红花转录因子CtMYB1基因的克隆及原核表达

目的 从红花Carthamus tinctorius 花瓣中克隆转录因子基因CtMYB1,并进行序列分析和原核表达载体的构建。方法 根据红花转录组测序结果中得到的高表达的Unigene123933序列,利用RT-PCR和RACE技术从红花花瓣中扩增得到CtMYB1基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;以CtMYB1基因的全长cDNA序列为模板,PCR扩增得到CtMYB1基因的开放阅读框(ORF)序列,构建原核表达载体pEASY-E1-CtMYB1。转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。结果 成功从红花中克隆1个MYB基因,命名为CtMYB1,GenBank登录号为KJ524853。CtMYB1基因全长893 bp,ORF为750 bp,编码249个氨基酸。同时,成功构建了该基因的原核表达载体。SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约30 000,与预测的蛋白相对分子质量一致。结论 成功克隆了CtMYB1基因,构建了原核表达载体,初步证明该基因在大肠杆菌中成功表达。     

菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的克隆与原核表达分析＊

目的 克隆菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的全长编码序列，利用原核系统表达融合蛋白，为进一步研究该基因在菊花脑萜类合成中的功能提供理论依据。方法 以菊花脑基因组数据为基础，设计特异性引物，PCR扩增CnTPS1的全长编码序列，利用生物信息学分析软件分析序列特征。利用qRT-PCR技术分析CnTPS1基因在不同组织中的基因表达量。构建原核表达载体，体外诱导目的蛋白表达。结果 CnTPS1编码序列全长1749bp，编码582个氨基酸；基因表达模式分析表明该基因在茎和管状花中表达量较高；原核表达系统能诱导出67.58kDa大小的蛋白。结论 首次从菊花脑中克隆得到一个芳樟醇合酶基因CnTPS1，运用生物信息学方法对其编码蛋白的理化性质、结构特征等进行了分析预测，分析了该基因的组织表达模式，并在原核表达系统中成功诱导表达出目标蛋白，这些结果将为菊花脑萜类合酶基因的功能以及萜类物质生物合成途径的解析提供理论依据。     

甘草UGDH1基因的克隆、生物信息学及表达分析

目的 对甘草尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶（UGDH）基因进行克隆、生物信息学及表达分析。方法 提取6周龄乌拉尔甘草幼苗根、茎、叶的总RNA,通过逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）克隆GuUGDH1基因（Gu表示甘草）互补脱氧核糖核酸（cDNA）序列,测序并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）技术进行组织特异性分析。结果 克隆所得GuUGDH1基因的开放阅读框（ORF）全长1 443 bp,编码480个氨基酸残基（GenBank登录号MT968993）;生物信息学分析显示,GuUGDH1属于稳定的酸性亲水蛋白,相对分子质量53.056 kDa,等电点5.89,不含信号肽,不含跨膜螺旋且都在膜外;含有3个典型的保守结构域,属于尿苷二磷酸（UDP）-葡萄糖/鸟苷二磷酸（GDP）-甘露糖脱氢酶家族;系统进化分析表明,GuUGDH1基因与豆科植物大豆Glycine max,密花豆Spatholobus suberectus的亲缘关系较近;Real-time PCR检测结果表明,在6周龄甘草幼苗的根、茎、叶中都能检测到GuUGDH1基因的表达,根的表达量显著高于茎和叶。结论 本研究克隆得到了甘草UGDH1基因并对其蛋白序列特征进行了系统分析,可为进一步研究UGDH1蛋白的催化功能提供理论依据。     

白花前胡CAL基因的克隆和原核表达分析

目的 克隆得到白花前胡花发育关键基因CAULIFLOWER（CAL）并对其进行原核表达和基因表达分析。方法 根据白花前胡转录组数据中的基因序列信息，通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从白花前胡中克隆CAL基因，命名为PpCAL1和PpCAL2。构建原核表达载体pET-32a-PpCAL1和pET-32a-PpCAL2，并转化至大肠埃希菌Transetta（DE3）进行诱导表达。运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析抽薹开花前后白花前胡不同组织的基因相对表达量。结果 PpCAL1和PpCAL2的开放阅读框（ORF）长度分别为645、738 bp，分别编码214、245个氨基酸。结构功能域分析表明，PpCAL1和PpCAL2蛋白都具有MADS_MEF2_like和K-box保守结构域。原核表达结果显示，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷可成功诱导目的蛋白表达。系统进化树分析显示，白花前胡PpCAL1与胡萝卜DcCAL聚为一支，白花前胡PpCAL2与橡胶树HbCAL聚为一支。基因表达结果显示，PpCAL1和PpCAL2在不同组织中均在开花后表达量上调。结论 克隆并分析白花前胡PpCAL1和PpCAL2基因，为进一步研究白花前胡开花基因提供参考。     

丹参SmRopGEF1基因的克隆、亚细胞定位与表达分析

目的 克隆丹参SmRopGEF1基因,研究其编码蛋白的亚细胞定位及其对逆境胁迫的应激反应和激素诱导下的表达水平。方法 根据前期丹参转录组测序结果设计SmRopGEF1基因特异引物,利用聚合酶链式反应（PCR）扩增SmRopGEF1基因序列;使用生物信息学方法分析SmRopGEF1蛋白序列特征及进化关系;构建pET28a-SmRopGEF1原核表达载体并转化至大肠埃希氏菌中诱导表达,构建35S启动的SmRopGEF1的绿色荧光蛋白原生质体瞬时表达载体,利用激光共聚焦显微镜观察SmRopGEF1的亚细胞定位;实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测逆境胁迫（低温、盐及干旱）和激素诱导（生长素、脱落酸、茉莉酸甲酯）下的基因表达量。结果 丹参SmRopGEF1基因开放阅读框（ORF）全长为1701 bp,编码566个氨基酸,蛋白相对分子质量是62 362.99。生物信息学分析显示SmRopGEF1蛋白含有1个PRONE保守结构域,系统进化树分析表明SmRopGEF1蛋白与芡欧鼠尾草和一串红RopGEF1蛋白为高同源蛋白。成功构建pET28a-SmRopGEF1原核表达载体并在大肠埃希氏菌Rosetta（DE3）菌株中表达、纯化出SmRopGEF1重组蛋白。亚细胞定位的结果显示SmRopGEF1存在于植物细胞的细胞核中。qRT-PCR实验结果表明盐胁迫和冷胁迫能够显著提高SmRopGEF1的表达量;干旱胁迫后丹参愈伤中SmRopGEF1表达量下降。茉莉酸甲酯诱导后SmRopGEF1表达量升高。结论 克隆了丹参SmRopGEF1基因,其在抗逆胁迫中起到重要作用并且可能参与茉莉酸甲酯信号转导。研究结果丰富了丹参防御反应机制的研究,为选育丹参抗逆优良品种、提高丹参的产量与品质提供了参考。     

家鸡MDH2基因克隆、生物信息学分析及原核表达载体构建

目的 初步探索家鸡苹果酸脱氢酶2编码基因MDH2的序列特征、组织表达及原核表达情况。方法 采用克隆技术与测序技术获取家鸡MDH2基因互补脱氧核糖核酸（cDNA）全长，使用多种在线软件对其进行生物信息学分析，利用实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）技术检测该基因在不同组织中的表达情况，利用同源重组技术构建pET32a（+）-MDH2表达载体，使用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达。结果 从新鲜家鸡砂囊内壁中成功克隆到MDH2基因，序列长度1120 bp，其开放阅读框（ORF）为1014 bp，编码337个氨基酸；MDH2蛋白相对分子质量为35.95 kDa，理论等电点9.17，属于稳定碱性疏水性蛋白。MDH2蛋白含25个磷酸化位点；二级结构主要包括α-螺旋、β-螺旋、无规则卷曲，无信号肽和跨膜结构域。MDH2基因在心、肝、脾、肺、肾、砂囊内壁中都有表达，其中心、肾、砂囊内壁中表达量较高，pET32a（+）-MDH2重组蛋白主要是以包涵体的形式存在。结论 MDH2基因在家鸡体内广泛表达，但其在各组织/器官中表达趋势不同，提示其功能可能具有广泛性与多重性。     

温郁金法呢基焦磷酸合酶（CwFPPS）基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

目的 克隆温郁金Curcuma wenyujin萜类生物合成中的限速酶法呢基焦磷酸合酶（farnesyl pyrophosphate synthase，FPPS）的全长cDNA序列。方法 根据温郁金转录组数据设计特异引物，PCR扩增FPPS全长cDNA序列并对其进行生物信息分析；构建"基因-GFP"融合表达载体，利用农杆菌介导烟草叶片进行亚细胞定位分析；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测基因在植物组织中的特异性表达。结果 温郁金CwFPPS基因全长1196 bp，包含1个长为1071 bp的开放阅读框，编码356个氨基酸，GenBank登入号为MT489462；CwFPPS编码蛋白属于类异戊二烯生物合成酶超级家族（C1）成员，包含5个保守的功能域，其中2个是富含天冬氨酸（DDXXD）的活性中心；亚细胞定位显示该蛋白位于泡质、细胞膜或细胞核上。qRT-PCR分析表明，CwFPPS基因在根茎中特异表达，相对表达水平是叶片中的13.7倍。结论 克隆获得的温郁金CwFPPS基因全长及其特异表达信息，可为后续进行基因功能鉴定及倍半萜成分的代谢工程研究提供依据。     

鸢尾糖基转移酶编码基因ItUGT349和ItUGT419克隆及特性研究

目的 克隆获得鸢尾Iris tectorum糖基转移酶基因ItUGT349和ItUGT419,并对其进行生物信息学分析、基因差异表达检测和蛋白原核表达等特性分析。方法 以鸢尾转录组中筛选到的ItUGTs基因全长开放阅读框(open reading frame,ORF)设计特异性引物,进行PCR扩增,经测序后获得基因序列并进行生物信息学分析;通过荧光定量PCR(real-time PCR,qRT-PCR)进行基因差异表达检测;最后构建pET-32a(+)原核表达载体在大肠杆菌中表达蛋白。结果 PCR扩增ItUGT349和ItUGT419的ORF长度分别为1461、1488 bp,编码蛋白相对分子质量大小分别为53 830、54 910。荧光定量PCR显示,ItUGT349的表达量在叶片中最高,而ItUGT419在花器官中表达最高。进化树表明,ItUGT419与三萜类糖基转移酶聚类在一起,ItUGT349与三萜、黄酮和木质素等多种类型的糖基转移酶聚类到一支。ItUGT349和ItUGT419在大肠杆菌中均成功的表达出可溶性蛋白。结论 通过ItUGT349和ItUGT419基因全长ORF克隆,并对其进行序列分析,基因差异表达检测及原核表达等研究,为后续进一步鉴定其催化功能奠定基础。     

霍山石斛类黄酮-3-O-糖基转移酶（DhUF3GT）基因克隆与原核表达分析＊

目的 克隆霍山石斛类黄酮-3-O-糖基转移酶（DhUF3GT）基因并进行生物信息学分析，为进一步培育高黄酮含量的霍山石斛药材提供理论依据。方法 根据前期霍山石斛转录组数据筛选出的基因DhUF3GT，克隆该基因，并对cDNA的核酸序列进行生物信息学分析，同时构建DhUF3GT-pET28（a）重组质粒进行原核表达分析。结果 测序结果显示，霍山石斛DhUF3GT基因cDNA序列有1289 bp，包含一个长度为1239 bp的开放阅读框，编码412个氨基酸，GenBank中的登录号为OM460827。生物信息学分析表明：DhUF3GT蛋白属于亲水性稳定蛋白，理论相对分子质量为45.668 KD，等电点（PI）为5.98，具有多个磷酸化位点和两个糖基化位点，不含信号肽，亚细胞定位于叶绿体。系统进化树表明，该序列与同科植物铁皮石斛同源性最高，具有UGT家族的“PSPG Box”保守区域。SDS-PAGE电泳显示，成功表达出原核重组蛋白DhUF3GT-pET28（a）。结论 成功克隆出霍山石斛DhUF3GT基因序列，并获得其序列特征及原核表达蛋白，这有助于霍山石斛DhUF3GT功能的进一步研究及类黄酮化合物的生物合成机制的阐明。     

马蓝BcASB基因的克隆、生物信息学及表达分析

目的克隆马蓝邻氨基苯甲酸合成酶(anthranilate synthase,AS)BcASB基因(GenBank登录号QCF61930.1),并对其进行生物信息学分析、时空表达分析以及检测马蓝有效成分靛蓝、靛玉红积累量随时间的变化。方法通过RT-PCR和RACE技术,克隆BcASB基因全长,应用生物信息学的方法对该基因编码的蛋白进行各种理化性质测定,二级结构和三级结构预测分析以及对核苷酸和氨基酸序列进行比对;利用qRT-PCR技术检测BcASB基因在马蓝不同器官(根、茎、叶)中的表达模式以及在外源诱导子茉莉酸甲酯(methyl-jasmonate,MeJA)、脱落酸(abscisic acid,ABA)、水杨酸(salicylic acid,SA)和乙烯利(ethylene,ETH)诱导下的表达情况;同时运用HPLC测定吲哚类生物碱靛蓝、靛玉红含量的变化情况。结果克隆获得BcASB基因,开放阅读框(open reading frame,ORF)长度为765 bp,编码256个氨基酸,生物信息学表明,该蛋白不含信号肽且无跨膜区,亚细胞结构定位于叶绿体;qRT-PCR检测结果表明,BcASB基因在马蓝叶和茎中的表达量较高,在根中表达较低;BcASB基因可响应不同外源诱导处理,而影响其转录;HPLC检测结果显示靛蓝、靛玉红含量有着明显的变化。结论成功克隆马蓝邻氨基苯甲酸合成酶BcASB基因,为进一步阐释该基因在马蓝吲哚类生物碱合成途径的作用及表达调控研究奠定基础。     

独行菜磷酸甲羟戊酸激酶LaPMK基因克隆、生物信息学分析及原核表达

目的从独行菜Lepidium apetalum中克隆萜类合成途径关键酶磷酸甲羟戊酸激酶(phosphomevalonate kinase,PMK)基因,进行序列分析和原核表达。方法根据独行菜转录组数据中La PMK基因序列设计特异性引物,克隆得到La PMK基因的开放阅读框(open reading frame,ORF),构建p ET32a-La PMK原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达La PMK融合蛋白。结果 La PMK基因ORF全长为1 518 bp(Genbank注册号KT004541),编码505个氨基酸。生物信息学分析结果显示La PMK蛋白没有跨膜区,不含信号肽,位于细胞质中,含有GHMP激酶家族特异的N末端和C末端的保守结构域。系统进化树结果显示La PMK蛋白与芜菁的PMK蛋白具有92%的序列相似性,亲缘关系较近。构建p ET32a-La PMK原核表达载体,在大肠杆菌中成功表达La PMK融合蛋白。结论克隆了La PMK基因,建立其稳定的原核表达体系,为La PMK蛋白纯化、抗体的制备,进一步研究La PMK基因在独行菜萜类合成途径中的作用奠定了基础。     

枸骨法尼基焦磷酸合酶IcFPS2基因克隆与原核表达分析

目的 克隆枸骨Ilex cornuta三萜皂苷生物合成途径中关键酶法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase,FPS）基因,对其进行组织特异性表达分析,构建原核表达载体并进行重组蛋白诱导表达,探究其参与调控三萜皂苷生物合成的功能。方法 结合枸骨转录组数据设计特异性引物,采用PCR技术从枸骨叶中扩增得到了IcFPS2基因的c DNA序列,对其进行生物信息学分析;通过实时荧光定量进一步分析其组织表达特异性,构建原核表达载体pET32a-IcFPS2,并转化至大肠杆菌E. coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白的表达。结果 IcFPS2基因长1259 bp,开放阅读框为1050 bp,编码350个氨基酸,其蛋白质相对分子质量和等电点分别为40 200、5.54。氨基酸序列比对分析表明枸骨与栀子、杜仲、甘草、绞股蓝、竹节参的FPS氨基酸序列具有较高的同源性。系统进化树分析显示,IcFPS2蛋白与西洋参、人参、竹节参FPS蛋白聚为一支,表明枸骨FPS蛋白可能与双子叶植物五加科FPS蛋白在功能上较为...     

布渣叶黄烷酮-2-羟化酶基因cDNA克隆及其生物信息学和表达分析

目的从布渣叶中克隆黄酮碳苷合成途径关键酶黄烷酮-2-羟化酶(flavanone 2-hydroxylase,F2H)基因,构建原核表达载体,对其进行生物信息学和表达模式分析。方法根据布渣叶转录组数据中注释为F2H的Unigene设计特异性引物,利用PCR法扩增Mp F2H基因的开放阅读框(open reading frame,ORF),基于在线工具对c DNA序列进行生物信息学分析。同时,依据F2H序列,设计特异引物,采用RT-q PCR方法对其在芽、叶、枝、花、果等组织中的表达进行测定。结果 Mp F2H基因ORF全长为1 557 bp(Genbank登录号KY652921),编码518个氨基酸;相对分子质量54 500,理论等电点5.49,含有信号肽,不含跨膜域,可能定位于叶绿体。同时,Mp F2H基因在不同组织中均有表达,其中在叶中表达量最高,在枝和花中表达量最低。结论 Mp F2H基因在不同组织中表达量差异较大。克隆了Mp F2H基因c DNA,构建了其原核表达载体p ET30a-Mp F2H,为Mp F2H基因的原核表达和功能验证奠定了基础。     

滇龙胆1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因GrDXR的克隆、序列分析与原核表达

目的从滇龙胆Gentiana rigescens幼叶中克隆萜类合成关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因GrDXR,进行序列分析和原核表达。方法根据滇龙胆转录组中GrDXR基因序列,设计引物,通过RT-PCR扩增得到GrDXR开放阅读框(ORF)序列,并进行TA克隆、测序和序列分析;构建原核表达载体pGEX-4T-1-GrDXR,转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,在IPTG诱导下进行表达。结果 GrDXR ORF全长1 425 bp,编码474个氨基酸。序列分析表明,GrDXR基因是DXR家族成员;蛋白质序列系统发育分析表明,GrDXR与萝芙木RvDXR、橡胶树HbDXR和长春花CrDXR亲缘关系较近。构建pGEX-4T-1-GrDXR重组质粒,获得稳定的原核表达体系。SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。结论克隆了GrDXR基因,建立其稳定的原核表达体系,为进一步纯化GrDXR蛋白,研究其结构和功能奠定基础。     

铁皮石斛HDS基因的克隆与初步表达分析

目的从铁皮石斛Dendrobium officinale中克隆4-羟基-3-甲基-2-E-丁烯基-1-焦磷酸合成酶(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-yl diphosphate synthase,HDS)基因,在大肠杆菌中诱导融合蛋白,并探究该基因在铁皮石斛不同组织中的表达规律。方法采用RT-PCR和RACE等方法获取铁皮石斛HDS(Do HDS)的c DNA全长,利用相关软件和在线网站进行生物信息学分析,使用Real-Time PCR分析Do HDS在不同组织的表达特征,构建原核表达载体p ET-28a(+)-Do HDS,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。结果成功获得Do HDS的c DNA全长序列,Gen Bank登录号为KJ161312,全长2 666 bp,ORF为2 238 bp,编码745个氨基酸。Do HDS在各组织中均有表达,在茎中表达量最高,为原球茎的5倍;SDS-PAGE结果显示诱导产物为1个相对分子质量(82 700)与理论值相符的融合蛋白。结论克隆了Do HDS的c DNA全长序列,探究其在不同组织中的表达模式,建立了原核表达体系,为后续研究Do HDS的功能提供了一定的理论基础。     

欧洲花楸糖基转移酶基因的全长克隆与表达分析

目的:研究欧洲花楸植保素糖基化修饰的相关基因,从欧洲花楸悬浮细胞中克隆糖基转移酶(glycosyltransferase,GT)基因,进行序列分析和原核表达。方法:基于欧洲花楸转录组数据设计特异性引物,克隆得到2条Sa UGTs基因的c DNA序列,构建HIS-MBP-pET28a-SaUGTs原核表达载体,诱导表达Sa UGTs重组蛋白。结果:克隆得到2条糖基转移酶基因Sa UGT1和Sa UGT2序列,完整开放阅读框为1 458 bp和1 431 bp,分别编码485和476个氨基酸,相对分子质量为54. 27 k Da和53. 49 k Da,理论等电点为5. 50和5. 63。生物信息学分析显示,无信号肽,含有糖基转移酶家族保守结构域(PSPG)。系统进化结果显示Sa UGT1和Sa UGT2蛋白与拟南芥UGT85家族亲缘关系较近。实时荧光定量PCR检测显示,欧洲花楸悬浮细胞经酵母提取物(YE)诱导后,Sa UGT1和Sa UGT2的相对表达量明显上调,分别在24 h和12 h达到最大值。通过IPTG诱导,在大肠埃希菌中成功表达Sa UGT1和Sa UGT2重组蛋白,并得到了纯化的重组蛋白。结论:该研究首次在欧洲花楸中克隆得到糖基转移酶基因,并成功构建了原核表达载体,为进一步研究该类基因的功能奠定了基础。