原代心肌细胞培养

目的:探讨SD大鼠乳鼠心肌细胞的分离及培养方法,并进行形态学观察。方法:取出生1～3 d的SD大鼠的乳鼠,胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶分别消化心肌组织,差速贴壁法分离心肌细胞,并加入适量BrdU纯化心肌细胞,显微镜下观察心肌细胞形态及纯度。结果:成功分离培养心肌细胞并观察其形态,计算存活率92%,纯度90%,2～3 d出现同步搏动。结论:胰蛋白酶联合Ⅱ型胶原酶消化可分离存活率较高的心肌细胞,用差速贴壁法并加入适量BrdU可纯化心肌细胞,使细胞搏动良好。     

The culture of primary cardiac cells

目的:探讨SD大鼠乳鼠心肌细胞的分离及培养方法,并进行形态学观察.方法:取出生1～3d的SD大鼠的乳鼠,胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶分别消化心肌组织,差速贴壁法分离心肌细胞,并加入适量BrdU纯化心肌细胞,显微镜下观察心肌细胞形态及纯度,结果:成功分离培养心肌细胞并观察其形态,计算存活率92％,纯度90％,2～3d出现同步搏动.结论:胰蛋白酶联合Ⅱ型胶原酶消化可分离存活率较高的心肌细胞,用差速贴壁法并加入适量BrdU可纯化心肌细胞,使细胞搏动良好.     

SD乳鼠原代心肌细胞培养方法的改进

目的:探讨SD乳鼠原代心肌细胞最佳分离、纯化及培养方法,以提供可靠的心肌细胞模型。方法:用含0.1%的胰蛋白酶及0.1%Ⅱ型胶原酶的酶混合液分离乳鼠心脏组织,并用差速贴壁分离法和5-溴脱氧尿核苷抑制法进行纯化,用台盼蓝染色法检测细胞的存活率,倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化,免疫组织化学染色方法检测心肌细胞的纯度。结果:台盼蓝染色观察细胞存活率达(96.9±8.9)%以上。显微镜下心肌细胞由圆形渐变为梭形、多边形,逐渐形成细胞簇,搏动频率约120～150次/min。用抗横纹肌肌动蛋白单克隆抗体鉴定心肌细胞,阳性率为(90.5±1.6)%。结论:本方法所获SD乳鼠的心肌原代细胞纯度高、活力强。     

乳鼠心肌细胞体外培养的探讨

目的研究乳鼠心肌细胞培养的方法,以提高心肌细胞的单细胞收获率、存活率及搏动率。方法用机械解离法和酶消化法分离乳鼠心脏组织,并用差速黏附贴壁法和化学药物抑制法进行纯化,然后在倒置相差显微镜下动态观察细胞形态。结果第1天心肌细胞几乎全部贴壁,少数细胞出现自发性搏动;第3天形成细胞簇或细胞单层,收缩明显而有力。结论本方法单细胞收获率、存活率高,心肌细胞和非心肌细胞分离彻底,是比较理想的培养方法。     

新生大鼠原代心肌细胞的培养

目的高效获得乳鼠原代心肌细胞。方法取新生24 h乳鼠心脏,剪碎后单独用质量分数为0.08%的胰蛋白酶进行多次消化、细胞洗涤获得心肌细胞。台盼蓝染色后观察心肌细胞存活率。以搏动细胞数占视野中细胞总数比例估测心肌细胞纯度。结果获得的原代心肌细胞存活率>85%、纯度>95%。结论通过上述方法可获得较高存活率及纯度的原代心肌细胞,该培养方法简单易行,重复性好,基本能满足实验要求。     

原代乳小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定

目的建立原代乳小鼠心肌细胞的培养方法,评价心肌细胞的存活状况并鉴定心肌细胞纯度。方法应用胰酶联合胶原酶共同消化3d内C57乳小鼠心脏,台盼蓝染色判断心肌细胞存活率,α-actin免疫荧光染色鉴定心肌细胞纯度。结果利用3d内乳鼠心脏可成功培养原代小鼠心肌细胞,台盼蓝染色显示细胞存活率大于95%,α-actin免疫荧光染色显示心肌细胞纯度达95%以上。结论严格控制实验条件,可成功培养高存活率和高纯度的小鼠心肌细胞。     

小鼠乳鼠心肌细胞的原代培养

目的:观察原代培养的小鼠乳鼠心肌细胞的形态特征。方法:Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶消化心脏组织,差速贴壁分离法。结果:12 h心肌细胞基本贴壁,第2天可长成单层,第3~4天细胞伸出伪足相互接触交织成网,逐渐形成细胞簇或细胞单层,搏动呈同步性,收缩明显有力,搏动频率为30~120次/min。结论:用Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶分离培养小鼠乳鼠心肌细胞可获得形态、活力良好的心肌细胞。     

Balb/c乳鼠心肌细胞的分离和体外培养方法的优化

目的 探讨Balb/c乳鼠心肌细胞分离和培养方法,优化出Balb/c乳鼠心肌细胞分离和培养的方法.方法 取乳鼠心脏,采用胰酶和胶原酶Ⅱ消化方法分离乳鼠心肌细胞,比较消化次数和消化时间对原代乳鼠心肌细胞培养的影响.结果 原代培养的Balb/c乳鼠心肌细胞生长迅速、自行搏动,细胞形态完整,细胞内肌丝、线粒体清晰.分离细胞时消化次数最好控制在不多于6次,每次消化时间不超过20min.2h差速贴壁可以提高心肌细胞纯度,经肌动蛋白鉴定,心肌细胞达94.6%.结论 本研究优化了分离和原代培养Blab/c乳鼠心肌细胞的方法.     

新生SD大鼠心肌细胞的原代分离和培养

目的:建立简便有效的心肌细胞分离和原代培养方法,获得具有理想数量和活性的原代心肌细胞。方法:无菌条件下取出生72h内的新生SD大鼠心脏,去除心肌结缔组织和心房组织,只保留左心室,采用胰酶和胶原酶Ⅰ联合消化、差速贴壁分离的方法,获得心肌细胞进行体外培养,观察细胞的形态变化,对细胞的搏动频率、搏动细胞数进行统计分析。结果:分离的原代心肌细胞生长良好,核仁清晰可见。高倍镜下观察,心肌细胞接种12h后,少数细胞贴壁生长,且贴壁的少数单个细胞出现自发搏动,之后搏动细胞数以及细胞搏动频率都逐渐增加,接种48h后细胞完全铺展开来并连接成片,自发搏动呈现同步性和岛屿状。结论:本实验方法获得的新生SD大鼠心肌细胞生长状态好,细胞存活率和自发搏动性高,操作简单,重复性好,是一种理想、可靠的原代心肌细胞培养方法。     

乳鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞的原代培养

目的:探讨一种简便、可靠的乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞培养方法。方法:以组织块酶消化法分离细胞,通过差速贴壁分离法收集、培养乳鼠心肌细胞和成纤维细胞。普通光学显微镜观察心肌细胞和成纤维细胞的基本特征及生长特性的变化。结果:心肌细胞12 h基本贴壁、1~3天形成细胞簇并出现同步搏动,心肌细胞纯度为93%;心肌成纤维细胞第3~6代细胞生长良好,纯度达98%以上。结论:建立的乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞体外培养方法是成熟、可靠的。     

小鼠脑内星形胶质细胞体外培养方法的优化

目的： 优化小鼠脑内星形胶质细胞的体外培养方法,为星形胶质细胞的功能研究奠定实验基础。 方法： 取新生0～1 d的C57BL/6乳鼠大脑皮质,胰酶消化结合机械吹打方法,分离皮质细胞,制成细胞悬液并差速贴壁处理,待细胞接种24 h轻柔换液,以后每隔2～3 d换液,且每次换液前手动振荡洗涤2次,传代3次后,行胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）免疫细胞化学染色及免疫荧光染色鉴定。 结果： 经过原代及传代培养,获得形态典型、纯度在95%以上的星形胶质细胞。结论： 优化后的体外培养星形胶质细胞方法,稳定有效,操作简便易行,并可获得高纯度的星形胶质细胞。     

大鼠海马神经元及星形胶质细胞的体外培养

目的：改进大鼠海马神经元、星形胶质细胞及两者混合状态的体外培养方法,获得高纯度的海马神经细胞。方法：选取孕期18~20 d 的SD 大鼠胎鼠作为原代海马细胞培养的材料来源。断头后于冰板上剥离双侧海马,去除表面血管及薄膜,利用眼科剪分离为小块。随后使用冷平衡盐溶液洗涤3 次,将海马组织碎块移入酶消化液中。本方法选择Accutase 和0.1% DNase 作为酶消化液,37 ℃消化 15 min,期间轻柔振动。使用冷平衡盐溶液洗涤3 次,终止消化。0.1% DNase 加入Neurobasal 和B-27 的混合液对消化后的海马组织碎块进行轻柔吹打,获得单细胞悬液。将悬液过200 目筛,进行细胞计数。将过筛的单细胞悬液移入DMEM 培养基（DMEM+10%胎牛血清）中,按照每平方厘米2.5×104 的细胞密度进行接种。经PDL 孵育的塑料片置于培养基底部。细胞于37 ℃、5% CO2 培养箱内培养。4 h 后,依据所需细胞种类的不同,更换相应培养基。海马神经细胞于培养后7~10 d 可用于实验。结果：通过本方法可得到高纯度的大鼠海马神经细胞,且根据实验需求,通过更换培养基,可得到纯神经元、纯胶质细胞及两者混合的三种培养状态。培养的神经元及星形胶质细胞纯度均>98%。结论：该文在传统海马神经细胞体外培养方法基础上,进一步降低了实验操作难度,方法稳定有效。     

大鼠肺泡巨噬细胞原代培养技术的改良措施

目的改良原代肺泡巨噬细胞（alveolar macrophage,AM）培养技术,提高AM培养效果。方法SD大鼠,在体支气管灌洗肺获取AM,通过预先注射空气、14号注射器针头回收灌洗液、低速离心、种板前多次吹打等改良措施分离和培养AM。倒置显微镜连续观察AM的形态变化,台盼蓝拒染实验鉴定AM存活率,瑞氏-姬姆萨染色鉴定AM纯度。结果AM体外培养后40 min即见细胞贴壁;2～3天时,细胞形态多样,呈圆形、不规则形、梭形等形态,胞体变大,胞质丰富。台盼蓝拒染实验示AM存活率≥95%,瑞氏-姬姆萨染色示AM纯度≥95%。结论本实验改良了原代AM培养的技术方法,提高了原代AM培养效果。     

昆明种乳鼠肝细胞原代培养方法的比较研究

目的 通过比较3种昆明鼠乳鼠肝细胞原代培养的方法,探索一种更有效、快捷的原代培养方法。方法 取30只1~3日龄昆明种乳鼠,随机分为3组,分别采用组织块培养法、胰酶消化法、组织块联合胰酶消化法进行肝细胞原代培养,用倒置显微镜观察实验过程中肝细胞的形态及生长情况。结果 3种方法均能进行乳鼠肝细胞的原代培养,其中组织块联合胰酶消化法培养的肝细胞形态学和生物学特性优于其他两种方法培养的细胞。结论 组织块联合胰酶消化法是3种方法中最快速和高效的一种方法,获得的乳鼠肝细胞形态及生物学特性好,为体外建立乳鼠肝细胞实验模型奠定了实验基础。     

促凋亡蛋白Bid介导模拟缺血再灌注乳鼠心肌细胞的凋亡

目的：探讨促凋亡蛋白Bid在模拟缺血再灌注乳鼠心肌细胞凋亡中的作用及其可能的机制。方法：培养出生1～3 d的SD乳鼠心肌细胞,随机分为正常对照组、模拟缺血再灌注组、模拟缺血再灌注+无关siRNA组、模拟缺血再灌注+Bid特异siRNA组。各组心肌细胞经缺氧2 h,复氧4 h建立缺血再灌注损伤模型;脂质体转染法（Oligofectamine）转入Bid无关的siRNA及Bid特异的siRNA,转入Bid特异的siRNA以拆除Bid基因的表达;免疫印迹技术（Western blotting）检测心肌细胞中Bid及caspase-8的活化;流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测心肌细胞的凋亡率。结果：模拟缺血再灌注时心肌细胞Bid及caspase-8被活化。转染Bid特异siRNA组的心肌细胞caspase-8的活化较模拟缺血再灌注组及转染无关siRNA组均明显减少,心肌细胞凋亡率(7.4%)较模拟缺血再灌注组(51.2%)及转染无关siRNA组(48.7%)明显降低(P<0.01),而与正常对照组凋亡率接近(4.6%)。结论：促凋亡蛋白Bid介导了模拟缺血再灌注时心肌细胞的凋亡。     

密闭式吸痰在新生儿机械通气中的临床研究

目的：探讨在新生儿机械通气中气管内吸痰适宜方式。方法：2008年1月至2009年12月新生儿重症监护病房（NICU）机械通气的新生儿共164例,随机分为观察组和对照组,观察组86例,采用密闭式气管内吸痰,对照组78例,采用开放式气管内吸痰。观察两组在每次吸痰前、后新生儿心率、平均动脉压（MAP）、经皮测血氧饱和度（TcSO2）的变化,每天一次送检吸出痰液进行细菌培养。结果：观察组在吸痰后新生儿心率、MAP、TcSO2与吸痰前比较无明显改变,痰液细菌培养在持续机械通气24h无检出新菌株,48h检出率12.99%,3d检出率24.62%,7d检出率50.98%。而对照组在吸痰后新生儿心率、MAP与吸痰前比较明显升高,TcSO2与吸痰前比较明显降低,痰液细菌培养在持续机械通气24h检出率12.82%,48h检出率34.85%,3d检出率50.91%,7d检出率67.45%。结论：在新生儿机械通气中采用密闭式气管内吸痰更能稳定新生儿血流动力学,降低缺氧程度,缩短缺氧时间,降低院内感染,密闭式气管内吸痰更适合新生儿机械通气。     

新生猪缺氧后心肌连接蛋白Cx43表达的变化

目的探讨新生猪缺氧后心肌连接蛋白Cx43 mRNA和蛋白含量的变化。方法对照组(C组):新生猪6头,未吸入低氧;缺氧组(H组):新生猪6头,吸入低氧(FiO2=0.1)维持1 h。于缺氧结束后5 h,免疫荧光染色检测心肌组织细胞缝隙连接蛋白Cx43蛋白的表达,实时荧光定量逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)检测心肌组织Cx43 mRNA的表达。结果H组心肌组织Cx43蛋白的表达显著低于C组(P<0.01),但两组心肌组织Cx43 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论缺氧可导致心肌Cx43蛋白的表达或分布发生变化。     

血清饥饿对原代人脐静脉内皮细胞周期同步化的影响

目的探讨人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）的最佳饥饿条件,以建立高效稳定的 HUVECs体外分离提取方法,并为HUVECs相关实验提供研究基础。方法用0.1%Ⅱ型胶原酶灌注脐静脉腔消化15 min,收集 细胞并用内皮细胞专用培养基（含5%内皮细胞基础培养基、1%内皮细胞生长因子、1%青链霉素）,置37 ℃,5% CO2培养箱培 养。在倒置显微镜下观察细胞形态特点,并用细胞免疫荧光方法对所得细胞进行鉴定。用流式细胞术检测所得HUVECs的纯 度,并检测0%、0.1%、0.5%、1%血清浓度的培养基饥饿处理0、6、12、18、24 h对细胞周期的影响。结果0.1%Ⅱ型胶原酶消化可 以得到HUVECs,细胞培养呈典型的铺卵石状排列,细胞较密处呈涡旋状排列。免疫荧光检测细胞VIII因子相关抗原表达呈阳 性。流式检测细胞纯度高达99.67%。不同血清浓度培养基培养6 h可获得70%左右的G0/G1期细胞;培养12 h可获得80%~90% 的G0/G1期细胞;培养18、24 h 可获得95%左右的G0/G1期细胞。结论0.1%Ⅱ型胶原酶充盈静脉管腔可以获得高纯度的原代 HUVECs。完全无血清培养基培养12 h即可获得纯度超过80%的G0/G1期HUVECs。     

一种易操作的小鼠肝细胞的分离及培养方法

目的在传统肝细胞提取方法的基础上,优化一种易操作、快速实用获取小鼠肝细胞的方法,为从事肝脏功能相关研究人员提供改良的实验方法参考。方法以肝脏分离液逆向灌注小鼠肝脏后,剪碎,肝脏酶消化后密度梯度离心分离肝细胞,转入培养基培养。采用台盼蓝染色计算细胞活力,流式细胞检测技术计算纯度,倒置显微镜观察细胞形态。结果获得较高纯度和活力的肝细胞,具备肝细胞的典型形态特征。结论通过逆向灌注,降低了灌注的难度,同时获得较高纯度、较高活力的肝细胞,经多次实验证明该方法确实是一种易操作、高效适用的肝细胞提取方法。