仿生复合人工骨材料的组织工程细胞相容性研究

目的　探讨组织工程化人工骨的仿生构建模式及具有不同细胞相容性支架材料的选择。方法　分别采用人工合成材料生物活性玻璃陶瓷 (BGC)与双相羟基磷灰石 (HA/β TCP)为支架材料 ,与聚 DL 乳酸 (PDLLA)复合后 (重量比分别为 65∶1及 50∶1 )再复合I型胶原及重组合人类骨形态发生蛋白 (rhBMP 2 ) ,与兔骨膜成骨细胞 (密度 1× 1 0 6 /ml)复合培养 ,进行一般与超微形态学观察 ,测定生长曲线及成骨细胞碱性磷酸酶 (ALP)、骨钙素和I型胶原合成量的测定 ,比较细胞粘附能力、增殖活力及成骨活性。结果　生物活性玻璃陶瓷、双相羟基磷灰石分别与成骨细胞复合后的粘附能力、增殖活力 (1d组 :0 .380± 0 .0 32 ,0 .2 50± 0 .0 1 9;7d组 :0 .950± 0 .0 60 ,0 .650±0 .0 4 0 )、成骨活性 (3H 脯氨酸掺入活性 :6 .2 2 8± 1 .785 ,3 .81 8± 0 .858;骨钙素含量 :0 .70 9± 0 .1 1 5 ,0 .386± 0 .0 93 ;碱性磷酸酶 :0 .1 2 3± 0 .0 32 ,0 .0 83± 0 .0 1 8) ,前者均优越于后者。结论　该种仿生组织工程化人工骨的构建模式能较满意模拟天然骨优势 ,生物活性玻璃陶瓷、双相羟基磷灰石两种材料的共混体 ,有可能成为骨组织工程较理想的支架材料     

人类骨肉瘤细胞血管形成因子的研究

目的　研究部分纯化骨肉瘤血管形成因子并探讨其生物学特性。方法　通过对培养中收集的大量条件培养基进行超滤、层析、透析等截留相对分子质量 8～ 10ku的蛋白质纯化 ,获取 19个层析柱。以人类脐静脉和猪主动脉内皮细胞增殖反应为实验对象 ,用作检验条件培养基和层析产物的生物学活性。结果　条件培养基能显著促进人类内皮细胞和猪主动脉内皮细胞的增殖分别为(336 .91± 49.12 ) /min和 (190 8.33± 2 2 8.38) /min ,层析中的 4～ 6柱 (A值分别为 0 .732± 0 .10 4、0 .80 8± 0 .113、0 .791± 0 .0 91) ,具有显著的促进内皮细胞增殖的生物学效应。结论　人类骨肉瘤细胞能够合成并分泌血管形成因子 ,其相对分子质量在 8～ 10ku之间。     

猪急性创面不同部位组织匀浆液对体外培养的成纤维细胞凋亡的影响及其机制

目的　探讨猪急性创面不同部位组织匀浆液对体外培养的成纤维细胞 (fibroblast,FB)凋亡的影响。　方法　在 6只小型猪的背部造成直径 4 cm的圆形全层皮肤缺损创面 ,用取下的真皮组织进行 FB原代培养。在创面形成后第 15天 ,取创面中心及边缘新生上皮下的组织匀浆 ,离心后将上清液 - 70℃冰箱保存备用。用第 4代 FB进行实验 ,根据培养液的不同分成 7组 : 组 :DMEM+5 %胎牛血清 ; 组 :DMEM+5 %创面中心组织匀浆液 ; 组 :DMEM+5 %创面边缘组织匀浆液 ; 组 :DMEM+5 %创面中心组织匀浆液 +10μg/ ml广谱基质金属蛋白酶抑制剂 (GM6 0 0 1) ; 组 :DMEM+5 %创面边缘组织匀浆液 +10μg/ ml GM6 0 0 1; 组 :DMEM+5 %创面中心组织匀浆液 +10 ng/ ml酸性成纤维细胞生长因子 (acid fibroblast growth factor,a FGF) ; 组 :DMEM+5 %创面边缘组织匀浆液 +10 ng/ ml a FGF。在上述培养液中培养 16 h,均采用同一动物的匀浆液处理该动物来源的 FB(n=6 )。采用 PI和标记 FITC的 Annexin 作为探针 ,利用流式细胞仪检测细胞凋亡。　结果　各组细胞凋亡率分别为 : 组 4 .39%± 0 .4 1% , 组 10 .98%±1.4 2 % , 组 13.4 7%± 1.4 4 % , 组 7.2 %± 0 .4 6 % , 组 12 .1%± 0 .85 % , 组 3.9%± 0 .6 3% , 组 9.8%± 0 .5 0 % ;     

抑肽酶对肿瘤坏死因子-α活化人脐静脉内皮细胞的作用

目的探讨抑肽酶对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)活化人脐静脉内皮细胞的作用。方法采用Ficoll液提取高纯度的健康成人中性粒细胞(PMN)。体外培养的人脐静脉内皮细胞随机分为3 组,对照组(C组):给予等量培养液;TNF-α活化组(T组):给予TNF-α 2 ng/ml,作用时间5 h;抑肽酶 TNF-α组(A T组):给予抑肽酶250 KIU／ml,作用时间6 h,1 h后给予TNF-α2 ng/ml,作用时间5 h。用细胞培养小室测定PMN跨迁单层融合的人脐静脉内皮细胞的迁移率,采用免疫细胞化学法测定人脐静脉内皮细胞细胞间黏附分子-1(ICAM-1)以及细胞连接蛋白β-链蛋白的表达。结果与C组比较, T A T组ICAM-1表达和PMN迁移率增加,β-链蛋白表达下降(P<0．05);与T组比较,A T组 ICAM-1表达和PMN迁移率降低,β-链蛋白表达增多(P<0．05)。结论抑肽酶可抑制TNF-α对人脐静脉内皮细胞的活化。     

一氧化氮对肿瘤坏死因子诱导血管内皮细胞与白细胞粘附的实验研究

肿瘤坏死因子(TNF)诱导的血管内皮细胞与白细胞的粘附以及一氧化氮(NO)对此粘附过程的影响,报告如下。材料与方法材料　(1)白细胞提取:用Ficoll分离液获取人外周血白细胞,培养基DMEM(含10?S)悬浮配成浓度为105个/ml;(2)血管内皮细胞培养:24孔培养板(每孔104个细胞悬液)培养人脐静脉内皮细胞ECV-304。待细胞生长至对数增长期,分组实验;(3)ECV-304人脐静脉内皮细胞(武汉大学动植物保藏中心提供)。鼠抗人ICAM-1单克隆抗体以及SABC-FITC试剂盒购于北京中山公司。SNAP、TNF系sigma公司产品。方法　实验分组:分5组以观察内皮细…     

冠状动脉旁路移植术瞬时测血流量技术的临床应用

目的　总结瞬时测血流量 (TTFM)技术在冠状动脉旁路移植术 (CABG)中的应用经验 ,探讨异常血管桥瞬时血流量技术参数特点、发生原因及处理方法。方法　 2 0 0 1年 9月至 2 0 0 2年 5月 ,连续对5 0例不停跳冠状动脉旁路移植及 40例常规体外循环下旁路移植者进行血管桥血流量测定 ,随机 30例进行左侧乳内动脉 (LIMA)血流量测定。结果　 30例LIMA离断后TTFM参数 :平均血流 (42 9± 33 0 )ml min ,弹力指数 (PI)值 1 0 0± 0 6 4,波形曲线为收缩期、舒张期双向血流 ,收缩期为主 ,实际平均血流为(37 4± 2 8 8)ml min ,相关系数为 0 98。 90例冠状动脉旁路移植TTFM参数 :LIMA到左前降支 (LAD)平均流量 (2 9 9± 9 5 )ml min ,平均PI值 2 47± 0 88。大隐静脉或桡动脉到回旋支系统平均流量 (33 7±17 5 )ml min ,PI值 4 0± 1 9;到右冠状动脉系统 ,平均流量 (31 5± 19 2 )ml min ,PI值 2 6± 1 3 ;到前降支及回旋支系统为双向血流 ,血流以舒张期为主 ,收缩期可形成负值 ;到右冠状动脉系统 ,收缩及舒张期为双向灌注 ,较少出现负值。TTFM技术提示 ,2 87支血管桥中有质量问题血管桥 6支 ,均手术证实并加以矫正。 90例病人均无围术期心肌梗死及其它严重并发症 ,无死亡。随访 2～ 10个月 ,病人无心绞痛及心肌     

瘦素对体外大鼠成纤维细胞增殖与胶原合成的影响

目的　研究瘦素对体外培养大鼠成纤维细胞 (fibroblast,FB)增殖与胶原合成的影响 ,以阐明 FB介导瘦素在大鼠皮肤创伤愈合中的促进作用。　方法　体外培养乳鼠真皮 FB,通过 MTT比色分析法、3H-胸腺嘧啶核苷(3H- Td R)和 3H-脯氨酸 (3H- Pro)掺入法观察不同浓度的瘦素 ,分别为 0、10、5 0、10 0、2 0 0及 4 0 0 ng/ ml对其增殖和胶原合成的影响。　结果　瘦素剂量在 4 0 0 ng/ ml以下时 ,随瘦素剂量增加明显增加了体外培养大鼠 FB MTT的光密度值和 3H- Td R的掺入量。3H- Pro的掺入量随瘦素剂量增加基本呈增大趋势。 2 0 0、4 0 0 ng/ ml剂量组的3H- Td R掺入量 379±10 1cpm、32 6± 33cpm,与对照组 2 19± 5 6 cpm比较有统计学差异 (P<0 .0 5 ) ;且 2 0 0、4 0 0 ng/ ml剂量组的 MTT吸光度(A)值 0 .0 82± 0 .0 13、0 .0 91± 0 .0 18与对照组 0 .0 6 3± 0 .0 10比较有统计学差异 (P<0 .0 5 ) ;2 0 0、4 0 0 ng/ ml剂量组的 3H- Pro掺入量 911± 5 5 cpm、10 72± 2 5 9cpm,与对照组 6 79± 176 cpm比较有统计学差异 (P<0 .0 5 )。　结论　瘦素促进了 FB的增殖和胶原蛋白的合成 ,这可能是瘦素发挥促进大鼠皮肤愈合作用的途径之一。     

高浓度二氧化碳预处理对人脐静脉内皮细胞缺氧复氧损伤的影响

目的 探讨高浓度二氧化碳(CO2)预处理对人脐静脉内皮细胞缺氧复氧损伤的影响.方法 人脐静脉内皮细胞接种于细胞培养板,随机分为6组,每组16孔,对照组(C组)常规培养;缺氧复氧组(MR组)缺氧4 h、复氧24 h;缺氧预处理组(APC组)缺氧10 min、复氧10 min,重复2次后缺氧4 h、复氧24 h;HCA.组、HCA2组和HCA3组分别于50%N-20%02-30%CO2培养箱中行30%CO2预处理10、30、60 min后常规培养10、20、30 min,缺氧4 h、复氧24 h.于复氧24 h时采用MTY法测定人脐静脉内皮细胞活力,采用免疫细胞化学法测定细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达水平.结果 与C组比较,MR组、APC组、HCA1～3组人脐静脉内皮细胞活力降低,ICAM-1表达上调(P＜0.05);与A/R组比较,APC组和HCA2组人脐静脉内皮细胞活力升高,APC组及HCA1,2组ICAM-1表达下调(P＜0.05).结论 高浓度CO2预处理可减轻人脐静脉内皮细胞缺氧复氧损伤.     

烧伤血清对内皮细胞核因子-κB核移位的影响

目的　了解烧伤血清对内皮细胞核因子 κB (NF κB)异二聚体 p5 0 /p6 5核移位 ,以及核抑制因子κB(IκB)α降解的影响 ,进一步探讨烧伤血清对内皮细胞的活化作用。方法　采用体外培养的人脐静脉内皮细胞株ECV 30 4 ,分别用正常人血清、烧伤患者血清、烧伤患者血清 吡咯烷二硫代氨基甲酸盐 (PDTC)刺激内皮细胞 ,并以正常培养的内皮细胞为对照。应用激光共聚焦显微镜观察刺激 30、6 0、12 0、4 80min后内皮细胞 p5 0 /p6 5核移位情况 ,采用Western印迹法检测刺激 30、6 0、90、12 0min后内皮细胞IκBα蛋白降解的情况。　结果　与对照组比较 ,烧伤血清刺激内皮细胞 30min后 ,p5 0、p6 5即发生核移位 ,30～ 6 0min达高峰 ,2h后恢复至刺激前状态 ;而烧伤血清刺激 30min后 ,IκBα发生降解 (P <0 .0 1) ,刺激 4 5～ 6 0min后最为明显 ,2h后表达逐渐恢复。PDTC能有效抑制烧伤血清作用 30、6 0min后 ,p5 0、p6 5的核移位和IκBα降解。 　结论　烧伤血清可导致内皮细胞NF κBp5 0、p6 5发生核移位 ,并使IκBα降解 ,进而活化NF κB ,诱导内皮细胞分泌细胞因子。PDTC对这一系列变化可能有抑制作用     

PI3K-Akt-eNOS信号转导通路在吗啡促人脐静脉内皮细胞一氧化氮合成中的作用

目的 评价磷脂酰肌醇-3激酶-蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶-内皮型一氧化氮合酶(PI3K-Akt-eNOS)信号转导通路在吗啡对促人脐静脉内皮细胞一氧化氮(NO)合成中的作用.方法 体外培养人脐静脉内皮细胞,实验Ⅰ:人脐静脉内皮细胞随机分为4组,每组6孔:C组和M1～3组,C组不予任何处理;M1～3组加入吗啡,终浓度为1 μmol/L,分别孵育3、6和12 h,随后测定NO含量;实验Ⅱ:人脐静脉内皮细胞随机分为4组,每组6孔:C组和M1～3组,C组不予任何处理;M1～3组加入吗啡,终浓度分别为0.01、1和100 μmol/L,孵育6 h,随后测定NO含量;实验Ⅲ:人脐静脉内皮细胞随机分为5组,每组6孔:C组、M组、MW组、MS组和ML组,C组不予任何处理;M组加入吗啡,终浓度1 μmol/L;MW组先加入wortmannin(PI3K特异性抑制剂),15 min后加入吗啡,终浓度分别为5、1μmol/L;MS组先加入SH-5(Akt特异性抑制剂),15 rain后加入吗啡,终浓度分别为10、1 μmol/L;ML组先加入L-NAME(eNOS特异性抑制剂),15 min后加入吗啡,终浓度分别为0.5、1 μmol/L,各组孵育6 h后,测定NO含量.结果 实验Ⅰ结果 :随吗啡孵育时间延长,促脐静脉内皮细胞NO合成的作用增强(P<0.05);实验Ⅱ结果 :随吗啡浓度升高,促脐静脉内皮细胞NO合成的作用增强(P<0.05);实验Ⅲ结果 :与C组比较,M组人脐静脉内皮细胞NO含量升高(P<0.05),MW组、MS组和ML组差异无统计学意义(P>0.05);与M组比较,MW组、MS组和ML组人脐静脉内皮细胞NO含量降低(P<0.05).结论 吗啡促人脐静脉内皮细胞NO合成呈浓度和时间依赖性,其机制可能与激活PI3K-Akt-eNOS信号转导通路有关.     

Cellular compatibility of improved scaffold material with deproteinized heterogeneous bone

Objective： To study cellular compatibility of improved scaffold material with deproteinized heterogeneous bone and provide experimental basis on choosing the scaffold material in bone tissue engineering. Methods： Bone marrow stromal cells （BMSC） were co-cultured with heterogeneous deproteinized bone in vitro. The contrast phase microscope, scanning electron microscope, MTT assay, flow cytometry were performed and the BGP content and ALP activities were detected in order to observe the cell growth, adhesion in the material, cell cycle and cell viability. Results. The scaffold material of deproteinized heterogeneous bone had no inhibitory effect on cellular proliferation, differentiation and secretion function of BMSCs. Conclusions ： The established heterogeneous deproteinized bone has good biocompatibility with BMSCs and is a potentially ideal scaffold material for bone tissue engineering.     

以骨基质明胶及软骨基质构建一体化纤维环-髓核双相支架的实验研究

 目的 以骨基质明胶和软骨基质构建一体化纤维环-髓核双相支架,并检测其理化性能及细胞相容性。方法 制备中空骨基质明胶环,并注入脱细胞软骨匀浆,经冷冻干燥、交联后制备成一体化纤维环-髓核双相支架。行Hoechst 33258、天狼星红、HE染色,扫描电镜观察支架内部结构,检测支架孔隙率和吸水率,检测双相支架复水后的力学性能。分离山羊纤维环和髓核细胞,接种至双相支架的相应部位,体外培养48 h,扫描电镜、活/死细胞染色评价支架与细胞的生物相容性。结果 镜下Hoechst 33258染色未见细胞残留,天狼星红染色阳性,HE染色示两部分结合紧密。扫描电镜可见支架呈多孔结构,孔隙相连通,纤维环相孔径为(401.4±13.1) μm,髓核相孔径为(112.4±21.8)μm。支架孔隙率为73.37%±2.56%,支架吸水率为655.7%±78.6%。支架压缩弹性模量为(49.06±15.57)kPa,小于正常椎间盘的(135.9±28.9)kPa,但在同一数量级。扫描电镜观察细胞黏附于支架表面,细胞周围有基质分泌,live/dead细胞染色示细胞在支架上活性良好。结论 以天然骨基质明胶和软骨基质构建的一体化纤维环-髓核双相支架,无免疫原性,具有良好的孔径和孔隙率,支架两部分连接处结合紧密,在结构、生化成分及生物力学性能上与椎间盘组织相似,且具有良好的生物相容性。     

成骨细胞与生物衍生材料联合培养的实验研究

目的：探讨冻干脱钙骨基质（FDBM）作为组织工程骨支架的可行性。方法：取兔颅骨外膜的成骨细胞，经传代培养后作为种子细胞与FDBM于体外联合培养，通过对复合物相差显微镜、光镜及扫描电镜等观察，了解细胞在材料中的生长情况。结果：经系统处理后的FDBM呈现不规则的网－孔结构，其孔隙直径为100－400μm ,孔隙率为70％。体外复合培养8小时，成骨细胞即开始贴附于FDBM网架上；复合培养7天，分布于支架材料上的成骨细胞迅速分化增殖，分泌细胞外基质并形成钙结节。结论：FDBM可作为构建组织工程骨的一种较好支架材料。     

骨髓间充质细胞与速固化磷酸钙支架共培养的实验研究

[目的]观察人骨髓间充质干细胞在速固化磷酸钙骨水泥支架中的增殖和生长情况。[方法]将速固化壳聚糖-磷酸钙骨水泥支架材料预先成形。采用全骨髓法分离人骨髓间充质细胞并在体外对细胞进行培养和扩增。72h首次换液,细胞融合80%传代,取第3代细胞用于实验。将细胞与磷酸钙骨水泥支架复合培养,分别利用四甲基偶氮唑蓝MTT法及扫描电镜等检测细胞在材料中的增殖和生长情况。[结果]用酶标仪检测OD值提示共培养后,支架内的细胞数量逐渐增加。扫描电镜结果显示支架材料内部为多孔结构,孔内见有细胞生长,细胞表面可见分泌颗粒。[结论]速固化壳聚糖-磷酸钙骨水泥对人骨髓间充质干细胞有较好的细胞相容性,细胞可在材料内黏附和增殖,是理想的骨组织工程支架材料。     

增强型生物活性玻璃/胶原复合材料的促血管化作用

目的骨组织工程所使用的支架材料能否快速、有效地血管化是骨修复的关键。研究增强型生物活性玻璃/胶原复合材料对血管化的协同和促进作用,为构建血管化组织工程骨修复骨缺损寻找适宜的支架材料。方法体外分离获取人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),并通过血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)与CD34抗原鉴定,取第1代细胞用于实验。将细胞接种于增强型生物活性玻璃/胶原复合材料上,扫描电镜观察细胞黏附情况。取细胞接种于增强型生物活性玻璃/胶原复合材料作为实验组,等量细胞直接接种于培养板常规培养作为对照组,采用alarmarBlue法动态检测细胞增殖率,实时荧光定量PCR检测内皮细胞相关基因VEGF、血管内皮生长因子受体1(fms-related tyrosine kinase1,Flt-1)、血管内皮生长因子受体2(kinase insert domain receptor,Kdr)的mRNA表达。取SD大鼠6只,将支架材料包埋于大鼠股内侧皮下,实验组采用增强型生物活性玻璃/胶原复合材料、中央轴向植入血管束,对照组采用非增强型生物活性玻璃/胶原复合材料,分别于植入5、10d取出,行冰冻切片并HE染色动态观察支架材料内部的血管化状态。结果分离的细胞通过形态学及vWF、CD34免疫荧光鉴定为HU VECs。扫描电镜示HUVECs在支架材料上黏附较好。HUVECs在实验组支架材料上增殖明显,在第3天后细胞增殖率开始高于对照组,11d达到增殖平台期时细胞数仍多于对照组(P<0.05)。实时荧光定量PCR检测示,培养3d实验组VEGF、Flt-1、Kdr的mRNA表达均显著高于对照组(P<0.05)。包埋大鼠皮下实验可见,实验组5、10d时植入的血管仍通畅,其周围新生血管随时间延长而增多,材料周缘可见宿主血管浸润生长,但新生血管稀疏;对照组仅有纤维组织生长,10d时材料已大部分降解,组织难以长入。结论增强型生物活性玻璃/胶原复合材料在大鼠体内外可促进血管化,可能适于作为构建血管化组织工程骨的支架材料。     

蛇床子素和纳米氧化锆强韧化磷酸钙支架对成骨细胞增殖影响的研究

目的研究蛇床子素与纳米氧化锆强韧化磷酸钙骨支架的相容性，以及其在体外对幼兔成骨细胞增殖和成骨作用的影响。方法酶消化法分离培养幼兔股骨成骨细胞，噻唑兰法(MTT)测量成骨细胞增殖率，用碱性磷酸酶试剂盒测定细胞内骨碱性磷酸酶(ALP)活性。结果蛇床子素对大鼠新生成骨细胞的增殖和ALP活性具有显著的促进作用，与纳米氧化锆强韧化磷酸钙人工骨支架生物相容性良好。结论纳米氧化锆强韧化磷酸钙人工骨支架复合蛇床子素刺激的成骨细胞，是一种性能良好的复合骨组织工程材料。     

成骨细胞株与强韧化纳米人工骨支架联合培养实验研究

目的 :观察成骨细胞株 ( 3T3 E1)在新型纳米氧化锆强韧化高孔隙率人工骨支架 (下文简称人工骨支架 )材料上生长情况。方法 :成骨细胞株 ( 3T3 -E1)与人工骨支架联合培养 ,通过光镜观察和细胞计数的方法了解成骨细胞与支架结合能力 ,扫描电镜观察细胞生长的情况。结果 :新型强韧化纳米人工骨材料与建株成骨细胞有良好的结合能力 ,成骨细胞株 ( 3T3 E1)在人工骨材料上生长良好。结论 :纳米骨支架是较理想的骨组织工程支架材料 ,成骨细胞复合支架用于骨缺损的修复 ,具有广阔的临床应用前景。     

Effects of endothelial cells on proliferation and survival of human mesenchymal stem cells and primary osteoblasts

Angiogenesis is a fundamental process in bone formation, remodeling, and regeneration. Moreover, for the regeneration of bone in tissue engineering applications, it is essential to support neovascularization. This can be achieved by cell‐based therapies using primary endothelial cells, which are able to form functional blood vessels upon implantation. In bone composite grafts, coimplanted endothelial cells do not only support neovascularization but also support osteogenic differentiation of osteoblasts and osteoprogenitor cells. In this study, we investigated the effect of endothelial cells on proliferation and cell survival of human primary osteoblasts (hOBs) and human mesenchymal stem cells (MSCs). Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) stimulated hOB and MSC proliferation, whereas proliferation of HUVECs was unaffected by cocultured hOBs or MSCs. The effect of HUVEC cocultivation on hOB and MSC proliferation was more pronounced in direct cocultures than in indirect cocultures, indicating that this effect is at least partially dependent on the formation of heterotypic cell contacts between HUVECs and hOBs or MSCs. Furthermore, HUVEC cocultivation reduced low‐serum induced apotosis of hOBs and MSCs by a mechanism involving increased phosphorylation and inactivation of the proapoptotic protein Bad. In summary, our experiments have shown that cocultured HUVECs increase the proliferation and reduce low‐serum induced apoptosis of hOBs and MSCs. © 2012 Orthopaedic Research Society. Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res 30:1682–1689, 2012     

以软骨细胞外基质与脱细胞骨基质构建组织工程骨软骨双层支架及其性能的研究

目的 探讨采用软骨细胞外基质(CECM)与脱细胞骨基质(ACBM)为材料制作新型组织工程骨软骨双层支架的可行性,并检测其性能.方法 双层支架的骨部分以犬松质骨制备的ACBM为原料,软骨部分以人CECM为材料,采用冷冻冻干法制备CECM/ACBM双层支架并交联.测定支架孔隙率,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法分析支架浸提液毒性.分离培养犬骨髓基质干细胞(BMSCs),成软骨诱导后种植到支架上,倒置显微镜、电镜、Dead/Live荧光染色观察细胞在支架的生长、分化情况.结果 扫描电镜及Micro-CT观察显示支架内孔洞相互贯通呈海绵状,CECM部分孔径(155±34)μm,孔隙率为91.3%±2.0%;ACBM部分具有大然骨的孔径和空隙率,骨软骨部分结合良好.培养1～6 d不同浓度支架浸提液与对照培养液吸光度值比较羌异均无统计学意义(P＞0.05).倒置显微镜、电镜检查结果表明BMSCs在支架上黏附良好,细胞基质分泌增加,Dead/Live荧光染色表明双层支架内细胞均呈绿色.结论 CECM/ACBM骨软骨双层支架具备良好的孔径和孔隙率,骨、软骨两层间结合良好,无毒,生物相容性良好,可作为支架载体用于组织工程骨软骨复合体的构建.

Abstract：

Objective To fabricate a novel bilayered scaffold constructed with cartilage extracellular matrix (CECM) and acellular bone matrix (ACBM) for osteochondral tissue engineering.Methods The bone layer of the osteochondral scaffold was prepared using canine bone cancellous bone columns, and the cartilage layer was fabricated using CECM.After CECM microfilaments were decellularized, the biphasic scaffolds were fabricated by soaking the ACBM columns into cylindrical silicon moulds with a 30 g/L CECM suspension using simple freeze-drying method.After the scaffolds were cross-linked, the porosity was measureed.MTT test was also done to assess cytotoxicity of the scaffolds.Canine bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs) were induced by chondrogenic medium and seeded into novel scaffold.Cell proliferation and differentiation were analyzed using inverted microscopy, scanning electron microscopy (SEM)and Dead/Live staining method.Results SEM and Micro-CT revealed a 3-D interconnected porous structure, with the CECM pore diameter of 155 ± 34 μm and the porosity of 91.3% ± 2.0%.Cytotoxicity testing with MTT revealed no significant difference in absorbance among different extracts, showing no cytotoxic effect of the scaffold on BMSCs.Inverted microscopy and SEM showed that the novel scaffold could provide a suitable 3-D environment to support the adhesion, proliferation and differentiation of BMSCs to chondroeytes in culture with chondrogenic medium.Confocal microscopy of cell-scaffold constructs revealed cells with green fluorescence.Conclusion Since the novel CECM/ACBM bilayered integrated osteochondral scaffold has good mircostructure, non-toxicity and good biocompatibility, it may be a suitable candidate as an alternative cell-carrier for osteochondral tissue engineering.     

无机活性元素骨组织工程支架材料的细胞亲和性

目的 评价作为骨修复材料的无机活性元素骨组织工程支架材料的细胞亲和性。方法 测试无机活性元素骨组织工程支架材料的比表面积、孔径分布、孔隙率、吸水率。将体外培养扩增并经过流式细胞仪鉴定的人骨髓间充质干细胞（MSCs）与无机活性元素骨组织工程支架材料复合培养,以单纯接种培养MSCs为对照组,噻唑蓝（MTT）法检测材料对细胞增殖的影响,扫描电镜观察材料表面细胞生长状况。结果 无机活性元素骨组织工程支架材料比表面积为210m^2／g,平均微孔直径为6nm,孔隙率90％,有34％的吸水率。MIT法显示培养至第7天时材料组细胞增殖与对照组有显著性差异（P〈0．05）,扫描电镜下见材料表面细胞生长状况良好。结论 无机活性元素骨组织工程支架材料具有良好的细胞亲和性,是一种较为合适的极具潜力的骨修复材料。