胰腺癌中自噬相关蛋白Beclin1、LC3和P62的表达及临床意义

目的探讨胰腺癌中自噬相关蛋白Beclin1、LC3和P62的表达及临床意义。方法本次实验选取外科手术切除的胰腺癌组织标本36例为研究组,并选取相应癌旁正常组织中自噬相关蛋白Beclin1、LC3和P62的表达情况为对照组进行结果分析。结果采用免疫组织化学法检测Beclin1蛋白在影响组织及癌旁正常组织中呈阳性的表达率分别为27.8%、91.7%;LC3蛋白的阳性表达率则为36.1%、75%;P62蛋白的阳性表达率是77.8%、47.2%。结论自噬相关蛋白Beclin1、LC3和P62参与了进展期胰腺癌的发展,胰腺癌自噬蛋白中Beclin1与LC3表达水平具有正比例关系,P62表达水平则与TNM分期相关。     

慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织自噬相关蛋白的变化

目的研究在慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)大鼠肺组织中自噬相关蛋白的变化。方法单纯烟熏法构建慢阻肺大鼠动物模型,采用Real time PCR,Western blot技术检测检测大鼠肺组织中PI3K、AKT、p-AKT、m TOR、p-m TOR及自噬相关基因LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5、Beclin1、P62、Atg7、Atg12的mRNA及蛋白表达,探讨在慢阻肺大鼠肺组织中自噬水平及自噬相关蛋白的变化。用LC3B免疫组化比较COPD组与正常大鼠间自噬水平的变化。结果 Real time PCR分析结果显示,与正常组相比,慢阻肺组大鼠肺组织中自噬相关基因Beclin1、Atg5、Atg12的mRNA表达显著增高(P0.05,其中Beclin1、Atg5两组比较P0.01)。Atg7的mRNA表达在慢阻肺组与正常组之间差异无统计学意义(P0.05)。Western blot分析结果显示,慢阻肺组大鼠肺组织中PI3K蛋白、p-AKT/AKT及p-m TOR/m TOR蛋白表达显著降低(P0.05)。自噬相关基因LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5、Beclin1蛋白表达增高(P0.05,其中LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5两组比较P0.01)。P62蛋白表达显著下降(P0.01)。LC3B免疫组化显示,慢阻肺组LC3B表达高于正常组。结论烟熏12周的慢阻肺大鼠与正常组相比,自噬通路上游蛋白PI3K、p-AKT/AKT、p-m TOR/m TOR的表达降低,自噬蛋白表达增加,自噬水平增加。     

ICAM-1在慢性牙周炎牙龈成纤维细胞中的表达

目的 :研究细胞间粘附分子 1(intercellularadhesionmolecule 1,ICAM 1)在慢性牙周炎牙龈组织中成纤维细胞中的表达及意义。方法 :应用碱性磷酸酶 抗碱性磷酸酶的免疫组织化学技术 ,对ICAM 1在正常和慢性牙周炎牙龈组织中的成纤维细胞中的表达进行分析。结果 :正常牙龈和慢性牙周炎牙龈组织中的成纤维细胞均表达ICAM 1,慢性牙周炎牙龈组织单位面积中表达ICAM 1阳性的成纤维细胞数目占成纤维细胞数目的比例显著高于正常牙龈组 (P <0 .0 0 1)。结论 :牙龈成纤维细胞可能参与和调节慢性牙周炎牙龈组织中ICAM 1介导的免疫粘附过程     

自噬相关蛋白在肾透明细胞癌与癌旁组织中表达状况对比

目的:对比自噬相关蛋白在肾透明细胞癌与癌旁组织中表达状况。方法:选取2016年3月20日-2017年3月20日本院收治的50例实施根治性肾切除术患者为研究对象,手术过程中切取患者两部分组织,一部分为癌变组织,一部分为癌旁组织(即正常组织),且将其制作为标本,对其进行免疫组化染色测定、组织芯片制作、IMAGE PRO PLUS6.0软件测量,并对自噬相关蛋白表达水平变化进行相关性分析。结果:从免疫组化染色评分角度分析,肿瘤组织的ATG7(1.36±0.58)、LC3(2.05±0.36)、Beclin 1(0.55±0.32)水平均低于正常组织[(2.63±0.78)、(3.48±0.45)、(2.47±0.69)],而ULK1(3.69±0.45)、P62(3.54±0.37)、P-m TOR(2.99±0.85)均高于正常组织[(2.69±0.35)、(2.31±0.45)、(2.05±0.36)],差异均有统计学意义(P0.05),肿瘤组织和正常组织的ATG5值分别为(2.67±0.54)、(2.45±0.66),差异无统计学意义(P0.05);从IMAGE PRO PLUS6.0软件测量结果角度分析,肿瘤组织的ATG7(0.029±0.010)、LC3(0.021±0.010)、Beclin 1(0.003±0.006)、P-m TOR(0.038±0.019)均低于正常组织[(0.034±0.020)、(0.043±0.015)、(0.023±0.016)、(0.031±0.013)],而P62(0.029±0.018)、ULK1(0.032±0.014)均高于正常组织(0.020±0.009、0.025±0.010),差异均有统计学意义(P0.05),肿瘤组织和正常组织的ATG5值分别为(0.034±0.020)、(0.043±0.010),差异无统计学意义(P0.05);根据自噬相关蛋白表达水平变化的相关性分析结果,P-m TOR、LC3、P62的表达与ATG7的表达水平变化有关,Beclin 1的表达与其他蛋白不相关,ULK1的表达变化与ATG7和P62相关。结论:自噬的表达水平在肾透明细胞癌中表现为下调状态,而其下调可受到ATG7、LC3、Beclin 1、ULK1、P62、P-m TOR等多种自噬相关蛋白协同影响。     

小鼠骨髓间充质干细胞自噬与衰老的关系

目的 探讨小鼠骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）自噬与衰老的关系。方法 通过体外分离培 养年轻组小鼠（8 周龄）和老年组小鼠（18 个月龄）BM-MSCs,流式细胞术检测细胞表型,TUNEL 染色检 测细胞凋亡,ELISA 试剂盒检测BM-MSCs 分泌蛋白VEGF、bFGF、IGF-1、HGF 的表达,Western blot 检 测自噬相关蛋白LC3- Ⅰ、LC3- Ⅱ、Beclin 1、ATG12-5、p62 及信号通路蛋白p-Akt、Akt、p-mTOR、 mTOR 的表达。结果 与年轻组比较,老年组BM-MSCs 凋亡增加（P <0.05）,分泌功能下降（P <0.05）,自 噬相关蛋白LC3- Ⅰ、LC3- Ⅱ、Beclin 1、ATG12-5 表达水平下降（P <0.05）,相反p62 蛋白表达水平升高 （P <0.05）,自噬信号通路相关蛋白p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR 表达升高。结论 老年小鼠BM-MSCs 凋亡增加,自噬活性及旁分泌功能下降。     

自噬相关蛋白及基因在非小细胞肺癌中的表达及其意义

目的检测非小细胞肺癌患者肺组织标本中自噬相关基因和蛋白的表达情况。方法标本取自临床疑诊为非小细胞肺癌行手术切除的肺组织,其中肺癌组为病理诊断为非小细胞肺癌的组织,正常组为远离肺部病灶5 cm以外的组织(肺癌组29例,正常组32例)。采用Western blot检测自噬相关蛋白ATG5、LC3B、p62的蛋白表达情况;采用实时–聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测肺癌组织、正常组织中自噬相关基因ATG5、p62mRNA的表达情况。结果 Western blot结果显示自噬相关蛋白ATG5和p62在肺癌组中表达量增加,显著高于正常组(P0.05);LC3B在肺癌组织中表达量显著低于正常组织(P0.05)。RT-PCR结果显示肺癌组的ATG5、p62 mRNA水平均显著高于正常组(P0.05)。ATG5、LC3B、p62的蛋白相对表达量在性别、年龄、吸烟史、肿瘤部位、肿瘤大小、肿瘤病理类型、分化程度以及肿瘤TNM分期各组间差异无统计学意义(P0.05)。ATG5的蛋白表达量在淋巴结是否转移组间差异有统计学意义(P0.05);LC3B、p62蛋白表达量在淋巴结是否转移组间差异无统计学意义(P0.05)。结论自噬在肺癌的发生中发挥一定的作用。自噬相关基因和蛋白若能够正确有效调控,可能会对未来临床治疗方面提供新的依据和靶点。     

上皮性卵巢癌组织中ATG5、Beclin1与P53的表达及相关性研究

目的检测自噬相关基因ATG5、Beclin1与凋亡相关基因P53在上皮性卵巢癌、良性卵巢肿瘤及正常卵巢组织的表达情况,探讨其与卵巢癌发生、发展的相关性及意义。方法应用免疫组化SP法和RT-PCR技术检测25例正常卵巢、25例良性卵巢肿瘤及34例上皮性卵巢癌组织中ATG5、Beclin1、P53蛋白及mRNA的表达,并结合临床病理因素进行分析。结果 1ATG5、Beclin1的表达主要在细胞质内,P53主要表达在胞核内。ATG5、Beclin1在正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤组织及卵巢癌组织中的表达阳性率两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。P53在卵巢癌组织中的表达阳性率与良性卵巢组织、正常卵巢组织相比,差异有统计学意义(P<0.01),而良性卵巢组织与正常卵巢组织表达阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。不同临床分期、病理分期的卵巢癌组织中ATG5、Beclin1及P53的表达比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。Spearman相关性分析显示,上皮性卵巢癌组织中ATG5与Beclin1蛋白表达呈正相关,ATG5与P53、Beclin1与P53蛋白表达均呈负相关(P<0.05)。2经RT-PCR检测,上皮性卵巢癌组织中ATG5、Beclin1的表达低于良性卵巢肿瘤组织及正常卵巢组织,良性卵巢组织低于正常卵巢组织,差异均具有统计学意义(P<0.05)。上皮性卵巢癌组织中P53的表达高于良性卵巢组织及正常组织(P<0.05),但良性卵巢组织与正常卵巢组织相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论上皮性卵巢癌的发病、进展可能与自噬相关基因Beclin1和ATG5自噬活性的抑制有关;自噬相关基因ATG5、Beclin1与凋亡相关基因P53在上皮性卵巢癌的发生发展中起拮抗作用,对其联合检测有利于了解和判断上皮性卵巢癌的进展程度、预后情况及指导治疗。     

miR-424通过调控ATG14的表达抑制肝癌细胞的自噬和增殖

目的 研究miR-424通过调控ATG14表达影响自噬和肝癌细胞增殖。方法 收集肝癌患者因手术切除的肝癌组织及其癌旁组织,采用 qRT-PCR 法检测肝癌组织中 miR-424-5p,ATG14 的表达。培养人肝癌细胞系 HepG2、SMMC-7721、Huh-7、MHCC97H、HCCLM3和人正常肝细胞LO2,qRT-PCR法检测上述各细胞系的miR-424-5p表达,选取表达量较高的Huh-7和表达量较低的HCCLM3肝癌细胞为研究对象,Huh-7细胞实验分组（n=3）：干扰miR-424-5p表达阴性对照组（in-NC组）,干扰miR-424-5p表达组（in-miR-424-5p组）;HCCLM3细胞实验分组（n=3）：过表达miR-424-5p组（mi-miR-424-5p组）,另设过表达miR-424-5p阴性对照组（mi-NC组）;过表达miR-424-5p阴性对照+过表达ATG14阴性对照组（mi-NC+NC组）;过表达miR-424-5p阴性对照+过表达ATG14组（mi-NC+ ATG14组）;过表达miR-424-5p +过表达ATG14阴性对照组（mi-miR-424-5p+NC组）;过表达miR-424-5p +过表达ATG14组（mi-miR-424-5p +ATG14组）。qRT-PCR法及Western blot法验证各组miR-424-5p和ATG14的转染情况。采用MTT法检测各组细胞的细胞增殖,流式细胞术检测各组细胞的细胞凋亡水平,Western blot检测各组细胞的ATG14和自噬相关蛋白LC3、Beclin1和P62的表达水平,双荧光素酶报告基因实验检测miR-424-5p和ATG14之间的相互作用。结果 在肝癌组织和细胞中ATG14高表达,miR-424-5p低表达。与相应对照组相比,过表达miR-424-5p抑制肝癌细胞增殖和促进凋亡（P<0.05）;干扰miR-424-5p表达及过表达ATG14促进肝癌细胞增殖和抑制凋亡（P<0.05）;miR-424可能通过靶向ATG14发挥抑癌的作用。干扰miR-424-5p表达及过表达ATG14均能提高肝癌细胞自噬体标志蛋白LC3-ΙΙ/LC3-Ι、Beclin1的表达水平（P<0.05）,降低自噬受体蛋白P62的表达水平（P<0.05）;过表达miR-424-5p则降低肝癌细胞自噬体标志蛋白LC3-ΙΙ/LC3-Ι、Beclin1的表达水平（P<0.05）,提高自噬受体蛋白P62的表达水平（P<0.05）。结论 miR-424调控ATG14表达影响自噬,从而抑制肝癌细胞增殖。     

铅暴露时间对大脑皮质ATG5、Beclin1、 LC3B 表达的影响

目的 通过复制成年动物铅暴露模型,研究铅暴露时间长短对大脑皮质自噬蛋白ATG5、 Beclin1、LC3B 表达的变化。方法 选取18 只豚鼠随机分为4 组：对照组（3 只）,以及铅暴露15、60 和 90 d 组（每组5 只）。用0.2% 醋酸铅饮用水复制动物铅暴露模型,对照组给予等量的生理盐水喂养;免疫组 织化学法检测ATG5、Beclin1 和LC3B 的表达。结果 与对照组相比,不同时间铅暴露组自噬蛋白ATG5、 Beclin1 和LC3B 的阳性表达升高（P <0.05）。铅暴露90 d 组的ATG5 表达水平与各暴露组比较,差异有统 计学意义（P <0.05）。铅暴露15 d 组与60 d 组的ATG5 表达水平比较,差异无统计学意义（P >0.05）。各暴 露组Beclin1 和LC3B 蛋白水平比较,差异无统计学意义（P >0.05）。结论 环境铅饮用水可通过自噬蛋白 ATG5、Beclin1 及LC3B 引起大脑皮质区的自噬反应,推测铅暴露激活的早期自噬反应可能对大脑皮质发挥 神经毒性作用,对成年豚鼠大脑造成不可逆转的损害。     

H-RasV12诱导的人成纤维细胞早期衰老中自噬的调节

目的研究癌基因H-RasV12过度表达或激活与自噬活性的关系,在人成纤维细胞中观察Ras过度表达对自噬活性的影响。方法在BJ人成纤维细胞中转染原癌基因H-RasV12或其空载体,通过形态学、细胞生长曲线、β-半乳糖苷染色、衰老和自噬相关蛋白表达、流式细胞分析、siRNA(small interfering RNA,siRNA)抑制自噬关键基因5(ATG5),来分析Ras过度表达的细胞效应。结果与对照细胞相比,H-RasV12过度表达的BJ细胞出现明显的早期衰老,其自噬活性受到抑制,表现为蛋白p62和微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(Light chain 3Ⅱ,LC3Ⅱ)的显著蓄积,在研究时间区间内这种抑制作用保持稳定,同时细胞凋亡率增加;利用siRNA抑制ATG5表达,抑制自噬可进一步加重衰老。结论人成纤维细胞稳定表达癌基因H-RasV12后,可出现自噬活性受到抑制的现象,且自噬抑制处于自噬过程的后期。这一现象可能与Ras相关性癌症的癌变机制有关。     

自噬相关蛋白Beclin1和LC3在结肠癌组织中的表达及临床意义

目的探讨自噬相关蛋白Beclin1和LC3在结肠癌组织中的表达及临床意义。方法收集2011年1月—2014年1月结肠癌患者80例,取结肠癌组织标本及相应的正常组织标本各80份。用免疫组化法检测结肠癌和正常结肠组织中自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达,分析二者和结肠癌临床病理学参数,包括年龄、分化程度、TNM分期和淋巴结转移等的关系。结果结肠癌和正常结肠组织中Beclin1的阳性表达率分别为33.8%(27/80)、73.8%(59/80),LC3阳性表达率分别为22.5%(18/80)、68.8%(55/80),Beclin1和LC3在结肠癌的阳性表达率显著低于正常结肠组织(P<0.01)。不同年龄、分化程度结肠癌组织中Beclin1和LC3的表达差异无统计学意义(P>0.05),而不同TNM分期(P<0.01)和淋巴结转移结肠癌组织中Beclin1和LC3表达差异有统计学意义(P<0.01)。结论自噬相关蛋白Beclin1和LC3的低表达可能与结肠癌的发生发展和预后不良有关。     

自噬相关因子在结直肠腺癌中的表达及其与临床病理参数间的关系

  目的  探讨结直肠腺癌中自噬相关因子Unc-51样自噬激活激酶1(ULK1)、B细胞淋巴瘤2基因作用蛋白(Beclin1)、自噬标志物轻链3(LC3)的表达情况及其与临床病理参数的相关性。  方法  收集贵州医科大学附属医院病理科2020年1—12月资料完整的结直肠癌根治术标本共63例。采用免疫组化EnVision法检测肿瘤组织及相应癌旁组织中ULK1、Beclin1及LC3的蛋白表达情况,分析三者与患者年龄、性别、原发部位、神经侵犯、分化程度、淋巴结转移等临床病理资料的相关性。  结果  自噬相关蛋白ULK1、Beclin1、LC3主要表达于细胞质。与正常组织相比,肠腺癌组织中ULK1(71. 43% vs. 44. 44%)、Beclin1(66. 66% vs. 47. 61%)、LC3(55. 55% vs. 30. 15%)蛋白表达水平均明显升高(均P＜0. 05)。ULK1与肿瘤分化程度相关(P＜0.05),而Beclin1和LC3在肿瘤组织和正常组织之间差异无统计学意义(均P＞0.05)。三者与患者的年龄、性别、原发部位、大体类型、神经侵犯均无相关性。此外,ULK1、LC3与淋巴结转移有相关性(均P＜0.05),而Beclin1与淋巴结转移无相关性(P＞0.05)。  结论  结直肠癌中自噬相关蛋白表达水平增高,ULK1与组织分化程度相关;部分蛋白表达水平与有无淋巴结转移相关,提示自噬在结直肠腺癌中的表达增高可能是癌组织致病、转移的机制之一。对肿瘤组织自噬途径的干预,可能会解决结直肠癌复发和转移的一些问题。      

黄芪甲苷通过激活自噬抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导的PC12细胞凋亡

目的研究黄芪甲苷通过激活细胞自噬抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导PC12细胞凋亡的作用。方法取对数生长期的PC12细胞,随机分为7组:正常对照组、模型组、溶媒组、黄芪甲苷组、黄芪甲苷+自噬抑制剂组、自噬抑制剂组、自噬激活剂组。除正常对照组外,其余各组剥夺氧、糖3h后再复氧、复糖12 h,并于复氧、复糖的同时给予相应药物处理。用透射电镜观察自噬小体的变化,Western blot检测LC3-II、Beclin1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)的表达,流式细胞术和TUNEL染色检测细胞凋亡。结果与正常对照组相比,模型组出现典型的自噬小体,LC3-II、Beclin1表达均增多(P0.05),同时Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数也升高(P0.05)。与模型组相比,黄芪甲苷组、自噬激活剂组自噬小体数量、LC3-II和Beclin1表达均增多(P0.05),Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数均下降(P0.05);而自噬抑制剂组自噬小体数量、LC3-II和Beclin1表达减少(P0.05),Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数升高(P0.05);溶媒组与模型组之间无显著差异(P0.05)。与黄芪甲苷组相比,黄芪甲苷+自噬抑制剂组、自噬抑制剂组自噬小体数量、LC3-II和Beclin1表达均减少(P0.05),Caspase3表达、细胞凋亡率和凋亡指数均升高(P0.05)。结论黄芪甲苷可通过激活细胞自噬而抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导的PC12细胞凋亡,从而发挥神经保护作用。     

自噬相关基因在早产儿视网膜病变模型视网膜组织中的表达及临床意义

[目的]探讨自噬相关基因P62、微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(microtubule associated protein light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)和自噬相关基因5(autophagy related genes 5,ATG5)在早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity,ROP)动物模型视网膜组织中的表达情况及其临床意义。[方法]将18只出生7d的C57BL/6乳鼠分为3组,ROP模型组6只乳鼠放入高氧装置构建ROP模型,自噬干预组6只乳鼠玻璃体腔注射自噬激活剂雷帕霉素(rapamycin,RAPA)后放入高氧装置,正常对照组6只乳鼠饲养在正常环境中。采用荧光造影视网膜血管灌注观察各组小鼠视网膜血管的变化;定量即时聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测各组P62、LC3-Ⅱ和ATG5的mRNA表达水平的变化。[结果]ROP模型构建成功,ROP模型组小鼠视盘周围大片无灌注区,周边视网膜血管异常迂曲;自噬干预组玻璃体腔注射RAPA后,视盘周围无灌注区减少。与正常对照组比较,ROP模型组P62 mRNA表达升高(P0.01),LC3-Ⅱ和ATG5 mRNA表达降低(P0.05,P0.05);与ROP模型组比较,自噬干预组P62 mRNA表达降低(P0.05),而LC3-Ⅱ和ATG5 mRNA表达水平升高,但差异无统计学意义(P0.05,P0.05)。[结论]ROP的发生发展可能与视网膜组织自噬活性降低有关。     

自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ、Atg5在前列腺腺癌组织中的表达及意义

目的探讨自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ、Atg5在前列腺腺癌（PCa）中的表达情况及其临床意义。方法收集60例PCa标本（观察组）和15例良性前列腺增生（BPH）标本15例（对照组）。应用免疫组化法检测PCa组织和BPH组织中Beclin1、LC3-Ⅱ、Atg5的表达情况,比较两组间的差异;分析PCa组织中Beclin1、LC3-Ⅱ、Atg5蛋白的表达情况与PCa的Gleason评分、血清PSA水平、淋巴结转移、骨转移等临床参数之间的关系。结果PCa组织中Beclin1、LC3-Ⅱ阳性表达率（38.3%、33.3%）明显低于BPH组织（60.0%、53.3%）,而PCa组织中Atg5阳性表达率（83.3%）显著高于BPH组织（6.7%）,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。Beclin1与LC3-Ⅱ的表达呈正相关,两者与Gleason评分、血清PSA水平、淋巴结转移、骨转移有关（均P＜0.05）,而与年龄无关（P＞0.05）。Atg5的表达与年龄、Gleason评分、血清PSA水平、淋巴结转移、骨转移均无关（均P＞0.05）。结论自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ、Atg5在PCa中的异常表达,提示自噬活动增强和自噬体形成增多在PCa发展过程中起着重要作用。     

2-甲氧雌二醇对低氧条件下皮肤成纤维细胞自噬水平及纤维化的影响

 目的  研究2-甲氧雌二醇(2-methoxyestradiol, 2-ME)对低氧条件下人皮肤成纤维细胞自噬水平及纤维化的影响。方法  原代培养健康人皮肤成纤维细胞并传代, 取第3～6代细胞, 在低氧(1% O2)条件下培养。使用2-ME (0、5、10、25 μmol/L)和自噬抑制剂Bafilomycin A1 (0、5、10、50 nmol/L)干预, 采用Western blot法检测I型胶原(collagen type Ⅰ)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)、低氧诱导因子-1α (hypoxia-inducible factor 1alpha, HIF-1α)、自噬标志物微管相关蛋白1轻链3 (LC3)及 P62的水平, 采用免疫荧光法检测LC3的水平。结果  成纤维细胞低氧培养24 h后, HIF-1α、Ⅰ型胶原、CTGF和LC3Ⅱ蛋白质水平显著升高, P62蛋白质水平降低, LC3免疫荧光信号显著增强。Bafilomycin A1干预组成纤维细胞I型胶原和CTGF水平降低, HIF-1α、LC3Ⅱ和P62水平升高, LC3免疫荧光信号增强, 该效应呈浓度依赖性。2-ME干预组成纤维细胞HIF-1α、Ⅰ型胶原、CTGF和LC3Ⅱ蛋白质水平降低、P62蛋白质水平升高, LC3免疫荧光信号减弱, 该效应呈浓度依赖性。结论  低氧条件下2-ME通过下调细胞自噬抑制皮肤成纤维细胞纤维化。     

RNA干扰抑制Beclin1基因对裸鼹鼠成纤维细胞增殖与凋亡的影响研究

目的 应用RNA干扰技术抑制自噬调控基因Beclin 1的表达,检测Beclin 1表达对裸鼹鼠皮肤成纤维细胞增殖与凋亡的影响以及P53、BAX、Bcl2等基因表达的影响。方法 分别检测裸鼹鼠成纤维细胞经饥饿、H2O2刺激等处理后Beclin 1的表达,然后采用设计的Beclin l基因的干扰RNA及阴性对照分别瞬时转染裸鼹鼠成纤维细胞。采用Real-time PCR及Western blot法检测沉默效果后,采用CCK-8实验检测沉默后细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,然后采用Western blot检测相关基因蛋白表达水平。结果 饥饿与H2O2刺激均能导致Beclin 1表达水平的改变。采用gene expresso转染试剂对裸鼹鼠皮肤成纤维细胞转染效率可达到90%以上,Real-time PCR及Western Blot结果显示所设计的Beclin 1 siRNA可有效降低Beclin 1的表达。Beclin 1基因沉默后,裸鼹鼠皮肤成纤维细胞增殖抑制率均显著高于对照组,细胞早期凋亡与晚期凋亡率均显著升高,同时P53、BAX、Bcl2、LC3B、p-AKT、mTOR 等表达量下降。结论 Beclin 1在裸鼹鼠成纤维细胞抵抗饥饿、H2O2刺激等过程中表达量显著变化,同时抑制Beclin 1的表达,可抑制裸鼹鼠细胞细胞增殖,促进其凋亡,这提示Beclin 1基因对裸鼹鼠自噬、增殖、凋亡起到调控作用。     

高迁移率族蛋白B1对宫颈癌细胞化学治疗敏感性的影响及其机制

目的：探讨高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1,HMGB1)对宫颈癌细胞化学治疗敏感性 的影响及其机制。方法：采用Western印迹法检测宫颈癌细胞HeLa和CaSki经不同药物浓度顺铂处理后LC3, Beclin1及P62的表达水平,检测使用自噬抑制剂和/或顺铂处理后宫颈癌细胞HeLa和CaSki中LC3,Beclin1及P62 的表达水平;采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞增殖水平。构建HeLa-shHMGB1,CaSki- shHMGB1,HeLa-CTR及CaSki-CTR的稳定细胞系。以CCK-8检测上述细胞系顺铂半数抑制浓度(half maximum inhibitory concentration,IC50)水平;Western印迹法检测上述细胞系中HMGB1, LC3,Beclin1及P62的表达水 平。结果：在一定浓度范围内,随着顺铂药物浓度的增加,宫颈癌细胞HeLa和CaSki中LC3及Beclin1的表达 增加,P62表达降低。与单用顺铂组相比,顺铂联合自噬抑制剂组细胞存活率更低(P<0.05)。在宫颈癌细胞 中,HMGB1的表达与顺铂药物敏感性有关(P<0.05),与LC3,Beclin1表达呈正相关,与P62表达呈负相关。 结论：HMGB1可能通过调控宫颈癌细胞内自噬的水平,影响其对顺铂的敏感性。铂类药物结合自噬抑制剂可能成为 宫颈癌治疗的新策略。HMGB1可能成为预测化学治疗药物敏感性的分子标志物。     

Beclin1和p62在结肠癌组织中的表达及临床意义

目的 探讨Beclin1和p62在结肠癌组织中和正常结肠黏膜的表达差异以及临床意义。 方法 采用免疫组织化学法对42例结肠患者癌组织以及正常黏膜组织中Beclin1以及p62的阳性表达率进行检测。比较不同病理资料中Beclin1以及p62的表达差异,并随访5年生存率,Cox回归分析影响结肠癌患者死亡的危险因素。运用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析,P<0.05为差异有统计学意义。 结果 Beclin1在正常肠黏膜中表达阳性率高于癌组织,另外在T1~T2期中的阳性表达率高于T3~T4期的阳性率,以上差异有统计学意义(P<0.05)。p62蛋白在癌组织中表达升高,在正常组织中表达降低,2组间差异有统计学意义(P<0.05)。Cox回归分析显示,对于结肠癌的患者,p62是患者死亡的危险因素,联合使用p62以及Beclin1是预测结肠癌预后的良好指标。 结论 结肠癌患者的自噬活性降低,Beclin1与CEA的表达水平以及肿瘤的浸润深度有关,联合应用Beclin1以及p62可以较好地预测结肠癌患者的预后。      

沉默NUPR1基因对人多发性骨髓瘤U266细胞自噬的影响及机制研究

目的：探讨沉默核蛋白1（nuclear protein 1,NUPR1）对人多发性骨髓瘤U266细胞自噬的影响及可能机制。方法：以正常人骨髓单个核细胞为对照,采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）检测人多发性骨髓瘤U266细胞NUPR1和自噬相关基因（ATG5和Beclin1）mRNA水平。构建含有靶向抑制NUPR1基因表达的小发夹RNA（small hairpin RNA,shRNA）序列的NUPR1-shRNA慢病毒载体,并将其转染人多发性骨髓瘤U266细胞。实验分为未转染组、阴性对照转染组和转染组,qRT-PCR、Western Blot检测NUPR1干扰效果、3组细胞自噬相关指标（ATG5、Beclin1、P62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ） 及相关通路蛋白（p-AKT/T-AKT、p-mTOR/T- mTOR）的表达;单丹磺酰戊二酸（monodansylcadaverine,MDC）染色后,荧光显微镜下观察自噬囊泡的聚集。结果：人多发性骨髓瘤U266细胞较正常人骨髓单个核细胞及转染组细胞NUPR1（F=7.747,P=0.004）、Beclin1（F=5.548,P=0.013）和ATG5（F=4.031,P=0.034） mRNA水平明显增高。转染组NUPR1（F=9.798,P=0.013）、ATG5（F=7.017,P=0.027）、Beclin1（F=7.213,P=0.025）和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ（F=7.040,P=0.027）蛋白表达较未转染组和阴性对照转染组明显降低,而P62（F=52.622,P=0.000）、p-AKT/T-AKT（F=6.584,P=0.031）和p-mTOR/T- mTOR（F=7.950,P=0.021）蛋白表达明显增高;转染组细胞胞质内自噬囊泡聚集明显减少（F=12.172,P=0.008）。结论：人多发性骨髓瘤U266细胞NUPR1高表达,自噬水平较正常人骨髓单个核细胞高。沉默NUPR1可下调U266细胞自噬水平。NUPR1基因可能通过AKT/mTOR通路调节U266细胞自噬。