欧洲花楸病程相关蛋白基因SaPR1-like的克隆及序列分析

目的:探究欧洲花楸类病程相关蛋白1(Sa PR1-like)在响应生物胁迫中的功能。方法:克隆得到了Sa PR1-like基因全长序列,并对该序列进行生物信息学分析;通过实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法检测Sa PR1-like在欧洲花楸悬浮细胞响应harpin蛋白胁迫后的表达特征。结果:克隆得到的Sa PR1-like基因包含1个完整开放阅读框,编码161个氨基酸。该编码蛋白质亲水性强且稳定,具有跨膜结构和信号肽,属于分泌蛋白。氨基酸序列比对分析发现,Sa PR1-like蛋白C端具有高度保守结构域[富含半胱氨酸的分泌蛋白、抗原5和致病性相关蛋白1肽段(CAPE)],推测其在欧洲花楸响应生物胁迫中发挥作用。harpin蛋白诱导欧洲花楸悬浮细胞24 h后,Sa PR1-like基因表达量显著提高。结论:克隆得到了欧洲花楸Sa PR1-like基因,并证明其在响应生物胁迫时表达和积累,可为进一步阐释欧洲花楸响应生物胁迫机制奠定基础和提供参考。     

何首乌糖基转移酶基因的克隆、生物信息学及表达分析

目的克隆何首乌Polygonummultiflorum糖基转移酶基因PmUGTs,并对其进行生物信息学以及差异表达分析。方法基于何首乌转录组数据,利用PCR扩增Pm UGTs全长cDNA并进行生物信息学分析;使用autodock4软件进行分子模拟对接;运用q RT-PCR检测基因在不同器官中的表达差异。结果克隆得到4条Pm UGTs,分别命名为Pm UGT1、Pm UGT2、PmUGT3、PmUGT4基因,开放阅读框(ORF)长度分别为1509、1506、1464和1476 bp;编码503、502、488与492个氨基酸;蛋白相对分子质量分别为56 940、54 780、54 350和54 620。Pm UGTs氨基酸序列中含有UGT高度保守的PSPG盒结构域,其二级结构主要由无规则卷曲与α-螺旋组成。进化树分析表明,Pm UGT1、PmUGT2、PmUGT3与拟南芥的UGT蛋白距离较近,Pm UGT4则与蒺藜苜蓿UGT亲缘关系最近。根据autodock4结果可知Pm UGT1、Pm UGT3、Pm UGT2与Pm UGT4蛋白上的残基分别可以与鹰嘴豆芽素A、罗汉果醇、白藜芦醇通过氢键连接。q RT-PCR结果表明,Pm UGTs表达量均在叶中最高。结论为进一步研究何首乌糖基转移酶基因的功能及何首乌中糖苷类化合物的生物合成途径奠定基础。     

地黄糖基转移酶基因克隆表达及表达分析

目的:从地黄中克隆尿苷二磷酸糖基转移酶(uridine diphosphate glycosyltransferase,UGT)基因,构建其原核表达体系,为后续分析验证其功能奠定基础。方法:在转录组测序的基础上,通过RT-PCR克隆全长cDNA序列。运用生物信息学的方法对该序列进行分析。通过荧光定量PCR检测该基因在不同品种地黄不同部位中的表达情况。构建重组表达载体pET-32a-RgUGT,并转化大肠杆菌BL21,获得重组蛋白。结果:克隆得到RgUGT基因长度为1 374 bp,编码457个氨基酸,RgUGT基因具有尿嘧啶二磷酸-糖基转移酶PSPG盒子,荧光定量PCR结果显示RgUGT基因在根和叶中的表达水平较高。该基因成功在大肠杆菌BL21细胞中表达。结论:该研究从地黄中克隆获得了糖基转移酶基因,可为进一步研究其在地黄次生代谢生物合成中的功能奠定基础。     

党参CpUGPase基因的克隆、序列分析与原核表达

目的为研究党参多糖代谢途径,从党参Codonopsis pilosula根中克隆多糖代谢关键酶尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶CpUGPase基因,并进行序列分析和原核表达。方法根据党参转录组中CpUGPase基因序列设计引物,通过RT-PCR扩增得CpUGPase开放阅读框(ORF)序列,并进行TA克隆、测序和序列分析;构建原核表达载体PET-28a-CpUGPase,转入大肠杆菌BL21(DE3)后,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下进行表达。结果 CpUGPase ORF序列全长1 413bp,编码470个氨基酸。序列分析表明,CpUGPase基因具有保守的UGPase_euk催化位点,属于A型糖基转移酶蛋白家族。构建PET-28a-CpUGPase重组质粒,获得稳定的原核表达体系。SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约54 900,与预测的蛋白相对分子质量一致。结论从党参根中克隆得到CpUGPase基因,并建立了稳定的原核表达体系,为进一步纯化CpUGPase蛋白,研究其结构和功能奠定了基础。     

独行菜幼苗叶片乙酰CoA酰基转移酶基因克隆、序列分析与原核表达

目的:研究独行菜强心苷生物合成途径的相关基因,从独行菜幼苗叶片中克隆强心苷生物合成途径关键酶乙酰CoA酰基转移酶(acetyl-CoA C-acetyltransferase,AACT)基因,进行序列分析和原核表达。方法:根据独行菜转录组数据中LaAACT基因序列设计特异性引物,克隆得到LaAACT基因的cDNA序列,构建pET-32a-LaAACT原核表达载体,诱导表达LaAACT重组蛋白。结果:LaAACT基因ORF全长为1 212 bp,编码403个氨基酸。序列分析结果显示LaAACT蛋白没有跨膜区,不含信号肽,位于细胞质中,含有硫解酶家族保守结构域。系统进化结果显示LaAACT蛋白与十字花科植物的AACT蛋白亲缘关系较近。通过IPTG诱导,在大肠埃希菌中成功表达LaAACT重组蛋白,并得到了纯化的LaAACT重组蛋白。结论:首次从独行菜幼苗叶片中克隆了LaAACT基因,建立其稳定的原核表达体系,为LaAACT蛋白抗体的制备,进一步研究LaAACT基因在独行菜强心苷生物合成途径中的功能奠定了基础。     

小叶女贞糖基转移酶基因的克隆和原核表达研究

根据前期小叶女贞转录组研究的结果,利用c DNA末端快速扩增技术(rapid amplification of c DNA ends,RACE)从叶片中克隆到1条编码糖基转移酶的基因(xynz UGT)。该基因c DNA全长1 598 bp,由66 bp 5'-UTR,1 440 bp ORF,92 bp 3'-UTR组成,其中ORF编码1条含480个氨基酸残基的酶蛋白(xynz UGT),其相对分子质量和等电点分别为54 826.67 Da和5.82。利用生物信息学方法分析酶蛋白的结构,结果表明在一级结构中含有一段糖基转移酶高度保守的PSPG盒,在二级结构中含有α螺旋(38%)、β折叠片(12.1%)和无规蜷曲(49.9%),在三级结构中由肽链折叠形成2个正对的α/β/α类Rossmann折叠区域,并且两者之间夹着一个底物结合口袋。通过系统进化树分析发现,xynz UGT有可能催化酪醇等苯丙素类物质发生糖基化,进一步开展酶蛋白与酪醇的分子对接模拟实验,结果显示位于结合口袋的Gly138和Ser285通过氢键与酪醇发生相互作用。SDS-PAGE电泳分析表明,原核表达系统成功表达出相对分子质量为58 370.57 Da的xynz UGT重组蛋白,但它以非可溶性的包涵体形式存在。利用分子伴侣和酶蛋白共表达的方法,在一定程度上可促进酶蛋白的可溶性表达。以上研究结果为进一步开展体外酶促反应研究,并阐明酶的功能机制奠定了基础。     

北柴胡糖基转移酶基因BcUGT8的克隆、序列分析及其原核表达载体构建

目的 克隆北柴胡Bupleurum chinense中可能参与柴胡皂苷生物合成的糖基转移酶基因BcUGT8,构建其原核表达载体,为通过体外表达和纯化蛋白的催化活性,分析验证其功能奠定基础.方法 在Roche (454) GS FLX系统高通量测序已获得部分cDNA序列基础上,通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)和长距离PCR扩增方法(LD-PCR)克隆全长cDNA.设计含有酶切位点的PCR引物,PCR扩增其开放阅读框(ORF),酶切后,插入到pET-28a(+)载体中,构建出原核表达载体.结果 扩增到北柴胡1个糖基转移酶(UGT)基因全长cDNA,构建了这一基因的原核表达载体.结论 通过BcUGT8基因的全长cDNA克隆、序列分析和原核表达载体的构建,为后续开展体外酶蛋白表达、纯化和催化活性分析实验,验证其生物功能奠定了基础.     

滇重楼甾体糖基转移酶的克隆及功能表征北大核心CSCD

该研究从滇重楼中克隆得到糖基转移酶基因PpUGT2,该基因ORF长度为1773 bp,编码蛋白质的氨基酸为590个。系统进化树分析显示,该糖基转移酶归为UGT80A亚家族,经国际糖基转移酶命名委员会命名为UGT80A49。构建原核表达载体pET28a-PpUGT2,通过诱导蛋白表达及蛋白提取,进行体外酶促实验,以UDP-葡萄糖为糖基供体,薯蓣皂素和偏诺皂素为底物,鉴定了其具有催化薯蓣皂素及偏诺皂素C-3羟基β糖基化的功能,为进一步研究其催化特性,对其进行了底物宽泛性研究,以UDP-葡萄糖为糖基供体,共选取了包括甾体及三萜类化合物在内的15个底物,发现其具有催化甾体类化合物睾酮C-17羟基糖基化的功能。通过同源建模及分子对接,预测了PpUGT2与底物薯蓣皂素及偏诺皂素之间相互作用的关键识别位点。并且通过对配体与多肽的氨基酸扫描,模拟突变,根据复合物的结合亲和力变化,在以底物为中心的5Å范围内,寻找到了最佳突变体,对突变体的设计具有参考意义。该研究为完整解析重楼皂苷生物合成途径以及甾体类糖基转移酶的结构研究奠定了基础。     

白木香AsJAZ1基因原核载体的构建与表达

克隆国产沉香基原植物白木香Aquilaria sinensis jasmonate-zim-domain protein(As JAZ1)基因的编码区,构建原核表达载体及诱导重组蛋白的表达,为筛选互作蛋白因子和研究基因功能奠定基础。该实验以白木香叶片中分离的总RNA为模板,通过RT-PCR方法克隆到茉莉酸信号转导抑制蛋白基因JAZ(As JAZ1)的编码区全长序列,克隆到原核表达载体p ET-28a上,构建重组原核表达载体p ET-28a-As JAZ1,经酶切鉴定和测序验证后将其转入大肠杆菌BL21(DE3),在37℃经0.5 mmol·L-1异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达4 h后,可获得相对分子质量约为39 k Da的融合重组蛋白的高效表达。该重组蛋白在大肠杆菌的上清和沉淀中均有表达,但以包涵体表达为主。     

鸢尾糖基转移酶编码基因ItUGT349和ItUGT419克隆及特性研究

目的 克隆获得鸢尾Iris tectorum糖基转移酶基因ItUGT349和ItUGT419,并对其进行生物信息学分析、基因差异表达检测和蛋白原核表达等特性分析。方法 以鸢尾转录组中筛选到的ItUGTs基因全长开放阅读框(open reading frame,ORF)设计特异性引物,进行PCR扩增,经测序后获得基因序列并进行生物信息学分析;通过荧光定量PCR(real-time PCR,qRT-PCR)进行基因差异表达检测;最后构建pET-32a(+)原核表达载体在大肠杆菌中表达蛋白。结果 PCR扩增ItUGT349和ItUGT419的ORF长度分别为1461、1488 bp,编码蛋白相对分子质量大小分别为53 830、54 910。荧光定量PCR显示,ItUGT349的表达量在叶片中最高,而ItUGT419在花器官中表达最高。进化树表明,ItUGT419与三萜类糖基转移酶聚类在一起,ItUGT349与三萜、黄酮和木质素等多种类型的糖基转移酶聚类到一支。ItUGT349和ItUGT419在大肠杆菌中均成功的表达出可溶性蛋白。结论 通过ItUGT349和ItUGT419基因全长ORF克隆,并对其进行序列分析,基因差异表达检测及原核表达等研究,为后续进一步鉴定其催化功能奠定基础。     

滇重楼糖基转移酶基因的克隆和原核表达

目的:克隆滇重楼皂苷类成分生物合成途径中关键酶糖基转移酶基因(PpUGT1,PpUGT7),并对其进行生物信息学分析、相对表达量分析和原核表达。方法:试剂盒法提取滇重楼RNA并反转录,根据滇重楼转录组数据设计特异性引物,克隆基因全长,使用软件对其进行生物信息学分析,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测基因相对表达量,构建原核表达载体并在大肠埃希菌中诱导表达目的蛋白。结果:PpUGT1和PpUGT7分别长1 827 bp和1 380 bp,分别编码608和459个氨基酸,相对分子质量分别为67.6 kDa和51.3 kDa,其中PpUGT1预测为甾体类糖基转移酶,PpUGT7预测为三萜类糖基转移酶。两蛋白均为亲水性蛋白,无跨膜结构,无信号肽,均与同类蛋白具有较高的保守性。实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)结果显示,PpUGT1的表达量由高到低依次为根>叶>花>茎,PpUGT7的表达量由高到低依次为茎>叶>花>根。此外,成功在大肠埃希菌中以可溶形式表达目的蛋白。结论:克隆得到PpUGT1和PpUGT7基因,证明其在不同植物器官中存在差异表达,并在大肠埃希菌中成功表达其重组蛋白,为进一步鉴定PpUGTs功能、解析滇重楼中皂苷类成分生物合成途径奠定基础。     

黄花蒿MCS基因的克隆及其序列分析与原核表达

目的 从黄花蒿中克隆MEP途径关键酶2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合成酶(MCS)基因,进行序列特征分析、原核表达以及组织表达的研究.方法 根据黄花蒿MCS (AaMCS)基因EST序列,克隆MCS cDNA及基因组序列.将MCS编码区与表达载体pET-21a(+)重组,构建pET-21a (+)-MCS的原核表达载体并转入大肠杆菌BL21 (DE3),IPTG诱导获得MCS融合蛋白.半定量RT-PCR检测MCS的组织表达情况.结果 AaMCS cDNA全长994 bp,包含681 bp的开放阅读框,编码226个氨基酸,基因全长2 540 bp,包含3个外显子和2个内含子.构建pET-21a (+)-MCS重组质粒,获得稳定的pET-21a (+)-MCS原核表达体系.AaMCS在根、茎、叶、花中均有表达,其中花中表达量较高,根和茎中表达量低.结论 克隆了AaMCS基因,建立pET-2 1a (+)-MCS稳定的原核表达体系,为研究AaMCS蛋白的活性及其功能奠定了基础.     

滇龙胆1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因GrDXR的克隆、序列分析与原核表达

目的从滇龙胆Gentiana rigescens幼叶中克隆萜类合成关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因GrDXR,进行序列分析和原核表达。方法根据滇龙胆转录组中GrDXR基因序列,设计引物,通过RT-PCR扩增得到GrDXR开放阅读框(ORF)序列,并进行TA克隆、测序和序列分析;构建原核表达载体pGEX-4T-1-GrDXR,转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,在IPTG诱导下进行表达。结果 GrDXR ORF全长1 425 bp,编码474个氨基酸。序列分析表明,GrDXR基因是DXR家族成员;蛋白质序列系统发育分析表明,GrDXR与萝芙木RvDXR、橡胶树HbDXR和长春花CrDXR亲缘关系较近。构建pGEX-4T-1-GrDXR重组质粒,获得稳定的原核表达体系。SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。结论克隆了GrDXR基因,建立其稳定的原核表达体系,为进一步纯化GrDXR蛋白,研究其结构和功能奠定基础。     

金荞麦黄酮醇合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 克隆金荞麦黄酮醇合酶(FdFLS)基因的编码序列,并对该基因进行序列分析、原核表达及其活性研究.方法 采用同源克隆技术获得FdFLS基因cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;构建FdFLS原核表达载体pET-30b(+)-FdFLS,在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,并测定目标蛋白的酶学活性.结果 FdFLS基因开放阅读框(ORF)全长1008 bp,编码334个氨基酸;FdFLS基因在大肠杆菌中可表达出相对分子量约4×104的蛋白,并具有将二氢槲皮素和二氢山柰酚转化为槲皮素和山柰酚的催化活性.结论 首次克隆到FdFLS基因,并实现该基因在大肠杆菌中有活性的表达.     

枸骨法尼基焦磷酸合酶IcFPS2基因克隆与原核表达分析

目的 克隆枸骨Ilex cornuta三萜皂苷生物合成途径中关键酶法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase,FPS）基因,对其进行组织特异性表达分析,构建原核表达载体并进行重组蛋白诱导表达,探究其参与调控三萜皂苷生物合成的功能。方法 结合枸骨转录组数据设计特异性引物,采用PCR技术从枸骨叶中扩增得到了IcFPS2基因的c DNA序列,对其进行生物信息学分析;通过实时荧光定量进一步分析其组织表达特异性,构建原核表达载体pET32a-IcFPS2,并转化至大肠杆菌E. coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白的表达。结果 IcFPS2基因长1259 bp,开放阅读框为1050 bp,编码350个氨基酸,其蛋白质相对分子质量和等电点分别为40 200、5.54。氨基酸序列比对分析表明枸骨与栀子、杜仲、甘草、绞股蓝、竹节参的FPS氨基酸序列具有较高的同源性。系统进化树分析显示,IcFPS2蛋白与西洋参、人参、竹节参FPS蛋白聚为一支,表明枸骨FPS蛋白可能与双子叶植物五加科FPS蛋白在功能上较为...     

地黄RgGGPPS2基因克隆、生物信息学分析及表达分析

目的为了研究地黄萜类化合物生物合成途径的功能基因,从地黄中克隆了一条新的地黄GGPPS基因(RgGGPPS2),进行生物信息学分析,原核表达、纯化以及基因表达模式分析。方法根据地黄转录组数据中RgGGPPS2基因的序列信息,设计特异性引物,克隆了RgGGPPS2基因的开放阅读框(ORF)序列,构建pET32a-RgGGPPS2原核表达载体,用IPTG在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达RgGGPPS2重组蛋白,荧光定量PCR检测RgGGPPS2基因的组织特异性表达。结果 RgGGPPS2基因的ORF为867 bp,编码289个氨基酸。生物信息学分析结果发现RgGGPPS2蛋白含有2个富含天冬氨酸的基序FARM(first aspartate-rich motif)和SARM(second aspartate-rich motif),RgGGPPS2与芝麻、长春花等双子叶植物中GGPPS蛋白的同源性较高。通过构建pET-32a-RgGGPPS2原核表达载体在大肠杆菌中成功表达RgGGPPS2重组蛋白,利用Ni2+亲和色谱得到了纯化的RgGGPPS2重组蛋白。荧光定量PCR结果显示RgGGPPS2基因在根中表达量最高,其次是叶,茎中最低。结论克隆了RgGGPPS2基因,获得了纯化的RgGGPPS2重组蛋白,为研究RgGGPPS2基因在地黄萜类化合物生物合成途径中的功能奠定了基础。     

独行菜La F3H基因克隆、序列分析及原核表达

目的为了研究独行菜黄酮类化合物生物合成途径的关键基因,从独行菜中克隆了黄烷酮-3-羟化酶(flavanone-3-hydroxylase,F3H)基因,命名为LaF3H,并进行序列分析、原核表达和纯化。方法根据独行菜转录组数据中LaF3H基因序列设计特异性引物,克隆LaF3H基因的cDNA序列,构建pET-32a-LaF3H原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达LaF3H重组蛋白。结果 LaF3H基因开放阅读框(ORF)长1080bp,编码359个氨基酸,其蛋白质相对分子质量为40 320。序列分析结果表明LaF3H具有F3H蛋白的5个保守基序,系统进化分析结果显示LaF3H蛋白与拟南芥等十字花科植物F3H蛋白同源性较高。通过构建原核表达载体pET-32a-LaF3H,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达LaF3H重组蛋白,利用Ni2+亲和色谱得到了纯化的LaF3H重组蛋白。结论克隆了LaF3H基因,获得LaF3H纯化蛋白,为下一步制备LaF3H蛋白抗体、酶学活性检测,研究LaF3H基因在独行菜黄酮类化合物生物合成途径中的功能奠定基础。