稳定表达人有机阳离子转运体1的细胞模型构建

 目的 建立能稳定表达人有机阳离子转运体1（human organic cation transporter1, hOCT1）野生型及两个突变体的马丁达比狗肾上皮（Madin-Darby canine kidney, MDCK）细胞模型。方法 从人肝组织中提取hOCT1野生型基因,经定点突变获得hOCT1_P341L,hOCT1_M420del两个突变型基因,构建表达质粒pcDNA3.1(+)-hOCT1,pcDNA3.1(+)-hOCT1_P341L,pcDNA3.1(+)-hOCT1_M420del。将质粒转染MDCK细胞,通过G418筛选获得抗性克隆,并通过hOCT1的荧光底物(4-二甲氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶 (ASP+)筛选得到具有较高活性的MDCK-hOCT1细胞。经反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)及经典底物N-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)的摄取实验,鉴定筛选得到的单克隆细胞株hOCT1 mRNA的表达及功能。结果 本实验获得的hOCT1野生型及2个突变体细胞模型与转染空载体的MDCK细胞相比,其 hOCT1 mRNA表达量显著增高,对经典底物MPP+的摄取为转染空载体细胞的12.5,13.7,12.0倍,hOCT1抑制剂可显著抑制细胞对MPP+的摄取。结论 建立的细胞模型可用于hOCT1抑制剂及底物的筛选。     

稳定表达人寡肽转运体1的细胞模型构建及应用

 目的 构建稳定表达人寡肽转运体1（hPepT1）的马丁-达比犬肾细胞模型(MDCK-hPepT1),并将其应用于中药单体中人寡肽转运体1抑制剂的筛选。方法 构建重组质粒pcDNA3.1(+)-hPepT1,将其转染马丁-达比犬肾系细胞,经G418筛选后以有限稀释法挑选单克隆细胞。以人寡肽转运体1荧光底物β-Ala-Lys(AMCA)和经典底物Glysar对单克隆细胞转运活性进行验证;通过反转录聚合酶链式反应验证人寡肽转运体1在转录水平的表达。以中药单体对Glysar摄取的影响实现人寡肽转运体1抑制剂的筛选。结果 获得的两株单克隆细胞（D19、A11）对β-Ala-Lys(AMCA)摄取均显著高于转染空载体的马丁-达比犬肾系细胞,对Glysar的摄取分别为转染空载体细胞的24、11倍;D19、A11中hPepT1的mRNA水平亦显著高于转染空载体的细胞;已知的人寡肽转运体1抑制剂（底物）显著减少单克隆细胞D19和A11对Glysar的摄取;部分中药单体对Glysar摄取产生不同程度的抑制。结论 本实验成功构建了稳定高表达人寡肽转运体1的马丁-达比犬肾系细胞模型,并应用该模型筛选出对人寡肽转运体1具有潜在抑制作用的中药单体。