B型链球菌数量感应通路测定及LuxS缺失突变株的构建

目的对GBS中可能存在的AI-2数量感应通路进行测定，构建数量感应相关分子LuxS缺失突变株并对其基因型进行确认。方法培养GBS至不同D（λ）值．利用V．harveyi BB170作为报告菌株，对GBS诱导生物发光的能力进行测定，然后寻找GBS中LuxS同源基岗，通过同源重组法在GBS中构建LuxS缺失突变株，Southern杂交分析确证。结果GBS中的某种分泌成份可在报告菌株中诱导生物发光活性，提示GBS中存在AI-2数量感应通路，在GBS中发现了LuxS同源基因并成功地构建了LuxS缺失突变株。结论本研究为探索LuxS在GBS中AI-2数量感应通路中的重要性及GBS毒力研究建立了细菌模型     

B型链球菌数量感应通路测定及LuxS缺失突变株的构建

目的 对GBS中可能存在的AI-2数量感应通路进行测定,构建数量感应相关分子LuxS缺失突变株并对其基因型进行确认。方法 培养GBS至不同D(λ)值,利用V.harveyi BB170作为报告菌株,对GBS诱导生物发光的能力进行测定,然后寻找GBS中LuxS同源基因,通过同源重组法在GBS中构建LuxS缺失突变株,Southern杂交分析确证。结果 GBS中的某种分泌成份可在报告菌株中诱导生物发光活性,提示GBS中存在AI-2数量感应通路,在GBS中发现了LuxS同源基因并成功地构建了LuxS缺失突变株。结论 本研究为探索LuxS在GBS中AI-2数量感应通路中的重要性及GBS毒力研究建立了细菌模型。     

PhoB缺失突变株的构建及其性状的初步研究

目的为探索B族链球菌（group B streptococcus，GBS）的毒力全局性调控机制，对GBS中的双组分信号传导调控系统PhoR—PhoB的成分之一PhoB的功能进行了初步研究。方法首先应用计算机软件对GBS基因组进行分析，寻找PhoB同源基因，接着通过同源交换法在GBSⅠa515和V2603菌株中构建PhoB缺失突变株，并通过Southem杂交分析对其基因型进行了确证，通过RT—PCR法、菌落印迹分析、生长曲线测定等方法对其表型特性进行了初步研究。结果在GBS中发现了PhoB同源基因并成功地在GBSⅠa515和V2603菌株中构建了PhoB缺失突变株ΔPhoB，对其基因型、表型特性及功能的初步研究结果表明此突变株为非极性缺失突变株，其缺失突变不影响其下游基因的表达；此缺失突变不影响GBS在THY及CDM培养基中生长速度的改变。结论在GBS中构建并确证了非极性PhoB基因缺失突变株，为GBS中毒力全局性调控机制的进一步研究提供了有利的工具。     

LuxS基因缺失对变形链球菌蛋白表达的影响

目的通过双向电泳技术对比研究变形链球菌标准株与LuxS突变株菌体总蛋白质的表达差异,为进一步研究LuxS信号系统对变形链球菌致龋毒力的调控机制奠定基础。方法提取变形链球菌标准株及LuxS突变株的菌体总蛋白质,采用双向电泳技术对比研究两者蛋白质的表达差异,找出差异蛋白点。结果与标准株菌体总蛋白2-DE图谱相比较,LuxS突变株菌体总蛋白2-DE图谱中有61个斑点的蛋白质表达量发生了改变:36个点蛋白质表达量升高,25个点蛋白质表达量降低。结论变形链球菌标准株与LuxS突变株菌体总蛋白存在明显的差异,表现为2-DE图谱蛋白斑点染色的深浅不同,提示LuxS突变株菌体总蛋白发生了量的变化。     

肺炎链球菌comX基因可影响细菌毒力基因表达

目的:探讨肺炎链球菌的转化相关基因comX与其毒力表达的关系.方法:采用插入失活的方法制备肺炎链球菌的相关基因缺陷菌株,通过小鼠毒力实验观察它们毒力的变化,并应用RT-PCR测定肺炎链球菌的主要毒力因子透明质酸酶(phd),分泌型IgA结合蛋白(sIgA),肺炎链球菌自溶酶(lytA),肺炎链球菌神经氨酸酶A (nanA)和肺炎链球菌溶血素(ply)在细菌感受态发生过程中的表达,并比较其在野生和缺陷菌株中的表达的异同.结果:野生菌株的毒力基因受感受态刺激因子(CSP)诱导表达增加;虽comX基因缺陷菌株与野生菌株感染小鼠的能力无显著差异,但其ply基因的表达与comE基因缺陷菌株一样显著低于野生菌株的表达.结论:comX可通过细菌转化的通路影响细菌毒力基因的表达.     

变形链球菌LuxS基因缺失株对生物膜结构影响的研究

目的研究变形链球菌标准株和LuxS基因缺失菌株变形链球菌在离体模型上生物膜形成的差异变化情况。方法收集临床上因正畸而拔除的前磨牙或无龋坏的第三磨牙,行菌株复苏增菌及变形链球菌鉴定,最后将标本置于扫描电镜下观察。结果变形链球菌标准菌株和LuxS基因缺失菌株在24 h形成的生物膜有明显差异,经观察发现LuxS基因缺失菌株较标准菌稀疏。结论口腔变形链球菌可通过LuxS基因介导的菌种密度感应信号来影响口腔生物膜的形成。     

变异链球菌LuxS基因突变株生物被膜结构的电镜观察

目的：探讨变异链球菌Ingbritt C（血清C型）国际标准株与LuxS基因缺失的变异链球菌突变株之间生物被膜的形成差异。方法：分别将变异链球菌标准株和LuxS基因突变株接种于含有2％葡萄糖、2％蔗糖的乳酪消化胨酵母（TPY）液体培养基中,以牙釉质磨片为载体,于扫描电镜下观察形成24h的上述两菌株生物被膜。结果：（1）当以葡萄糖作为补充糖源时,变异链球菌标准株和LuxS基因突变株所形成的生物被膜表现型未见明显差异;（2）当以蔗糖作为补充糖源时。两菌株所形成的生物被膜有明显的不同,标准株生物被膜相对平滑均质,而LuxS基因突变株的生物被膜呈松散的蜂房状,基质间有较大的间隙,形成较大的团簇状菌落;（3）加入标准株的无菌体上清液可以使LarxS基因突变株的生物被膜表型部分恢复正常,提高LuxS基因突变株形成生物被膜的能力。结论：变异链球菌标准株和LuxS基因突变株均能形成生物被膜．但LuxS基因突变株的生物被膜结构发生改变;依赖于LuxS的群体感应系统会影响变异链球菌生物被膜的形成。     

LuxS/AI-2密度感应信号及其在口腔致病菌感染中的作用

密度感应是细菌之间通过分泌和感应胞外信号分子而进行的交流活动,密度感应使细菌同时激活相关基因的表达,协调菌群生物学行为。目前认为AI-2在细菌种间交流中起通用信号分子的作用。LuxS/AI-2参与口腔细菌间的交流,并参与调控毒力因子表达和牙菌斑生物膜的稳定。     

插入序列IS861和IS1548与B族链球菌的表型及分型关系的研究

目的观察基因组插入序列IS861、IS1548在B族链球菌(GBS)基因组中的出现规律,探讨其与细菌表型如毒力、耐药性、血清分型的关系,评价插入序列用于细菌分子生物学分型的价值。方法采用PCR-RFLP(限制性片段长度多态性分析)、核酸探针和Southern杂交等技术对采自北京、广州和圣彼得堡的113株GBS菌进行基因组插入序列研究。结果在113株GBS中,有67株(59.3%)和13株(11.5%)分别含IS861和IS1548,不同城市GBS菌株的插入序列阳性率无统计学差异;含IS1548的13株GBS都同时含IS861,全部属于血清Ⅲ型,且此类菌株含相对较多的插入序列拷贝。含插入序列的GBS菌株普遍具有较高的红霉素耐药性。67株菌IS861阳性菌株共产生9种H indⅢ的RFLP分型,不同分型的拷贝数为1-9个。13株IS1548阳性GBS中,共产生6种EcoRⅠ的RFLP杂交类型,拷贝数为8~9个。结论插入序列在GBS基因组中插入的现象比较普遍,血清Ⅲ型GBS的特殊生物特性与IS861和IS1548插入密切相关,大部分血清Ⅲ型GBS可能来自同一个毒力克隆,对携带此型菌株的产妇或新生儿应引起临床重视;IS861和IS1548可能通过影响耐药基因的表达调控GBS对红霉素的敏感性;血清分型与插入序列的RFLP分型相结合能显著提高GBS菌株的分型率,可作为一种重要的方法用于GBS的流行病学研究。     

转座因子Tn917随机诱变变形链球菌UA159

目的 :诱导转座因子Tn917随机插入变形链球菌UA15 9染色体 ,产生在不同位点突变的突变株库。方法 :用含转座因子Tn917的质粒pTV1 OK转化变形链球菌UA15 9,诱导转座因子发生转座后 ,产生大量的突变株。随机挑选 6株突变株 ,提取基因组DNA ,EcoRⅠ酶切 ,以质粒pTV1 OK的 4 .3kbKpnⅠ片段 (含Tn917部分序列 )为探针 ,做Southern杂交 ,以野生株为对照。结果 :野生株无杂交带 ,突变株均有且只有一条杂交带 ,且杂交带的位置不尽相同。结论 :转座因子Tn917可以单拷贝随机诱变变形链球菌野生株 ,产生在不同位点突变的突变株 ,是从基因水平研究变形链球菌的有效手段。     

LuxS/AI-2对伤寒沙门菌基因表达的调节

目的:探讨伤寒沙门菌luxS基因在葡萄糖存在下对细菌对数生长中期基因表达调控的影响.方法:应用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌luxS基因缺陷变异株;比较野生株与缺陷株的生长情况及动力差异;用哈氏弧菌BB170作为报告菌株检测不同时期野生株与缺陷株的生物发光;利用伤寒沙门菌全基因组芯片技术,比较在葡萄糖存在下伤...     

新生儿隐球菌白化突变化分子机制的初步研究

目的：研究新生儿隐球菌白化突变分子机制,方法：采用聚合酶链反应（PCR）技术对新生隐球菌产黑素株与白化突变株进行比较研究,并进行PCR产物的克隆,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌。结果：发现白化突变株酚氧化酶结构基因（CNLAC1）在1715－2617bp之间大片段缺失（约450bp),而产黑色素株却无此缺失片菌病的预后和基因治疗提供可能的靶基因。     

海分枝杆菌ppk基因的生物学功能研究

 目的 构建海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)ppk基因敲除株,对其生物学功能进行研究。方法 利用基因同源重组技术,构建了海分枝杆菌ppk基因敲除株;使用DAPI染色法检测细菌胞内多聚无机磷酸盐(poly inorganic phosphate, poly-Pi)浓度;比较野生株及突变株在不同环境压力下的生存能力;用野生株和突变株分别感染斑马鱼成鱼,通过观察斑马鱼的存活情况,研究ppk基因对海分枝杆菌毒力的影响。将野生株和突变株分别感染小鼠来源的巨噬细胞系RAW267.4,检测其在巨噬细胞内的增殖。结果 ppk突变株胞内poly-Pi浓度明显下降;在斑马鱼成鱼感染模型中出现显著减毒表型;其在小鼠来源的巨噬细胞感染模型中的增殖较野生型菌株明显减弱;在营养缺陷、抗生素(利福平、左氧氟沙星)等环境压力下,其生存能力下降。结论 ppk基因影响分枝杆菌在环境压力下的生存,并且在其致病中发挥重要作用。     

HtrA基因缺陷对肺炎链球菌毒力影响的研究

目的:HtrA基因可编码肺炎链球菌的一种重要蛋白酶,本文目的是探索HtrA基因缺陷对细菌毒力的影响. 方法:用插入复制失活的方式使HtrA基因缺失,通过RT-PCR分析毒力因子表达,并通过动物试验观察HtrA基因缺陷株毒力改变情况. 结果:RT-PCR显示HtrA缺陷株毒力因子表达低于野毒株,两组比较P＜0.05;转化试验发现缺陷菌株转化力下降;小鼠毒力试验表明野毒株半数致死时间22 h,而缺陷株半数致死时间8 d,P＜0.01,有显著性差异;缺陷菌在小鼠体内被清除速度也显著快于野毒株. 结论:HtrA基因缺陷使肺炎链球菌多种毒力因子表达减弱,自然转化能力下降,毒力降低.     

luxS基因敲除临床分离大肠杆菌株生物膜形成能力的变化

目的探讨LuxS基因对临床分离大肠杆菌生物膜形成能力的影响。方法以临床分离大肠杆菌S17为研究对象,PCR分别扩增S17 LuxS基因的上下游序列和质粒pEGFP-N1的卡那抗性基因,分别连入T载体pAT2,再通过酶切连接的方法分别将LuxS基因的上、下游序列连接入pAT2-kana质粒,构建同源重组质粒pAT2-△luxS,同源重组质粒转化大肠杆菌DH5α扩增后,提取质粒后双酶切获得同源重组片段,将同源重组片断电转入感受态S17,通过同源重组构建LuxS基因缺失的S17,96孔板结晶紫染色法分析LuxS基因缺失株生物膜形成能力的变化。结果 LuxS基因缺失株基因组PCR扩增出1678的片断,测序鉴定正确,成功构建临床分离大肠杆菌S17 LuxS基因缺失株,S17与S17LuxS基因缺失株形成生物膜的微孔板法半定量OD值的结果分别为(1.51±0.09)和(0.43±0.13)。结论 LuxS基因对细菌生物膜的形成具有重要调控作用。     

OsmY缺失对伤寒沙门菌在高渗应激早期基因表达的影响

目的:研究伤寒沙门菌OsmY在高渗应激早期对其他基因表达的调节。方法:通过同源重组的方法利用自杀质粒制备伤寒沙门菌osmY基因缺陷变异株;采用伤寒沙门菌全基因组芯片比较野生株和osmY基因缺陷变异株在高渗应激早期的基因表达差异,并对其中部分表达差异基因进行实时定量PCR验证。结果:成功制备伤寒沙门菌osmY基因缺陷变异株;基因芯片结果显示,在高渗应激早期,与野生株相比,伤寒沙门菌osmY基因缺陷变异株有128个基因表达下调,有27个基因表达上调。实时定量PCR与芯片结果一致。结论:OsmY可作为一调节因子在伤寒沙门菌高渗应激早期对基因表达起重要调节作用。     

小RNA SbfR增强伤寒沙门菌动力和侵袭力

目的: 探究小RNA SbfR对伤寒沙门菌动力和侵袭力的影响及其潜在机制。方法: 用前期构建的SbfR缺陷株（△SbfR+pBAD/Myc HisA）、SbfR回补株（△SbfR＋pBAD/Myc HisA SbfR）和空载体株（WT+pBAD/Myc HisA）进行细菌动力实验和HeLa细胞侵袭实验,观察SbfR对伤寒沙门菌的动力和对HeLa细胞侵袭力的影响。通过基因芯片分析SbfR缺陷株与回补株全基因组表达的差异,并进一步用qRT PCR分析SbfR对2个鞭毛和2个侵袭相关基因的调控作用。结果： 与空载体株、SbfR回补株比较,SbfR缺陷株动力和侵袭力均明显下降（P＜0.01或0.05）;缺陷株鞭毛和侵袭相关基因的转录表达水平均比回补株明显下降（均P＜0.05）。 结论： SbfR通过促进鞭毛和侵袭相关基因的表达,增强伤寒沙门菌的动力和侵袭力。     

伤寒沙门菌fljA样基因缺陷变异株的制备

目的：为探讨z66鞭毛抗原阳性伤寒沙门菌的fljA样基因的功能,制备沙门菌fljA样基因缺陷变异株。方法：根据伤寒沙门菌fljA样基因序列,设计PCR特异性引物并在5末端加接酶BglII位点,扩增fljA样基因上、下游片段,用BglII消化后,定向连接成fljA样基因的缺损性同源性核苷酸片段,先克隆至pGEM—T质粒,再经BnmHI酶切后导入自杀质粒pGMB151,电转化入伤寒沙门菌(GIFU 10007),进行同源重组。用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为fljA样基因的缺陷变异株,并通过相应的核苷酸序列分析加以确定。结果：PCR及序列分析证实,缺陷变异株的fljA样基因缺失231个碱基。结论：成功构建伤寒沙门菌flja样基因缺陷变异株,为进一步研究其在伤寒沙门菌鞭毛抗原表达的调控作用奠定了基础。