丹参酮ⅡA对大鼠脑动脉瘤形成的作用

目的观察丹参酮(Tan)ⅡA对大鼠脑动脉瘤(CA)形成的作用。方法大鼠随机分为模型组(CA组)和治疗组(CA+TanⅡA组)。CA组采用手术和高盐饮食诱导CA模型;CA+TanⅡA组采用手术和高盐饮食诱导CA后,腹腔注射0.9%NaCl溶液1 ml的TanⅡA(25 mg/kg)。检测TanⅡA对血压的影响;观察CA大小和形态改变及巨噬细胞浸润;q-PCR检测单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9和核因子(NF)-κB mRNA的表达;Western印迹检测NF-κB蛋白的表达。结果TanⅡA对大鼠术后血压没有明显影响;形态学观察表明,TanⅡA治疗对大鼠CA的生长有抑制作用。CA+TanⅡA组动脉瘤大小明显低于CA组(P<0.05);与CA组相比,TanⅡA处理使血管壁增厚(P<0.05);CA+TanⅡA组巨噬细胞浸润明显少于CA组(P<0.05)。CA+TanⅡA组MCP-1,MMP-2和MMP-9 mRNA表达水平明显低于CA组(P<0.05)。CA+TanⅡA组NF-κB mRNA和蛋白表达水平明显低于CA组(P<0.05)。结论TanⅡA在CA形成过程中,通过抑制NF-κB信号和巨噬细胞浸润减少炎症反应,抑制CA形成。     

动脉粥样硬化坏死性凋亡关键基因的筛选与验证

目的]通过生物信息学方法筛选出动脉粥样硬化坏死性凋亡关键基因,并借助体外实验加以验证,从坏死性凋亡的角度来为预防和治疗动脉粥样硬化提供新策略。 [方法]从GEO数据库下载与动脉粥样硬化斑块相关的基因,从GeneCards数据库下载与坏死性凋亡相关的基因,将两者取交集从而获得动脉粥样硬化坏死性凋亡基因,进一步对基因的作用机制和信号通路进行GO和KEGG富集分析,并构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络和筛选关键基因,最后用终浓度为100 mg/L的氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)处理巨噬细胞,通过RT-PCR和Western blot检测关键基因的表达情况。 [结果]共获得动脉粥样硬化坏死性凋亡基因81个,通过GO和KEGG富集分析发现其主要在内多肽酶活性的正向调节、IκB激酶(IKK)/核因子κB(NF-κB)信号传导和自噬信号通路等方面显著富集;利用Cytoscape软件中cytoHubba插件的5种算法得到HSPA8、STAT3、HMOX1、SQSTM1和FAS 5个关键基因。与正常对照组相比,ox-LDL处理的THP-1巨噬细胞中HMOX1基因呈高表达(P＜0.05),而HSPA8、STAT3、SQSTM1和FAS基因表达则无明显变化(P＞0.05);ox-LDL处理的RAW264.7巨噬细胞中HMOX1、SQSTM1基因呈高表达(P＜0.05),而HSPA8、STAT3和FAS基因表达无明显变化(P＞0.05)。THP-1巨噬细胞中HMOX1蛋白表达也相应升高。 [结论]HMOX1可能是动脉粥样硬化坏死性凋亡的关键基因,并有望成为动脉粥样硬化防治的新靶点。     

急性病毒性心肌炎患者CCL20对Th17细胞趋化性作用

目的:探讨CCL20与急性病毒性心肌炎(AVMC)患者Th17细胞趋化性的关系。方法:选择11例AVMC患者为研究对象,同时选取10例健康人作为对照。利用siRNA技术干预AVMC患者外周血巨噬细胞,将其分为A(不接受siRNA转染)、B(接受CCL20 siRNA转染)、C(阴性对照,接受scramble siRNA转染)亚组。应用ELISA法检测AVMC组患者血清CCL20及其巨噬细胞体外分泌CCL20的水平,趋化实验和流式细胞学结合观察体外不同水平CCL20对Th17细胞的趋化能力及表达CCL20受体CCR6的Th17细胞比例的影响,实时定量PCR法检测趋化板下室细胞表面CCR6mRNA的表达。结果:与健康对照组[(2.78±0.64)μg/L]相比,AVMC组患者体内血清CCL20水平[(11.36±2.45)μg/L]明显升高,P<0.05。体外实验中,B亚组巨噬细胞培养上清CCL20含量、趋化实验募集的Th17细胞比例、表达CCR6的Th17细胞比例和CCR6mRNA相对表达水平[(0.94±0.08)ng/L、(6.86±0.59)%、(2.56±0.78)%、(0.36±0.08)]均低于A亚...     

miR-142-5p靶向调控TGF-β2促进人巨噬细胞凋亡

目的探讨miR-142-5p在动脉粥样硬化组织中的表达及对人巨噬细胞凋亡的作用。方法构建动脉粥样硬化大鼠模型,qRT-PCR检测动脉粥样硬化组织中miR-142-5p的表达水平。50μg/L氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激人巨噬细胞、血管平滑肌细胞(VSMC)、内皮细胞24 h后,提取细胞RNA,qRT-PCR检测细胞中miR-142-5p的表达水平。靶基因预测软件预测miR-142-5p的靶基因,双荧光素酶报告基因鉴定靶基因的正确性。细胞转染miR-142-5p mimic、mimic control、miR-142-5p inhibitor、inhibitor control,Western blot和qRT-PCR检测miR-142-5p对靶基因的调控作用,流式细胞仪检测miR-142-5p和靶基因对巨噬细胞凋亡的作用。结果 miR-142-5p在动脉粥样硬化组织中表达上调,与正常组织相比差异显著(P0.01)。血管平滑肌细胞和内皮细胞经ox-LDL刺激后miR-142-5p的表达水平与刺激前没有明显变化,而巨噬细胞经ox-LDL刺激后miR-142-5p的表达水平较刺激前明显升高(P0.01)。预测miR-142-5p的靶基因为转化生长因子β2(TGF-β2)。miR-142-5p mimic与TGF-β2共转染后荧光素酶活性最低;miR-142-5p mimic组TGF-β2蛋白和mRNA的表达水平与mimic control组相比明显下降,miR-142-5p inhibitor组TGF-β2蛋白和mRNA的表达水平与inhibitor control组相比明显升高(P0.01);miR-142-5p mimic组细胞凋亡率明显高于mimic control组,TGF-β2 siRNA组细胞凋亡率明显高于siRNA control组(P0.01)。结论 miR-142-5p在动脉粥样硬化中过度表达,miR-142-5p通过下调靶基因TGF-β2促进人巨噬细胞凋亡。     

Notch信号通路调控巨噬细胞极化在大鼠纤维化型饲鸽者肺的作用

目的 探讨Notch信号通路调控巨噬细胞极化方向与大鼠纤维化型饲鸽者肺的关系。方法 选取正常SD大鼠(Ctrl组),通过观察病理、CT,检测纤维化标记物构建纤维化型过敏性肺炎大鼠模型(M组),予以γ分泌酶(DAPT)抑制Notch信号通路(M+DAPT组),通过荧光定量PCR技术检测阻断Notch信号通路对巨噬细胞极化方向的影响。结果 正常大鼠气道内滴注致敏原冻干粉20周后，病理及CT可见纤维化形成，且α-SMA、TGF-β1表达水平增高，证实造模成功；M组与Ctrl组比较：纤维化型过敏性肺炎大鼠肺组织Notch信号通路关键蛋白配体，DLL1、DLL4、JAG1、JAG2及受体Notch1、Notch2的蛋白表达水平增高；应用DAPT抑制Notch信号通路后DLL4、JAG1、JAG2及受体Notch1均下降(P<0.05);M组较Ctrl组比较：M1型巨噬细胞标记基因肿瘤坏死因子(TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达量下降；M2型巨噬细胞标记基因甘露糖受体C2(Mrc2)、重组人精氨酸酶1(Arg-1)mRNA表达量升高(P<0.05),应用DAPT抑...     

脂联素通过调节巨噬细胞自噬水平发挥抗动脉粥样硬化作用的机制研究

目的:本研究拟通过探究脂联素(APN)对巨噬细胞自噬水平的影响揭示其抗动脉粥样硬化(AS)的新机制,为临床AS的治疗提供新靶点。方法:采用在体外培养人THP-1细胞系诱导的巨噬细胞,分为对照组,氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)组,ox-LDL+APN组三组,给予细胞ox-LDL处理模拟斑块内环境后,采用Cell Counting Kit(CCK-8)方法检测ox-LDL对细胞的毒性,并使用蛋白质印迹方法(Western blot)检测细胞内相关蛋白表达。在给予细胞APN及ox-LDL处理后,使用Western blot方法检测细胞内自噬相关蛋白表达情况,并应用透射电子显微镜(TEM)观察巨噬细胞的超微结构。使用Annexin V/PI染色方法检测细胞凋亡发生情况。结果:CCK-8结果表明巨噬细胞存活率随ox-LDL浓度升高明显下降(P<0.05),Western blot结果示给予ox-LDL处理后,细胞内自噬标记物LC3 II的表达水平明显升高,呈浓度及时间依赖性,且在ox-LDL的浓度为30 mg/L和孵育时间为6h时自噬水平最高(P<0.05)。ox-LDL+APN组的巨噬细胞中LC3 II表达水平较单独给予ox-LDL处理组明显降低,同时电镜结果也表明ox-LDL+APN组的巨噬细胞内自噬小体的形成较ox-LDL组有明显减少(P<0.05)。流式细胞术的Annexin V/PI染色方法检测结果显示APN可抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞早期凋亡,且APN对凋亡的抑制作用不依赖于自噬。结论:ox-LDL可使巨噬细胞内自噬水平增加。APN可能通过降低巨噬细胞内自噬水平发挥抗AS的作用。     

Cenicriviroc对HeLa细胞CCL2/CCL5 APOBEC3A/B以及HPV18 E6/E7 mRNA转录水平的影响

目的观察cenicriviroc处理后HeLa细胞中CCL2/CCL5、载脂蛋白B信使核糖核酸(mRNA)编辑酶催化多肽样蛋白3(APOBEC3)A/APOBEC3B(A3A/A3B)以及人乳头瘤病毒(HPV)18早期基因E6/E7 mRNA的相对表达量,探讨趋化因子受体与APOBEC3,以及与HPV早期基因mRNA转录水平间的关联性。方法 MTT法检测不同浓度cenicriviroc对HeLa细胞的毒性;实时荧光定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测50和25 nM cenicriviroc作用于HeLa细胞12、24、48 h后胞中CCR2/CCR5、CCL2/CCL5、A3A/A3B和HPV18 E6/E7 mRNA的相对表达量,并与未处理的HeLa细胞作比较。结果 100 nM以下的cenicriviroc作用48 h内对HeLa细胞基本无毒性。50 nM cenicriviroc在处理12、24、48 h后,对CCR2/CCR5、CCL2/CCL5和HPV18 E6/E7 mRNA的转录水平均有一定的下调作用;而25 nM组仅在处理12 h时能显著下调CCR2、E6 mRNA的转录水平(P0.05)。除12 h 25 nM组与对照组间A3A基因mRNA的相对表达量差异无统计学意义外,其余各时间点50、25 nM组均可明显升高A3A mRNA的相对表达量(P0.05);两个浓度组胞内A3B mRNA的相对表达量均没有明显变化(P0.05)。结论 cenicriviroc在体外能抑制HeLa细胞CCR2/CCR5、CCL2/CCL5、HPV18 E6/E7 mRNA的转录水平,并上调胞内A3A mRNA的转录。     

ox-LDL经由LOX-1受体对PPARγ-LXRα-ABCA1通路激活的作用研究

目的探讨氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)经由血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1(LOX-1)受体对PPARγ-LXRα-ABCA1通路激活的作用。方法浓度梯度ox-LDL(0~40 mg/L,12 h)刺激J774A.1巨噬细胞,检测LXRα、ABCA1的表达。构建293T细胞LOX-1过表达的PPARγ双荧光素酶报告基因系统,激光共聚焦及Western blot检测LOX-1的分布与表达,双荧光素酶报告基因系统检测PPARγ的转录活化情况。对J774A.1巨噬细胞分别进行LOX-1 siRNA和PPARγsiRNA沉默,ox-LDL(30 mg/L,12 h)孵育后检测LXRα、ABCA1蛋白的表达。结果ox-LDL可显著上调J774A.1细胞LXRα和ABCA1的表达(P0.01,n=3)。LOX-1过表达的PPARγ双荧光素酶报告基因系统检测显示ox-LDL能够通过LOX-1增加PPARγ的转录活性;对J774A.1巨噬细胞分别进行LOX-1siRNA、PPARγsiRNA沉默后发现,LXRα和ABCA1的表达均显著降低(P0.01,n=3)。结论 ox-LDL可通过LOX-1受体激活PPARγ转录活性,从而上调LXRα、ABCA1蛋白表达,完成PPARγ-LXRα-ABCA1信号通路的激活。     

冠心病进展相关基因筛选及冠心Ⅱ号方干预靶点的预测

目的:探索冠心病疾病进展相关基因,并预测冠心Ⅱ号方防治冠心病的作用靶点。方法:从基因表达综合数据库(GEO)下载急性心肌梗死(AMI)与稳定型冠心病(SCAD)病人转录组表达谱,通过差异表达分析和加权基因共表达网络分析(WGCNA),筛选冠心病疾病进展相关基因,并针对冠心病进展相关基因进行基因本体(GO)功能分析与京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。从中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)数据库下载冠心Ⅱ号方的有效成分及药效靶点,与冠心病疾病进展相关基因进行交集分析,获得冠心Ⅱ号方防治冠心病的潜在靶点。结果:通过差异表达分析比较AMI和SCAD转录组表达谱,共获得166个差异表达基因(DEGs)。通过WGCNA获得与AMI相关的基因模块Black。取DEGs与Black模块的交集,获得64个冠心病疾病进展相关基因。从TCMSP数据库共获得224个冠心Ⅱ号方的药效靶点,将药效靶点与冠心病疾病进展相关基因取交集,得到冠心Ⅱ号方防治冠心病的潜在作用靶点,即过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARG)、单核细胞分化抗原CD14(CD14)和细胞色素P4501b1(CYP1B1)...     

swiprosin-1在动脉粥样硬化组织中的表达及对巨噬细胞凋亡和炎症因子表达影响

目的探讨swiprosin-1在动脉粥样硬化组织中的表达及对巨噬细胞凋亡和炎症因子表达的影响。方法构建动脉粥样硬化小鼠模型,RT-PCR和Western blot检测动脉粥样硬化组织中swiprosin-1的表达水平。用氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)处理巨噬细胞THP-1、平滑肌细胞VSMC、内皮细胞EC-304,RT-PCR和Western blot检测swiprosin-1的表达水平。巨噬细胞THP-1转染swiprosin-1 siRNA和siRNA control,经ox-LDL处理后,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9表达,ELISA检测培养液上清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)含量。结果 swiprosin-1在动脉粥样硬化组织中的表达水平明显高于正常组织。swiprosin-1在ox-LDL处理后的巨噬细胞THP-1中表达水平最高,而在平滑肌细胞VSMC、内皮细胞EC-304中表达水平极低。ox-LDL处理后巨噬细胞THP-1凋亡率高达21.64%±1.88%,细胞中cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9表达水平升高,细胞培养液上清中TNF-α、IL-6含量也明显升高。干扰swiprosin-1表达后的巨噬细胞THP-1经ox-LDL处理后凋亡率下降为15.25%±1.10%,细胞中cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9表达水平降低,细胞培养液上清中TNF-α、IL-6含量也明显下降。结论 swiprosin-1在动脉粥样硬化组织中表达升高,降低swiprosin-1表达能够抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞凋亡和巨噬细胞炎症因子分泌。     

单核细胞源性泡沫细胞TREM-1的表达

目的 探讨髓系细胞触发受体-1(TREM-1)在氧化型低密度脂蛋白胆固醇(ox-LDL)诱导的巨噬细胞源性泡沫细胞中的表达情况.方法 先后用PMA、ox-LDL诱导人U937细胞,使其转化为泡沫细胞.用RT-PCR法及Western印迹法检测PMA诱导组、低密度脂蛋白(LDL)组和ox-LDL组细胞中TREM-1 mRNA及蛋白的表达.结果 与PMA诱导组、PMA+LDL组细胞比较,PMA+ox-LDL组细胞TREM-1 mRNA及蛋白表达水平均明显增高(P<0.05).结论 TREM-1可能参与泡沫细胞的形成,与动脉粥样硬化(AS)斑块的发生发展密切相关,可能成为AS治疗的一个新的靶点或监测AS进展的一项新指标.     

丹参酮ⅡA通过调节自噬小体对ox-LDL诱导内皮细胞氧化应激损伤的保护作用

目的基于自噬小体形成信号通路探讨丹参酮ⅡA对ox-LDL诱导内皮细胞氧化应激损伤的保护作用及机制。方法体外培养EA.hy926细胞,随机分为正常组、模型组、丹参酮ⅡA组、丹参酮ⅡA+模型组、3-MA组、模型+3-MA组、丹参酮ⅡA+模型+3-MA组。比色法检测各组细胞氧化应激损伤丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力,Western blot技术检测细胞自噬小体形成信号通路相关蛋白表达情况。结果与正常组比较,模型组MDA含量增高(P0.01),SOD活力降低(P0.01),LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ蛋白含量增多(P0.01);3-MA组LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ蛋白含量无明显变化(P0.05)。与模型组比较,丹参酮ⅡA+模型组细胞中MDA含量降低(P0.01),SOD活力增高(P0.01),LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ蛋白含量增多(P0.01);模型+3-MA组MDA含量增高(P0.01),SOD活力降低(P0.01),LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ蛋白含量减少(P0.01)。与丹参酮ⅡA+模型组比较,丹参酮ⅡA+模型+3-MA组MDA含量增高(P0.01),SOD活力降低(P0.01),LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ蛋白含量减少(P0.01)。与正常组比较,模型组Atg3、Atg4b、Atg7蛋白表达水平明显增高(P0.05,P0.01);与模型组比较,丹参酮ⅡA+模型组Atg3、Atg7、Atg5-Atg12蛋白表达水平明显增高(P0.05,P0.01);与丹参酮ⅡA+模型组比较,丹参酮ⅡA+模型+3-MA组Atg3、Atg7、Atg5-Atg12蛋白表达水平均明显降低(P0.05,P0.01)。结论丹参酮ⅡA可能通过调节EA.hy926细胞自噬小体形成信号通路即Atg12-Atg5通路和LC3-PE通路相关蛋白,发挥其保护EA.hy926细胞抗氧化应激损伤的生物学活性,进而防治动脉粥样硬化的发生发展。     

NOD1/RIP2信号通路对巨噬细胞炎性活化的作用

目的以人单核细胞株THP-1为基础,探讨NOD1/受体相互作用蛋白2(RIP2)信号通路对巨噬细胞炎性活化及表型的影响。方法用160 nmo L/L的佛波酯(PMA)将THP-1单核细胞诱导分化成巨噬细胞,分别用10、25和50 mg/L浓度的氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激THP-1源性巨噬细胞24 h,以空白组为对照组。应用RT-PCR法检测NOD1和RIP2的mRNA表达情况;应用Western blot法检测NOD1和RIP2的蛋白表达情况;应用ELISA法检测细胞培养液中单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的分泌;应用流式细胞学检测巨噬细胞表面抗原CD16、CD68表达。结果 ox-LDL能以剂量依赖的方式激活THP-1源性巨噬细胞中NOD1/RIP2信号通路,随着ox-LDL刺激浓度的增加,NOD1、RIP2的mRNA和蛋白表达水平升高(P0.05)。NOD1/RIP2信号通路激活后能使细胞培养物上清液中炎症因子MIF和MCP-1的表达增加,随着ox-LDL刺激浓度的增加,MCP-1和MIF的分泌增多(P0.05)。NOD1/RIP2信号通路激活后能改变巨噬细胞表面抗原CD16、CD68的表达,随着ox-LDL刺激浓度的变化,巨噬细胞表面抗原CD16/CD68的平均荧光强度发生变化,其中50 mg/L组能显著下调CD16/CD68的表达(P0.01)。结论巨噬细胞中NOD1/RIP2信号通路能被ox-LDL以剂量依赖的方式激活,NOD1/RIP2信号通路激活后能导致巨噬细胞的炎性活化及其表型变化,这可能是其参与动脉粥样硬化形成和发展过程的主要机制。     

Let-7f靶向抑制A20表达在血管内皮细胞炎症反应中的作用研究

目的观察let-7f在氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导血管内皮细胞炎症反应过程中的变化规律,探讨let-7f参与动脉粥样硬化起始发病过程的分子机制。方法采用双抗体夹心ELISA方法观察不同剂量ox-LDL处理血管内皮细胞时细胞间粘附分子1(ICAM-1)的表达变化情况,RT-qPCR检测不同剂量ox-LDL处理血管内皮细胞时let-7f的表达变化规律,Western blot法分析不同剂量ox-LDL处理血管内皮细胞时核因子κB(NF-κB)的核移位情况和ox-LDL对人脐静脉内皮细胞A20表达及NF-κB通路活化的影响,双荧光素酶报告实验检测let-7f与A20基因的3’-UTR靶向结合,Western blot法检测let-7f对A20表达的调控。结果 20μg/ml ox-LDL可导致血管内皮细胞培养液中ICAM-1的含量明显升高,血管内皮细胞let-7f的表达明显上调(均为P0.05),且随着ox-LDL作用剂量的增加,ICAM-1与let-7f的表达变化均呈现明显的剂量效应关系。此外,20μg/ml ox-LDL可导致血管内皮细胞NF-κB向核内移位,随着ox-LDL作用剂量的增加核内NF-κB明显增多(P0.05)。100μg/ml ox-LDL作用于血管内皮细胞,可引起A20下调,IKK被磷酸化,并进一步导致NF-κB磷酸化增多,而let-7f能够与A20基因的3’-UTR靶向结合并明显抑制其表达。结论 Let-7f可能通过调控NF-κB信号传导通路的活化参与血管内皮细胞的炎症反应过程,提示let-7f可能成为动脉粥样硬化早期预防和治疗的新靶点。     

RNA干扰诱导肝癌HepG2细胞凋亡对丹参酮ⅡA药物敏感性的影响

目的:探讨载体介导的RNA干扰技术诱导HepG2细胞凋亡对丹参酮ⅡA药物敏感性的影响.方法:应用靶向细胞周期E(cyclin E)基因的siRNA真核表达载体转染HepG2细胞诱导凋亡,再以丹参酮ⅡA处理48h(cyclinE siRNA+丹参酮ⅡA组),同时设立cyclin EsiRNA组、无义siRNA组、丹参酮ⅡA组以及空白对照组,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率,吖啶橙荧光染色检测细胞凋亡形态,Western blot法观察细胞Caspase-3蛋白表达.结果:单用cyclinE siRNA质粒转染或丹参酮ⅡA处理肝癌HepG2细胞,细胞凋亡率显著高于空白对照组(P＜0.01),2μg/ml剂量凋亡率分别达到21.6%、23.6%.cyclinE siRNA质粒转染预诱导再经丹参酮ⅡA处理,HepG2细胞G0～G1期比例显著增高,S期、G2～M期细胞所占有比例明显下降;与单用cyclinE siRNA质粒转染、丹参酮ⅡA两组比较,细胞凋亡率分别增高了1.81和1.61倍,比两组合计增高0.35倍,Caspase-3蛋白表达水平分别增高了0.91倍和0.66倍.结论:通过cyclinE siRNA质粒转染诱导的HepG2细胞凋亡可提高丹参酮ⅡA药物敏感性,其机制与增强凋亡控制相关基因表达有关.     

干扰Sestrin2表达对ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的观察干扰Sestrin2表达对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡的影响。方法用ox-LDL处理HUVEC复制内皮细胞损伤模型。Western blot检测不同浓度ox-LDL处理HUVEC不同时间Sestrin2的蛋白表达水平及转染Sestrin2 siRNA后Sestrin2的蛋白表达水平;流式细胞术检测干扰Sestrin2表达后对ox-LDL诱导的HUVEC凋亡率的影响;Western blot检测干扰Sestrin2表达后对ox-LDL诱导的HUVEC中Caspase-3表达的影响及ox-LDL对HUVEC中JNK通路的影响。结果不同浓度(20、50和100 mg/L)的ox-LDL处理HUVEC 24 h均能明显上调Sestrin2表达;50 mg/L ox-LDL处理HUVEC不同时间(24 h和48 h)均能明显上调Sestrin2表达,24 h达高峰;转染Sestrin2 siRNA能明显抑制Sestrin2的表达;ox-LDL能明显诱导HUVEC凋亡,转染Sestrin2 siRNA能明显促进由ox-LDL诱导的HUVEC凋亡;ox-LDL能明显诱导p-JNK和p-c-Jun的表达,且SP600125能明显抑制由ox-LDL诱导的Sestrin2表达。结论 ox-LDL通过JNK/c-Jun信号通路诱导Sestrin2表达,干扰Sestrin2表达能明显促进ox-LDL诱导的HUVEC凋亡。     

不同种类脂肪酸对巨噬细胞M1/M2极化的影响

背景:巨噬细胞表型和功能改变在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的发生、发展中具有重要作用。近年研究发现不同种类脂肪酸在NAFLD中发挥不同作用。目的:探讨不同种类脂肪酸对巨噬细胞M1/M2极化的影响及其可能机制。方法:分别以脂多糖(LPS)、白细胞介素-4(IL-4)、饱和脂肪酸[棕榈酸(PA)]、多不饱和脂肪酸[二十二碳六烯酸(DHA)]、LPS/IL-4联合PA/DHA处理小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞株,同时设立阴性对照组。采用real-time PCR检测M1型巨噬细胞极化基因[诱生型一氧化氮合酶2(i NOS2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]和M2型巨噬细胞极化基因[精氨酸酶1(ARG1)、甘露糖受体C2(MRC2)]表达;采用蛋白质印迹法检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和磷酸化核因子-κBp65(p NF-κBp65)表达。结果:与阴性对照组比较,LPS组i NOS2、TNF-α表达显著升高(P<0.01;P<0.05),IL-4组ARG1、MRC2表达显著升高(P<0.01;P<0.05),PA组i NOS2、TNF-α、ARG1表达显著升高(P<0.05;P<0.01;P<0.05),DHA组i NOS2表达显著降低(P<0.01)。LPS+PA组和IL-4+PA组可进一步影响TNF-α、ARG1表达,但与LPS组、IL-4组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与LPS组比较,LPS+DHA组i NOS2、TNF-α表达显著降低(P<0.05;P<0.05);与IL-4组比较,IL-4+DHA组ARG1表达显著降低(P<0.01)。与阴性对照组比较,PA组、DHA组PPARγ蛋白表达水平显著升高,PA组p NF-κBp65蛋白表达水平显著升高。结论:饱和脂肪酸能诱导巨噬细胞M1/M2混合型极化,而多不饱和脂肪酸则抑制巨噬细胞M1型极化。不同种类脂肪酸可能通过PPARγ/NF-κB相关信号通路参与巨噬细胞M1/M2极化的转化。     

巴西日圆线虫虫体蛋白体外诱导THP-1来源巨噬细胞极化的研究

目的　分析巴西日圆线虫虫体蛋白体外诱导人单核细胞白血病THP?1细胞来源巨噬细胞的极化方向,探索机体对巴西日圆线虫感染的免疫应答机制。方法　建立并维持巴西日圆线虫培养的实验室循环,无菌条件下收集L3和L5虫体,分别制备虫体蛋白;建立THP?1细胞体外培养体系,经500 ng/mL佛波酯（PMA）刺激培养后呈贴壁状态的M0型细胞分别采用500 ng/mL脂多糖（LPS）+ 100 ng/mL γ?干扰素（IFN?γ）、白细胞介素4（IL?4）+ IL?13（浓度均为100 ng/mL）、L3及L5虫体蛋白（浓度均为5 mg/mL）进行刺激,同时设不加任何刺激的阴性对照组。通过显微镜镜检观察刺激后细胞形态、实时荧光定量PCR（qPCR）检测M1/M2型巨噬细胞特异性基因mRNA表达水平、流式细胞术检测巨噬细胞表面标志物及酶联免疫吸附试验（ELISA）检测M1/M2型巨噬细胞分泌的细胞因子含量,观察巴西日圆线虫虫体蛋白体外诱导THP?1来源巨噬细胞的极化方向。结果　THP?1细胞经PMA刺激培养呈贴壁的M0型细胞后,经LPS + IFN?γ刺激培养后呈特征性M1型极化;经IL?4 + IL?13刺激培养后呈特征性M2型极化;经L3和L5蛋白刺激培养后均呈特征性M2型极化。阴性对照组、LPS + IFN?γ刺激组、IL?4 + IL?13刺激组、L3蛋白刺激组、L5蛋白刺激组间M1型巨噬细胞比例差异有统计学意义（[χ2] = 3 721.00,P < 0.001）,其中LPS + IFN?γ刺激组M1型巨噬细胞比例最高;各组间M2型巨噬细胞比例差异有统计学意义（[χ2] = 105.43,P < 0.001）。各组间C?C基序趋化因子配体2（CCL2）、肿瘤坏死因子α（TNF?α）、IL?12b、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、IL?10、甘露糖受体C型1（Mrc1）基因mRNA表达水平差异均有统计学意义（F = 191.95、129.95、82.89、11.30、9.51、12.35,P均< 0.001）,各组间CD86、CD206阳性率差异均有统计学意义（[χ2] = 24 004.33、832.50,P均< 0.001）。LPS + IFN?γ刺激组IL?1β、TNF?α表达水平均显著高于IL?4 + IL?13刺激组、L3蛋白刺激组及L5蛋白刺激组（P均< 0.001）;IL?4 + IL?13刺激组、L3蛋白刺激组和L5蛋白刺激组TGF?β1、IL?10表达水平均显著高于阴性对照组和LPS + IFN?γ刺激组（P均< 0.05）。结论　巴西日圆线虫L3和L5虫体蛋白体外均可诱导THP?1来源巨噬细胞向M2型极化。     

PTEN对ox-LDL诱导的巨噬细胞炎性因子的影响及机制研究

目的:分析第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(PTEN)对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的巨噬细胞炎症因子影响及其作用机制。方法:将构建pc DNA3.1(+)-PTEN(r PTEN)重组表达载体及PTEN siRNA转染小鼠巨噬细胞系RAW 264.7,用制备的50 mg/L的ox-LDL孵育24 h,RT-PCR及Western blot分析PTEN的mRNA及蛋白表达水平;ELISA检测炎性因子TNF-α和IL-6的水平;同时Western blot分析对Toll样受体4(TLR4)及转录因子-κB(NF-κB)的影响及其作用机制。结果:PTEN过表达增高了ox-LDL诱导的TNF-α和IL-6的水平;PTEN沉默抑制了ox-LDL诱导的TNF-α和IL-6炎性因子水平。进一步分析表明,PTEN过表达加强了巨噬细胞中ox-LDL诱导的TLR4及其下游NF-κB通路的活化,而抑制其表达后,TLR4-NF-κB通路明显受到抑制;用TLR4特异性抗体预处理后,PTEN过表达诱导的TNF-α和IL-6的水平明显下降。进一步机制分析证实,磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)抑制剂LY294002(1μmol/L)预处理后,PTEN沉默抑制的TLR4-NF-κB通路的活性明显增加,且伴随有TNF-α和IL-6水平的上调。结论:PTEN有可能通过负向调节PI3K/AKT抗炎通路来影响TLR4-NF-κB炎性通路,进而参与巨噬细胞介导的炎症进程。因此,本研究将为心脑血管疾病的防治提供新的靶标。     

芪丹通脉片调节TLR4信号通路抑制巨噬细胞泡沫化的研究

目的 观察益气活血中药芪丹通脉片对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的RAW264.7细胞泡沫化进程、炎症指标及Toll样受体（TLR）4信号通路的影响。 方法 培养RAW264.7细胞，随机分为对照组、ox-LDL组及ox-LDL +芪丹通脉片（QDTM）组，各组细胞干预后进行泡沫化诱导，分析各组细胞油红染色阳性面积，计算各组细胞泡沫化诱导率，收集细胞，ELISA法检测炎性因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素（IL）-6、C反应蛋白（CRP）表达水平，Real-time PCR及Western blot分析TLR4、分子核因子（NF）-κB表达水平。 结果 与对照组相比，ox-LDL组细胞泡沫化诱导率、TNF-α、IL-6、CRP水平显著升高（P < 0.05），TLR4、NF-κB表达水平明显上调，QDTM干预后，ox-LDL+QDTM组细胞泡沫化诱导率及TNF-α、IL-6、CRP水平较ox-LDL组显著下调（P < 0.05），同时TLR4、NF-κB表达水平较ox-LDL组明显下降。 结论 QDTM能抑制TLR4信号通路及炎症反应、降低RAW264.7细胞泡沫化诱导率，抑制巨噬细胞泡沫化。