绿色荧光蛋白-小鼠纤维介素蛋白融合基因表达载体的构建和表达

目的：构建绿色荧光蛋白(GFP)和小鼠纤维介素蛋白(mfgl2)的融合蛋白表达载体，在仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，为mfgl2的RNA干扰体外研究提供简便的判断手段。方法：用PCR从mfgl2cDNA文库中扩增出mfgl2cDNA片段，插入到GFP表达载体pEGFP—N2中GFP基因序列的上游，构建成GFP—mfgl2融合基因表达载体pEGFP—mfgl2，将该载体转染到CHO细胞后24—48h，通过荧光显微镜观察并摄片。结果：扩增出长约1．3kb的基因片段，经双酶切鉴定和测序鉴定无误；重组载体转染CHO细胞后，在荧光显微镜下可观察到GFP的表达。结论：成功构建了pEGFP．mfgl2融合基因表达载体；重组载体可在CHO细胞中表达出GFP—mfgl2融合蛋白，为下一步进行mfgl2RNA干扰研究提供了简便的判断手段。     

SET-EGFP重组表达质粒的构建及表达

目的构建癌蛋白SET与增强型绿色荧光表达载体（EGFP）的融合表达质粒pEGFP—N2-SET并获得表达。方法根据人SET基因序列。设计了一对含有Kozak序列、终止密码子、HindⅢ和KpnI酶切位点的引物。从人L-02肝细胞提取总RNA，以逆转录后cDNA为模板，PCR扩增获得SET基因片段，经双酶切后回收得到有以上两个酶切位点的SET基因片段，将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pEGFP—N2载体中，获得重组质粒pEGFP—N2-SET。以Lipofectamine^TM2000为载体，将构建好的真核表达质粒转染到L-02肝细胞中进行瞬时表达。结果。经DNA测序鉴定证实，pEGFP—N2-SET重组质粒构建成功，经荧光倒置显微镜观察，证实能在细胞内进行蛋白表达。结论SET表达质粒的成功构建及表达为其进一步结构和功能研究奠定了基础。     

小鼠肿瘤坏死因子受体1基因的克隆及其与绿色荧光蛋白的融合表达

目的：构建小鼠肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）和绿色荧光蛋白（GFP）的融合基因真核表达质粒，然后在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达，为TNFR1的基因干预研究提供简便的判定手段。方法：从小鼠肝组织提取总RNA，RT-PCR扩增出TNFR1基因的cDNA片段，将目的片段克隆至pMD18-T载体。酶切和测序鉴定，然后将目的片段酶切回收后插到GFP表达载体pEGFP-N2中GFP基因序列的上游，构建TNFR1-EGFP融合基因真核表达载体pEGFP-TNFR1，将该重组质粒转染到CHO细胞后24—48h，用免疫组化技术检测TNFR1的表达情况。同时荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果：扩增出了长约1360bp的基因片段，并将其克隆至pMD18-T载体，酶切和测序鉴定无误；将pMD-TNFR1中TNFR1基因亚克隆至pEGFP-N2载体，酶切鉴定无误；重组质粒pEGFP-TNFR1转染CHO细胞后，免疫组化染色可见细胞有阳性棕染，同时荧光显微镜下也可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论：成功构建了小鼠TNFR1-EGFP融合基因真核表达质粒；重组质粒可在CHO细胞中表达出TNFR1-EGFP融合蛋白，为进一步的TNFR1基因干扰研究奠定了基础。     

重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体转染293细胞和CD34^＋细胞

目的研究重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染293细胞(人胚肾细胞)和人CD34^ 细胞后绿色荧光蛋白的表达情况。方法用CS-3000血细胞分离机分离骨髓单个核细胞，免疫磁性分离仪纯化CD34^ 细胞，重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体分别转染两种细胞，并通过荧光显微镜、流式细胞仪对绿色荧光蛋白的表达进行分析。结果荧光显微镜下两种细胞均可见绿色荧光蛋白表达，流式细胞仪于一定时间内检测293细胞的基因转导效率最高为32．8％，CD34^ 细胞的基因转导效率最高为25％．在所观察的时间内，转染率呈先升高后降低趋势。结论重组绿色荧光蛋白腺相关病毒载体能转染293和CD34^ 细胞，绿色荧光蛋白基因可作为良好的报告基因，为将来的干细胞基因治疗打下良好基础。     

bFGF基因体外转染兔骨髓间充质干细胞及对其增殖的影响

目的：观察bFGF基因体外转染兔骨髓间充质干细胞（bMSCs）后细胞目的基因的表达及对其增殖的影响。方法：将兔骨髓来源的间充质干细胞分离培养扩增,用PCR扩增法获得绿色荧光蛋白-bFGF基因重组质粒,转染间充质干细胞,用荧光显微镜观察转染后绿色荧光蛋白基因的表达,计算转染率,用MTT检测转染细胞的增殖特性。结果：实验成功地构建了绿色荧光蛋白-bFGF基因重组质粒,倒置荧光显微镜下观察到转染后的bMSCs发出稳定的绿色荧光信号,转染率为（43.32±4.51）%,MTT法显示重组质粒组增殖速度显著高于空白质粒组和未转染细胞组（P〈0.05）。结论：运用转染的方法实现了两种基因在MSCs中的共同表达,为监控MSCs细胞的转染和表达过程提供了一种手段。为后期利用MSCs细胞进行组织工程骨组织制造和移植提供了规范化的监控和程序化生产手段。     

结核分枝杆菌1hp-esat6融合基因原核表达载体的构建和表达

目的：构建结核分枝杆菌(MTb)1hp—esat6融合基因及其原核表达载体并进行表达。方法：用Gene SOEing法，将1hp基因和esat6基因体外重组，构建融合基因，克隆入pQE30质粒中进行表达。结果：构建的融合基因经测序证实完全正确，重组体转化表达菌DH5α后，经过IPTG诱导，表达出26kDa左右的CFP10-ESAT6融合蛋白。SDS—PAGE分析显示，IPTG诱导4h表达量最高，表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中，表达量占全菌蛋白质的40％，Western blotting证实其有良好的抗原性。表达蛋白经过Ni—NTA柱纯化后，获得了纯度为98%的重组蛋白。结论：成功构建MTb 1hp—esat6融合基因，成功构建原核表达载体pQE30-CFP10-ESAT6，并获得重组CFP10-ESAT6融合蛋白，为MTb重组抗原的应用奠定了基础。     

野生型DNA聚合酶β重组绿色荧光蛋白表达载体的构建

目的：构建携带野生型DNA聚合酶β基因(wtDNA polβ)的重组真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—C3——polβ。方法：运用PCR方法，从质粑pcDNA3．1-polβ中扩增出wtDNA polβ的开放阅读框序列，T-A克隆至pGEM—T载体，再定向克隆至pEGFP—C3，重组质粒pEGFP—C3—polβ用限制性内切酶酶切鉴定，通用鉴定引物PCR扩增鉴定，并进行DNA序列分析。结果与结论：多种鉴定方法让实了重组载体pEGFP—C3—polβ中的wtDNA polβ序列与GenBank中已知的序列相符。携带wtDNA polβ的重组增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP—C3—polβ构建成功。     

SP-TAT-Apoptin融合基因真核表达载体的构建和鉴定

目的：通过基因克隆构建表达SP—TAT—Apoptin融合基因的真核表达载体．方法：通过DNA重组技术，以pCD—NA3．1／Apoptin质粒为模板，进行PCR反应；将具有分泌功能的信号肽和能够携带核酸、蛋白和肽自由地通过细胞膜和核膜的蛋白转导域TAT序列连接于Apoptin基因5’端；PCR反应的产物连接于plenti6-V5-D—TOPO真核表达载体．用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组结果；将重组的真核表达载体瞬时转染HUVEC细胞，用免疫荧光标记对转染后的细胞进行处理，观察重组蛋白的表达情况．结果：PCR产物大小符合要求，重组质粒plenti6-V5-D—TOPO／SP-TAT-Ap—optin双酶切鉴定与预期一致，测序结果正确．且经激光共聚焦显微镜观察到重组蛋白的表达，表明重组表达载体已构建成功．结论：成功克隆出SP-TAT-Apoptin融合基因，并成功构建其真核细胞表达载体，为下一步研究SP-TAT-Apoptin融合基因对肿瘤的生长抑制作用的体内外研究奠定了基础．     

GFP为外源报告基因在地衣芽孢杆菌20386中表达的研究

目的 探讨外源基因在野生型地衣芽孢杆菌20386中表达的可行性。方法 利用大肠杆菌—枯草芽孢杆菌穿梭表达载体在大肠杆菌DF5α中构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组质粒，通过电转化将重组质粒转入到野生型地衣芽孢杆菌20386中表达，通过检测绿色荧光蛋白的存在，考察该野生型菌株表达外源基因的可能性和表达能力。结果 在紫外光激发下，在固体LB平板上生长的菌落能显示绿色荧光，而在液体LB培养基中培养的菌体和培养上清中未能检测到绿色荧光蛋白的存在。结论 外源基因在野生型地衣芽孢杆菌20386中能够表达，但在液体LB中培养时，可能会被该菌自身分泌的蛋白酶分解；亦可能被稀释而无法测到荧光，还需进一步研究。     

PCR产物靶向克隆法构建pET15b-CAT及His-tag-CAT融合蛋白的表达与纯化

目的:将人过氧化氢酶(Catalase,CAT)cDNA的PCR扩增产物定向克隆到pET15b载体上以构建重组质粒pET15b-CAT,并表达和纯化出His-tag-CAT融合蛋白。方法:扩增目的基因的PCR引物的5′端加上与线性化载体同源的碱基序列,以使PCR的扩增产物两端分别带上15个和线性化载体两端同源的碱基序列。以pZeoSV2(+)-CAT为模板进行靶向克隆所需的人CAT cDNA扩增。将纯化的人CAT cDNAPCR产物与经XhoⅠ和BamH Ⅰ酶切的线性化载体pET15b以6∶1摩尔数之比混合于含重组酶的反应液中,25℃反应30min,将PCR产物定向克隆于目标载体pET15b上,获得重组质粒pET15b-CAT。重组质粒经PCR,XhoⅠ酶切和DNA测序鉴定。pET15b-CAT转化BL21(DE3)宿主菌,用IPTG诱导表达出His-tag-CAT融合蛋白,采用Ni2+-NTA树脂进行亲和层析。结果:人CAT cDNA的PCR扩增产物与经XhoⅠ和BamHⅠ酶切的线性化载体pET15b发生了同源重组反应,经鉴定采用PCR产物靶向克隆法成功构建了pET15b-CAT。SDS-PAGE和Western blot结果表明,转化了pET15b-CAT的宿主菌表达出了His-tag-CAT融和蛋白,经Ni2+-NTA树脂亲和层析得到了纯化的His-tag-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶的活性,活性值为80.23U/g。结论:采用PCR产物靶向克隆法成功地构建了pET15b-CAT,并表达和纯化出了His-tag-CAT融和蛋白,为采用外源性CAT防治与氧化应激损伤相关性疾病奠定了基础。     

HPV16 E7蛋白编码基因原核表达与鉴定

目的研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其细胞转化机制，对HPV16E7蛋白原核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPV16感染患者子宫颈细胞DNA为模板，采用PCR方法扩增HPV16E7基因，经BamH Ⅰ和Hind Ⅱ双酶切后插入相同酶切pET32a（＋）载体，转化JM109感受态细胞，并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达，SDS—PAGE和Western blot检测目标蛋白表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32／E7，HPV16E7-TRX融合蛋白在BL21（DE3）菌株中高效表达，在1mmol／L IPTG、30℃诱导条件下融合蛋白表达量占菌体总蛋白的30％左右。结论pET32／E7原核表达质粒的构建、HPV16E7融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础。     

pET15b-EGFP原核表达载体的构建及其表达和纯化

目的:利用中间载体pGEM-T easy vector构建表达型载体pET15b-EGFP,在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白EGFP并将其纯化。方法:以质粒pLEGFP-C1为模板采用聚合酶链反应(PCR)的方法特异性扩增EGFP cD-NA序列,利用Taq DNA聚合酶的非模板依赖性末端转移酶活性催化PCR扩增的EGFP序列和三磷酸脱氧腺苷(dATP)反应,在EGFP序列两3’端加“A”,将纯化后的EGFP序列与中间载体pGEM-T easy vector连接后转化感受态大肠杆菌DH5α,经蓝白筛选,挑取白色单菌落进行扩增、酶切鉴定,正确重组的质粒命名为pGEM-T-EGFP。用XhoI和BamH I分别双酶切pGEM-T-EGFP和pET15b,低熔点琼脂糖回收EGFP cDNA和线性化的pET15b片段后将两片段相连,转化感受态大肠杆菌DH5α并对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序,获取正确重组的表达型质粒并命名为pET15b-EGFP。将正确重组的质粒pET15b?EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。利用表达蛋白N端的组氨酸“标签”(H is-tag)进行N i2+-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE和W estern b lotting鉴定纯化蛋白质。结果:经测序证实重组质粒pET15b-EGFP中的EGFP cDNA序列与从C lontech公司购买的质粒pLEGFP-C1中的EGFP cDNA序列完全一致,从而成功构建了表达型重组质粒pET15b-EGFP。pET15b-EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)并经诱导后得到高效表达,表达量可达66 mg/100 m l菌液,SDS-PAGE和W estern b lotting显示纯化蛋白为目的蛋白EGFP。结论:表达型重组质粒pET15b-EGFP的成功构建和表达、纯化为细胞穿透肽-EGFP融合蛋白穿透细胞能力的研究奠定了基础。     

刚地弓形虫肌动蛋白profilin的原核表达和纯化

目的：探讨刚地弓形虫肌动蛋白profilin （TgPRF）的原核表达体系和纯化条件,为后续的抗肿瘤免疫佐剂研究提供依据。方法：以弓形虫RH株速殖子的cDNA为模板,采用一对特定的引物扩增TgPRF基因的编码区。PCR产物双酶切后克隆入pET28a （+）载体中。重组的pET28a （+）-TgPRF质粒转化E.coli DH5α感受态细胞。双酶切鉴定阳性克隆,并选取测序正确的质粒转化E.coli BL21（DE3）表达菌,经IPTG诱导表达4 h,SDS-PAGE法检测TgPRF蛋白的表达,Western blotting法检测重组蛋白His-prolilin的表达。结果：PCR扩增产物长度为492 bp。经双酶切和测序,重组质粒pET28a-TgPRF连接产物构建成功。SDS-PAGE检测,目的蛋白在超声菌液的上清中表达。经Ni-NTA琼脂糖凝胶柱纯化,获得纯化的TgPRF蛋白（纯度>90%）。Western blotting检测,重组TgPRF蛋白能被Anti-His抗体识别。结论：成功构建重组质粒pET28a-TgPRF,并实现可溶性原核表达。     

Prokaryotic expression of Chinese bovine enterokinase catalytic subunit

Background To express in vitro the bovine enterokinase catalytic subunit (EKL) protein, which could be used in the future for the cleavage and purification of fusion proteins.Methods Bovine enterokinase catalytic subunit cDNA was obtained by RT-PCR from the duodenal mucosa of a bovine obtained at a wholesale market, and then cloned into a pUCmT cloning vector and sequenced. The desired gene fragment was inserted into a pET39b expression plasmid and the recombinant vector pET39b-EKL was transformed into E. coli BL21 (DE3). Protein expression was induced using IPTG. The recombinant DsbA-EKL was purified with His·Tag affinity chromatography, and its bioactivity was analyzed.Results Compared with the sequence deposited in GenBank, the sequence of the EKL gene cloned in the present study is correct. It was also confirmed that the nucleotide sequence of expression plasmid pET39b-EKL was correct at the conjunction site between the recombinant DNA 5’terminal multi-cloning site and the recombinant fragment. SDS-PAGE analysis indicated that the target product was about 65 kDa and represented 28% of total cell protein. Purified recombinant protein was obtained by metal chelating chromatography using a Ni-IDA resin. After desalting and changing the buffer, the crude kinase was incubated at 21℃ overnight and shown to have a high autocatalytic cleavage activity.Conclusion The EKL gene from a Chinese bovine has been cloned successfully and expressed. This investigation has layed the foundation for future enterokinase activity research and for further large-scale application of expression products.     

梅毒螺旋体重复蛋白K的克隆表达

目的体外克隆并表达梅毒螺旋体重复蛋白K，为制备预防性疫苗奠定基础。方法利用PCR反应及基因重组技术，扩增重复蛋白K编码基因，构建重组质粒pET28b（＋）／TprK，IPTG诱导表达。结果PCR法扩增出了1350bp的目的片段，原核表达质粒pET28b（＋）／TprK酶切鉴定正确，测序结果与Gengbank上公布的该基因序列完全一致，并可在大肠杆菌中高效表达。结论成功构建人pET28b（＋）／TprK原核表达载体，并能高效表达TprK蛋白，为梅毒的预防性疫苗的制备以及进一步研究其血清学诊断试剂奠定了基础。     

人胰岛素样生长因子前体基因的重组、表达及其蛋白纯化

目的：构建含有人胰岛素样生长因子（human insulin-like growth factor-1，hIGF-1）前体编码全长cDNA的重组载体，使其在E-coli BL21（DE3）中表达，并对此表达菌株所表达的重组蛋白进行纯化，同时探讨其抗原性及应用价值。方法：采用PCR法，扩增编码hIGF-1前体cDNA的片段，通过双酶切、胶回收纯化、连接后得到pET32a（＋）／hIGF-1重组载体，然后将其转化入BL21（DE3）中，经IPrG诱导后表达的重组蛋白经镍柱亲和层析纯化，并用Western blot法检测重组蛋白的抗原活性。结果：重组质粒pET32a（＋）／hIGF-1经双酶切鉴定和测序分析后证实构建成功。BL21（DE3）表达的重组蛋白经SDS-PAGE电泳后显示．其表达量占细菌总蛋白量的25％左右．该重组蛋白经镍柱亲和层析纯化后其纯度高达90％以上。Western blot结果显示非常清晰的免疫印迹条带，表明此重组蛋白具有免疫学特异性。结论：pET32a（＋）／hIGF-1重组载体构建成功，并能够高效表达。     

结核分枝杆菌耐药性相关膜蛋白MmpL6的表达与纯化

目的 构建结核分枝杆菌外排泵蛋白MmpL6(Rv1557)表达载体,在大肠杆菌E. coli中诱导MmpL6蛋白高表达并进行纯化.方法 以结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组DNA为模板,采用聚合酶链反应扩增目的基因片段,构建pET21b-MmpL6表达载体将表达载体转化至大肠杆菌中,加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,并针对不同表达菌株、温度进行优化,获取最优表达条件.采用Ni-NTA亲和层析以及凝胶过滤色谱纯化目标蛋白.结果 成功构建pET21b-MmpL6重组表达质粒,经 IPTG诱导后,在Rosetta菌株中25 ℃条件下获得最高表达量.结论 成功表达并纯化了 MmpL6蛋白,为该蛋白后续的结构与功能研究奠定了基础.     

PTD-Cyclin D1融合蛋白的原核表达及纯化

目的:构建融合重组表达载体并对其进行诱导表达和蛋白纯化以获得大量重组融合蛋白.方法:通过PCR方法扩增出Cyclin D1基因,克隆入pMD-18T载体,进行测序分析,将该基因亚克隆入原核表达载体pET-16b中PTD的下游构建重组质粒pET16b-PTD-CCND1,转化感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析.结果:构建了重组融合表达质粒pET16b-PTD-CCND1,表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析,在约Mr 38×103处出现了一条新生的蛋白条带,经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的22%,纯化后得到了目的蛋白.结论:成功地克隆了小鼠的Cyclin D1基因并纯化了融合基因PTD- CCND1的原核表达产物.     

可溶性重组人IL23R-CHR在大肠埃希菌中的表达、纯化及活性研究

利用人白细胞cDNA文库体外扩增获得hIL23R-CHR目的基因,克隆至原核表达载体pET22b/pET28a/pET32a,转化BL21(DE3)宿主菌,并对工程菌的表达方式(直接表达、可溶性标签融合表达、分泌表达及包涵体表达)及表达量进行比较,确立pET 32a为表达载体,经IPTG诱导表达后通过镍亲和柱分离纯化融合蛋白Trx-IL23R-CHR,肠激酶4 ℃酶切Trx-IL23R-CHR分子24 h,上镍柱进行二次纯化,获得纯度达90%以上的rhIL23R-CHR分子。亲和力实验证实:原核重组表达的hIL23R-CHR与hIL23在物质的量比为1∶1时可以有效结合,小脑HE病理切片提示rhIL23R-CHR分子对实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)模型鼠有一定的保护作用。