DMEM组（DMEM组）,每组24只,采用Allen氏脊髓损伤模型,于损伤点注射上述各组相关细胞及培养基DMEM,在注射后1d、7d、14d、21d取损伤脊髓组织,用免疫组织化学及RT-PCR法检测bFGF表达情况。结果：基因修饰组术后各时间点脊髓组织中bFGF表达较空载组和BMSCs组明显增高（P〈0．01）,并于7d或14d表达最明显（P〈0．01）。结论：bFGF基因修饰BMSCs移植可以在脊髓损伤模型中表达。