Kartogenin对兔滑膜间充质干细胞增值及成软骨分化的对比研究

【】 目的 探讨Kartogenin(KGN)对兔滑膜间充质干细胞成软骨分化的作用方法 取6-10月龄新西兰大白兔(体重1.8~2.2kg)膝关节处滑膜分离培养SMSCs,通过形态学观察、流式细胞术对其进行鉴定.使用PELLET法,将聚丙烯管中的SMSCs团块分成3组,分别加入KGN,TGF-β3/BMP-2/地塞米松(Dexamethasone,DEX)以及二甲亚砜(DMSO)。通过比较增值速度、各组软骨微球的直径、重量,Ⅱ型胶原(免疫组织化学染色)表达,成软骨分化相关标志基因表达以及蛋白质合成量来评价KGN对SMSCs增值及成软骨能力的影响,结果 经鉴定,成功从兔膝关节滑膜分离出SMSCs。KGN对SMSCs增值能力弱于TGF-β3/BMP-2/DEX组,KGN组诱导产生的软骨微球直径最大,重量最重,均显著高于其他组(P<0.05),且Ⅱ型胶原合成量最多。qRT-PCR及Western Blot结果表明KGN组成软骨分和相关基因的表达水平最强,蛋白质合成量最大。结论 KGN促进SMSCs成软骨分化能力,但并没有增强SMSCs的增值能力。     

不同浓度葡萄糖对滑膜间充质干细胞成软骨能力调节作用的研究

目的研究分化前阶段不同浓度葡萄糖对滑膜间充质干细胞(SMSCs)成软骨能力的调节作用,并探究其分子调节机制。方法将分化前阶段SMSCs分组置于含有不同浓度葡萄糖的培养基中进行增殖培养:一组采用低浓度(1.0 g/L)葡萄糖培养SMSCs(LGMSMCs);另一组采用高浓度(4.5 g/L)葡萄糖培养SMSCs(HGMSMCs)。增殖培养7 d后,将两组SMSCs同时进行成软骨诱导分化,通过检测软骨标志基因的表达水平来评价两组SMSCs成软骨能力的大小;通过分析转化生长因子-β(TGF-β)和蛋白激酶-C(PKC)信号通路系统来研究其分子调节机制;设置平行实验,在高糖培养的SMSCs中加入PKC抑制剂G6983进一步研究TGF-β和PKC信号通路系统。不同浓度的葡萄糖培养基中分化前DNA总量,分化前、分化阶段的SMCSs成软骨相关基因的表达比较采用成组t检验。结果 SMSCs培养第21天,HGMSMCs组的蛋白聚糖(AGN)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)及Ⅱ型胶原(ColⅡ)的表达明显少于LGMSMCs组的(t=-3.69,P0.05;t=-77.57,P0.01;t=-34.42,P0.01);在SMSCs分化前阶段,GMSMCs组的TGF-βⅡ型受体(TGFβ-RⅡ)的表达明显高于LGMSMCs组的(t=4.5,P0.01);在SMSCs分化阶段,GMSMCs组的PKC磷酸化水平及TGF-βⅡ型受体(TGFβ-RⅡ)的表达明显低于LGMSMCs组的(t=-5.84,P0.01;t=-4.79,P0.01)。另外,在平行实验中,SMSCs分化前阶段,往高糖培养的SMSCs中加入PKC抑制剂G6983较未加入抑制剂更能上调SMSCs在分化阶段TGFβ-RⅡ的表达水平(t=-1.03,P0.05)。结论在SMSCs分化前阶段,低糖培养可以增加SMSCs成软骨能力;其分子机制是葡萄糖对分化前阶段TGF-β和PKC信号通路进行调节,进而调节分化阶段SMSCs成软骨能力。     

CD105+滑膜间充质干细胞成软骨能力

目的 分选CD105+滑膜间充质干细胞(SMSCs),观察其增殖和向软骨细胞分化的能力.方法 酶消化滑膜组织分离SMSCs,流式细胞仪分选CD105+ SMSCs;第3、7天采用WST-1测定SMSCs的增殖能力;软骨诱导21 d进行免疫组织化学染色,检测蛋白聚糖和Ⅱ型胶原.结果 酶消化获取的SMSCs为星形或梭形,分选后SMSCs形态无明显变化.免疫荧光显示分选组CD105+细胞较未分选组明显增多.WST-1增殖检测提示两组细胞吸光度值3 d(0.376±0.012、0.329±0.012)、7 d(0.581±0.009、0.524±0.007)比较差异有统计学意义(P＜0.05).成软骨诱导培养21 d后,分选组甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原染色均较未分选组多且深,说明CD105+ SMSCs合成更多软骨细胞外基质.结论 CD105+ SMSCs具有较强的增殖和成软骨能力,CD105+ SMSCs可成为软骨组织工程良好的种子细胞.     

TGFβ1和BMP2对培养兔关节软骨细胞增殖和分化的作用

目的：探讨TGFβ1和BMP2对培养兔关节软骨细胞增殖和分化的影响，从而了解其在关节软骨损伤修复及骨关节炎（OA）病理变化中的作用，方法：采用光电镜、免疫细胞化学、液烁计数、流式细胞仪分析细胞周期等方法观察软骨细胞的直微结构和增殖、分化及其特异性的表达。结果：TGFβ1显著增加了原代软骨细胞^3H-TdR的掺入和使其进入S-G2/M期细胞比例增加。而BMP2则对第5代软骨细胞有明显的促增殖作用。结论：TGFβ1能促进原代软骨细胞的增殖，但不能阻止其增殖能力随传代培养而减弱，而BMP2则显著促进了第5代软骨细胞的增殖，这可能与细胞的分化状态和细胞外基质（ECM）、细胞骨架等有关。     

人滑膜间充质干细胞的分离培养与鉴定

背景：软骨一旦损伤将很难自我修复,组织工程学修复损伤软骨是目前的研究热点。组织工程学中找到合适的“种子细胞”至关重要。滑膜间充质干细胞（SMSCs）因较其他来源的间充质干细胞成软骨能力、增殖能力更强,且细胞容易获取、对机体损伤小等优点,越来越受到研究者的青睐。 目的：探讨人SMSCs体外分离、培养的方法与步骤,探索对SMSCs进行鉴定的最新方法。 方法：关节镜下获取11例行关节镜手术患者的滑膜组织,按照Pei等[6]的方法分离培养滑膜干细胞;从细胞形态学观察、细胞生长曲线分析、CCK-8测定增殖活力、流式细胞仪检测细胞周期和细胞表面抗原、对SMSCs进行成脂/成骨/成软骨诱导、免疫细胞荧光染色以及RT-PCR检测成脂/成骨/成软骨相关基因的表达等方面对SMSCs进行鉴定。 结果与结论：按照Pei等的方法可以成功地从人滑膜组织中分离出干细胞,分离出的干细胞具有间充质干细胞特异性表型和多向分化潜能。     

膝关节滑膜间质干细胞分离、培养及其多向分化潜能特性的研究

目的 探讨晚期骨关节炎患者膝关节滑膜间质干细胞(synovium-derived mesenchymalstem cells,SMSCs)体外分离、培养的可行性及其在体外向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞定向分化的特性.方法 取膝关节滑膜组织,胶原酶消化获得有核细胞.挑选单细胞克隆,筛选获得SMSCs.流式细胞技术检测细胞表面特异性抗原标志.培养至第三代,分别向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞诱导分化.油红O染色鉴定向脂肪细胞分化;碱性磷酸酶染色、茜素红染色鉴定向成骨细胞分化;甲苯胺蓝染色鉴定向软骨细胞分化.RT-PCR检测脂肪细胞、成骨细胞标志基因.Ⅱ型胶原免疫组化染色检测软骨细胞Ⅱ型胶原的表达.结果 原代SMSCs体外培养呈葵花样细胞集落,传代后可见圆形巨噬样细胞和纺锤形成纤维样细胞,融合后呈成纤维细胞样生长.CD44、CD90呈阳性,CD34、CD71和CD45呈阴性.向脂肪细胞诱导21d,油红O染色阳性;RT-PCR检测有脂蛋白酶、乙二腈及PPARγ2表达;向成骨细胞诱导7、28 d,ALP,茜素红染色阳性,有ALP、Osteopontin及Osteocalcin表达;向软骨细胞诱导21d,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性.结论 晚期骨关节炎患者膝关节滑膜组织可以分离、培养获得SMSCs. SMSCs具有向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞发生定向分化的潜能.     

骨髓间充质干细胞复合纤维蛋白凝胶修复兔关节软骨缺损

目的观察骨髓间充质干细胞(MSCs)复合纤维蛋白凝胶(FG)对兔关节软骨缺损的修复效果。方法12只兔24个膝关节按左右分为实验组与对照组,抽取兔骨髓,密度梯度离心法分离间充质干细胞并行体外培养扩增,实验组以MSCs与FG及转化生长因子β1(TGFβ1)复合后填充到兔膝关节全厚软骨缺损模型中,而对照组以FG/TGFβ1填充,于术后12周取材,观察检测软骨缺损的修复情况。结果术后12周,实验组缺损由类透明软骨或透明软骨修复,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,甲苯胺蓝异染性明显,修复面较平整光滑;而对照组则以纤维软骨及纤维组织修复,Ⅱ型胶原免疫组化染色阴性。结论MSCs复合FG及TGFβ1能够修复兔关节软骨缺损。     

膝骨关节炎滑膜间充质干细胞多向分化及免疫抑制能力

目的观察骨关节炎(OA)患者膝关节滑膜来源的间充质干细胞(SMSCs)多向分化能力以及免疫抑制能力。方法无菌环境下通过关节镜取出中山大学孙逸仙纪念医院10例OA患者膝关节滑膜组织,分离培养出SMSCs,采用CCK-8法检测细胞增殖能力,通过成骨、成软骨和成脂肪诱导分化培养基对SMSCs诱导分化,于诱导第21天分别行茜素红、甲苯胺蓝和油红O染色。将SMSCs和CD3、CD28抗体刺激后的人外周血单核细胞(PBMC)进行共培养,通过流式细胞术对PBMC的增殖率进行检测,组间比较通过方差分析总体差异后再通过Bonferroni法进行组间两两比较。结果OA患者SMSCs第3天开始进入对数增长期,第7天细胞增殖进入平台期。SMSCs经过成骨、成软骨和成脂肪诱导分化后,茜素红、甲苯胺蓝和油红O染色均为阳性。SMSCs和CD3、CD28抗体刺激后的PBMC进行共培养5 d后,阴性对照组PBMC增殖率为(3.8±0.4)%,几乎不增殖,阳性对照组PBMC增殖率为(80.9±8.1)%,实验组PBMC的增殖率为(52.3±5.1)%,实验组与阳性对照组的差异具有统计学意义(t=8.97,P0.01)。结论 OA患者SMSCs同样具有多向分化能力和免疫抑制能力,可作为组织工程理想的种子细胞来源。     

转化生长因子β1缓释载体诱导骨髓基质干细胞成软骨分化

目的探讨转化生长因子β1（TGF—β1）缓释对骨髓基质干细胞诱导成软骨分化的影响。方法乳化交联法制备TGF—β1壳聚糖缓释微球并将其与壳聚糖支架复合，将骨髓基质干细胞置于复合载体中立体培养，通过HE染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、扫描电镜观察复合载体对细胞的增殖、分化及功能的影响。结果骨髓基质干细胞于复合载体中培养，细胞形态类似软骨细胞，并可见细胞增殖及细胞外基质分泌，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示基质中有Ⅱ型胶原表达，其细胞增殖率及Ⅱ型胶原分泌功能均较对照组明显增强。结论复合载体能够控制TGF-β1的释放并保持其活性，可促进骨髓基质干细胞的增殖并诱导其向软骨细胞分化。     

微小RNA-564基因下调对滑膜间充质干细胞成软骨分化的影响

目的探究下调微小RNA-564(miR-564)基因对滑膜间充质干细胞成软骨分化的作用。 方法取第3代的人滑膜间充质干细胞(SMSCs)作为实验细胞,实验设计为3组：SMSCs空白对照组(空白组);miRNA抑制剂转染SMSCs对照组(对照组);miR-564抑制剂转染SMSCs实验组(实验组)。将3组SMSCs同时成软骨诱导培养,观察诱导后软骨细胞的组织形态,并检测诱导前7 d内的3组细胞增殖曲线,和软骨分化特异性基因和蛋白[Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、性别决定区Y框蛋白9(Sox9)、母亲DPP同源物4(Smad4)];本次实验所有数据均采用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验。 结果甲苯胺蓝染色观察细胞形态与特点基本符合软骨细胞,实验组细胞数量更多,蓝染更明显;细胞增殖曲线表明实验组细胞增殖速度明显快于对照组(F＝0.842, P <0.01);RT-PCR检测与Western Blotting检测表明实验组软骨细胞分化特异基因和蛋白表达较对照组明显升高(F＝2274.75, F＝447.31, F＝30476.22; P <0.01),并且实验组TGF-BMP关键基因及蛋白Smad 4有所升高(F＝457.02, P <0.01)。 结论下调miR-564基因的表达可促进滑膜间充质干细胞向软骨细胞增殖与分化,并且有可能是通过作用于TGF-BMP通路实现。     

阻断转化生长因子—β信号转导抑制成纤维细胞增殖和I型胶质合成

目的：研究阻断转化生长因子-β（TGF－β）受体的信号转导对正常皮肤成纤维细胞增殖和I型胶原合成的调控。方法：组织块法体外培养皮肤成纤维细胞，加入缩短型TGF－βⅡ型受体的重组腺病毒（实验组，50pfu/cell)或β－半乳糖苷酶重组腺病毒（对照组，50pfu/cell)，培养后行细胞计数和Western Blot检测细胞增殖率和I型胶原合成状况。结果：缩短型TGF－βⅡ型受体在皮肤成纤维细胞的过度表达能有效抑制细胞增殖达34％－50％，并显著减少I型胶原的合成。结论：过度表达缩短型TGF－βⅡ型受体可以通过阻断TGF－β的信号转导来抑制成纤维细胞的细胞增殖和I型胶原合成。     

滑膜间充质干细胞成纤维软骨分化条件初步探索

目的采用正交实验研究滑膜间充质干细胞(synovial derived MSCs,SMSCs)成纤维软骨分化的条件。方法 5只成年新西兰白兔,活检取滑膜组织。贴壁法获取SMSCs后采用流式细胞仪及成脂、成骨、成软骨诱导分化鉴定。根据预实验与文献综述寻找与SMSCs成纤维软骨分化可能相关的条件,采用缺失实验初筛必要条件后,TGF-β1、BMP-2、地塞米松、脯氨酸、柠檬酸(ascorbic acid,ASA)、丙酮酸、胰岛素+转铁蛋白+亚硒酸预混液、牛血清白蛋白、b FGF、间断静水压、BMP-7、IGF纳入正交实验,采用SPSS18.0统计软件设计L60(212)正交实验及表头,定义2水平条件,在SMSCs-三维小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)支架上诱导成纤维软骨分化。使用流式细胞仪计数,检测CD151+/CD44+细胞并记录SMSCs向纤维软骨分化的转换率,采用免疫组织化学染色,结合细胞形态、甲苯胺蓝染色、半定量RT-PCR检测SOX9、聚集蛋白聚糖、Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ,ColⅠ)、ColⅡ、ColⅨ基因表达,进一步验证结果。检验指标rate是CD151+/CD44+细胞与高表达ColⅠ细胞的比例乘积。同时采用Pico Green Assay测量细胞总DNA量,以反映细胞扩增情况。正交实验结果采用直观观察和主体间方差分析方法,考虑部分因子间的1阶交互作用,组间差异采用LSD和q检验验证,使用Ⅲ型平方和校正模型,检验水准α=0.05。结果实验获取的细胞为SMSCs,细胞倍增时间为28 h。成纤维软骨分化过程中SMSCs-三维SIS支架体积5 d倍增,14 d后得到甲苯胺蓝染色阳性的细胞-支架复合物。正交实验结果直观分析示,TGF-β1对成纤维软骨分化转化率的作用最明显,BMP-7采用水平2有利于得到更高的转化率,但与BMP-2存在交互作用;其余第1区组水平值加和高于22.5的因子有DEX、ASA、ITS、转铁蛋白、b FGF,模型的相关性好。方差分析校正模型P=0.000,能够满足实验设计;截距P=0.000,说明各因子对因变量影响差异不完全相同。TGF-β1、ASA、b FGF、IGF对因变量调控作用较其他因子显著,差异有统计学意义,与直观观察结果相似。结论 TGF-β1、ASA、b FGF、IGF显著影响SMSCs成纤维软骨分化,通过合理调整上述因子浓度,可显著提高SMSCs成纤维软骨分化转化率;精确的调控条件和调控机制有待进一步探索。     

滑膜间充质干细胞的研究进展

【摘要】〓软骨损伤及滑膜组织疾病引起的肢体运动障碍是临床治疗的棘手问题之一,滑膜间充质干细胞(SMSCs)是骨髓间充质干细胞(MSCs)家族的新成员,由于其具有突出的增殖特性和强大的成软骨分化能力等优点,SMSCs被视为治疗骨关节系统疾病颇有希望的种子细胞,已成为近年来研究的热点。本文就近年来有关SMSCs的分离纯化、基本特性及临床应用等方面进行综述,旨在阐明SMSCs的研究现状及存在的相关问题。     

PPARβ/δ激动剂联合人自体关节液来源的间充质干细胞治疗骨关节炎的实验研究

目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)β/δ激动剂(GW0742)对人关节液来源的间充质干细胞(hSF-MSC)成软骨分化及炎性环境下炎症因子释放的影响。方法抽取膝关节骨关节炎患者患侧关节腔内的关节液并分离培养及鉴定。设置空白对照组(不完全成软骨诱导培养基)、转化生长因子(TGF)-β1组(含浓度为10ng/mL TGF-β1的成软骨诱导培养基)、TGF-β1+GW0742组(含10ng/mL TGF-β1、1μmol/L GW0742的成软骨诱导培养基)及GW0742组(含浓度为1μmol/L GW0742的成软骨诱导培养基),采用Pellet法诱导hSF-MSC成软骨分化。通过比较各组成软骨分化相关标志物SOX-9基因表达和蛋白合成以及阿利新蓝、甲苯胺蓝染色等来评估GW0742对hSF-MSC增殖及成软骨分化能力的影响。另设置空白对照组(20%关节液+80%完全培养基)、hSF-MSC组(20%关节液+80%完全培养基+1×105个/mL hSF-MSC)、hSF-MSC+GW0742组(20%关节液+80%完全培养基+1μmol/L GW0742+1×105个/mL hSF-MSC),通过比较第1、3天各组培养液中炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α表达来评估GW0742+hSF-MSC组免疫抑制能力。结果应用直接贴壁法成功从炎性关节液中分离培养hSF-MSC。TGF-β1、TGF-β1+GW0742及GW0742对hSF-MSC增殖能力无明显影响;聚合酶链反应(PCR)和Western Blot检测表明,GW0742组hSF-MSC成软骨分化作用最为明显;甲苯胺蓝和阿利新蓝染色显示,GW0742组hSF-MSC能分泌较多的蛋白聚糖,且较TGF-β1+GW0742组细胞分泌的蛋白聚糖更为致密;hSF-MSC+GW0742组炎症因子表达显著低于hSF-MSC组。结论 PPARβ/δ激动剂GW0742不仅能提升hSF-MSC成软骨分化能力,还能增强hSF-MSC抗炎能力。     

猪滑膜源性MSCs体外多向分化潜能的研究

目的 体外分离培养猪滑膜源性MSCs(synovium-derived MSCs,SMSCs),探讨其在体外多向分化潜能.方法 2月龄长枫杂交猪3头,雌雄不限,体重8～10kg.取猪膝关节滑膜组织分离SMSCs并行原代及传代培养,待第3代SMSCs长满培养皿后,吸去基础培养液,分别加入特定培养液进行成软骨、成骨、成脂诱导分化,作为实验组;以基础培养液培养作为对照组.成软骨诱导21 d后行甲苯胺蓝染色、免疫组织化学染色和实时荧光定量PCR检测;成骨诱导10 d后行ALP染色检测,21 d后行茜素红染色检测;成脂诱导21 d后行油红O染色检测.结果 SMSCs培养24 h后细胞形态细长或呈多角形;48 h后细胞数量增多;72 h后可见大量纺锤形细胞,其间散在分布少许小圆形细胞.实验组成软骨诱导21 d后甲苯胺蓝染色早阳性,细胞外有蛋白多糖(Aggrecan)形成;免疫组织化学染色示特异软骨基质ColⅡ表达;实时荧光定量PCR检测示Col Ⅱ A1、Aggrecan、SOX9 mRNA表达量与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).成骨诱导10 d后ALP染色阳性,21d后茜素红染色阳性,有钙结节形成.成脂诱导21 d后油红O染色示细胞内有脂滴形成.对照组除ALP染色观察呈弱阳性外,余染色均呈阴性.结论 猪膝关节滑膜组织可分离获取SMSCs,其在体外具有向成软骨、成骨、成脂多向分化潜能,有望成为组织工程种子细胞来源.     

诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的体外研究

目的 探讨转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF—β1）、胰岛素样生长因子1（insulinlike growth factor1，IGF-1）在诱导骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem ceils，MSCs）向软骨细胞分化过程中的相互作用，并研究细胞密度对MSCs向软骨细胞分化的影响。方法 取健康昆明种小白鼠骨髓，用全骨髓贴壁法筛选获得MSCs，体外培养传代。采用特定的诱导培养使MSCs向软骨细胞分化，按培养基内添加生长因子的不同分成3个实验组和对照组。实验组分别为：TGF—β1＋IGF-1联合应用组（TGF—β1 10ng／ml、IGF-1 50ng／m1）；TGF—β1单独应用组（TGF—β1 10ng／m1）；IGF-1单独应用组（IGF-1 50ng／m1）；对照组不添加任何生长因子。TGF—β1＋IGF-1联合应用组于诱导14d和21d，分别进行甲苯胺蓝染色及免疫荧光双染法鉴定；于诱导7、14和21d各组分别提取诱导细胞总RNA，进行RT—PCR扩增，检测TGF—β1、IGF-1对诱导细胞Ⅱ型胶原表达量的影响；比较MSCs在平板培养及细胞团培养时，Ⅱ型胶原表达量的差异。结果TGF—β1＋IGF-1联合应用组诱导培养14d，诱导软骨细胞甲苯胺蓝染色呈阳性，免疫荧光染色可见诱导软骨细胞的细胞外基质含有Ⅱ型胶原。各组基因扩增产物的凝胶电泳可见，TGF—β1＋IGF-1联合应用组和TGF—β1单独应用组Ⅱ型胶原扩增片段呈阳性；IGF-1单独应用组和对照组，未见Ⅱ型胶原扩增条带；凝胶成像系统灰度扫描示Ⅱ型胶原表达量TGF—β1＋IGF-1联合应用组各时间点均比TGF—β1单独应用组明显增加（P〈0．05）。细胞团培养模式下，诱导细胞表达Ⅱ型胶原比平板培养模式更加显著。结论 MSCs向软骨细胞诱导分化时，IGF-1对TGF—β1有明显的促进作用；细胞培养密度提高有利于MSCs成软骨细胞表型。     

诱导骨髓间充质干细胞表达软骨细胞表型

目的：诱免骨髓间充质干细胞达软骨细胞表型，方法：抽取兔骨髓，经密度梯度离心和粘附分离得到MSCs，用生长因子诱导，考察细胞软骨骨特异性基质的表达水平，结果：TGF－β1，IGF－I和维生素C结合可促进MSCs表达软骨特异性的Ⅱ型前胶原mRNA，但并未促进成骨特异性的碱生磷酸酶合成和钙盐沉积。结论：TGF－β1，IGF－I和维生素C结合诱导可促进MSCs增殖，表达软骨细胞表型，而不产生诱导成骨效应。     

软骨前体细胞的分离鉴定及IL-1β对其成软骨分化的影响

目的对正常软骨中的软骨前体细胞进行分离、鉴定,并对不同浓度IL-1β对软骨前体细胞的成软骨分化影响进行研究。方法取正常成年新西兰大白兔的软骨细胞,通过纤连蛋白粘连分离出软骨前体细胞,采用流式细胞仪对其细胞表型进行鉴定,倒置相差显微镜观察其克隆增殖,并行成骨、成脂、成软骨三系分化观察。培养软骨前体细胞团并分为4组,分别加入普通H-DMEM培养基(A组)、成软骨诱导分化培养基(B组)、成软骨诱导分化培养基+0.1 ng/mL IL-1β(C组)、成软骨诱导分化培养基+1.0 ng/mL IL-1β(D组),培养3周行组织学、生物化学、实时荧光定量PCR等检测,观察IL-1β的影响。结果在正常软骨细胞中存在软骨前体细胞,经鉴定有干细胞表型阳性表达,有与干细胞相似的克隆增殖能力及分化能力。HE染色示,C、D组中细胞团块较B组明显减小,细胞呈肥大样改变。番红O、Ⅱ型胶原及Ⅹ型胶原染色示,B组较A组染色深,C、D组均浅于B组,D组浅于C组。生物化学成分测定示,C、D组的总胶原、糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)相对含量及GAG/DNA比值均显著低于B组,D组显著低于C组,差异均有统计学意义(P0.05);C、D组DNA相对含量均显著高于B组(P0.05),但C、D组间差异无统计学意义(P0.05)。实时荧光定量PCR检测示,C、D组Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、Sox-9 mRNA相对表达量均显著低于B组,D组显著低于C组,差异均有统计学意义(P0.05);而C、D组Runx-2和MMP-13mRNA相对表达量均显著高于B组,D组显著高于C组,差异均有统计学意义(P0.05)。结论在正常软骨组织中存在一种有干细胞特性的软骨前体细胞,其有克隆和潜在分化的能力。IL-1β对软骨前体细胞成软骨分化有抑制作用,并有促进成骨分化的可能。     

骨髓基质干细胞体外分化软骨细胞的实验研究

目的 探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)和碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)对兔骨髓基质干细胞(BMSC)体外增殖、分化为软骨样细胞的影响。方法 24只兔等分为4组,抽取骨髓,分离基质干细胞,体外连续传代培养,A组为基础培养液,B、C、D组分别加入TGF-β1、b-FGF、TGF-β1和b-FGF,观察细胞生长情况及形态特征,阿新蓝染色,Ⅱ型胶原mRNA表达情况。结果B组细胞形态变化、C组增殖速度、D组增殖速度及形态变化均较A组加快。阿新蓝染色:原代阴性,传代细胞,A、c组淡染或阴性,B组呈蓝色,D组呈深蓝色。Ⅱ型胶原mRNA表达:A、c组未检出,B组阳性,D组有较强阳性表达。结论 兔BMSC在体外适当条件下可分化为软骨样细胞,TGF-β1能诱导BMSC向软骨方向分化,b-FGF不仅能促进BMSC的增殖,且能延长其生存时间。     

iNOS抑制剂对兔关节软骨修复组织胶原表达的影响

目的观察诱导型一氧化氮合酶抑制剂对关节软骨修复组织胶原表达的影响。方法24只新西兰大白兔双侧股骨髁间关节面造成全层软骨缺损。随机抽签均分为对照组、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）组和一氧化氮合酶抑制剂S-甲基异硫脲组（S—methylisothiourea,SMT）组。术后1年处死动物。应用苦味酸-天狼猩红染色检测胶原的分布情况,图像分析技术定量胶原的表达及进行修复组织软骨厚度的测量。应用免疫组织化学技术检测Ⅱ型胶原的表达和分布。结果图像分析显示,1年后SMT组I型胶原表达量为65．9％,明显少于BMP组88．5％和对照组94．6％的表达量,Ⅱ型胶原30．7％的表达量明显多于BMP组10．8％和对照组4．5％的表达量。1年后SMT组软骨厚度（1．85±0．56）mm明显高于BMP组（0．67±0．31）mm和对照组（0．24土0．10）mm。SMT组缺损区Ⅱ型胶原含量明显高于BMP组和对照组。结论iN0s抑制剂SMT的应用能明显增加Ⅱ型胶原表达和软骨厚度,对于维持软骨表型有积极意义。