姜黄素、丹参单体和苦参碱抑制IL-1β诱导下兔RPE细细胞增生的体外实验研究

背景 增生性玻璃体视网膜病变(PVR)是临床上常见的致盲眼病.视网膜色素上皮(RPE)细胞是PVR发生和发展中的关键细胞,研究中药对体外培养RPE细胞的作用及原理对于防治PVR并揭示其发病机制具有重要意义. 目的 研究姜黄素、丹参单体、苦参碱对白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的兔RPE细胞增生的抑制效果.方法 取第3～4代体外培养的有色兔RPE细胞,采用透射电子显微镜鉴定细胞结构.采用MTT法检测2.5、5.0、10.0、20.0 μg/L IL-1β培养后24、48和72 h RPE细胞的增生率;并检测5、10、20 μg/ml姜黄素和丹参单体IH763-4以及100、200、400 μg/ml苦参碱对IL-1β诱导RPE细胞增生的抑制率.采用线性回归分析计算各药物的半数抑制率(IC50)剂量.结果 初分离的兔RPE细胞呈球形,细胞中可见大量黑色素颗粒;第4代细胞色素颗粒明显减少,形态更加狭长.免疫细胞化学染色结果显示,细胞角蛋白(AE1/AE3)在细胞质表达呈阳性.透射电子显微镜下可见细胞顶端有大量的微绒毛,细胞间可见连接复合体.不同质量浓度IL-1β组培养后24、48、72 h细胞增生率总体比较差异均有统计学意义(F时间=30.33,P=0.00;F浓度=9.37,P=0.00);组内相邻培养时间点间细胞增生率比较差异均有统计学意义(均P＜0.05),同一培养时间点相邻质量浓度IL-1β组间细胞增生率比较,差异均有统计学意义(均P＜0.05).10.0μ,g/LIL-1β培养72 h后细胞增生率达峰值.不同质量浓度姜黄素、丹参单体和苦参碱不同培养时间点细胞抑制率总体比较差异均有统计学意义(姜黄素:F时间=128.75,P=0.00;F质量浓度=334.05,P=0.00.丹参单体:F时间=39.32,P=0.00;F质量浓度=165.57,P=0.00.苦参碱:F时间=267.76,P=0.00;F质量浓度=912.34,P=0.00).3种药物对RPE细胞的抑制作用均呈明显的剂量和时间依赖性,组内相邻培养时间点间细胞抑制率比较差异均有统计学意义(均P＜0.05),相邻质量浓度药物组间细胞抑制率的比较差异均有统计学意义(均P＜0.05).培养后24、48及72 h,姜黄素的IC50分别为26.77、19.01和9.45 μg/ml,丹参单体的IC50分别为33.72、23.47和12.56μg/ml,苦参碱的IC50分别为570.96、352.25和97.50 μg/ml. 结论 IL-1β可促进RPE细胞增生,10.0 μg/L IL-1β促增生作用最显著;姜黄素、丹参单体、苦参碱均可抑制IL-1β诱导的RPE细胞增生,其抑制作用均呈时间和剂量依赖性,其中姜黄素抗增生作用最强.     

姜黄素对IL-1β诱导视网膜色素上皮细胞分泌IL-8和sICAM-1的影响

目的:研究姜黄素对IL-1β诱导RPE细胞分泌IL-8和sICAM-1的影响。方法:RPE细胞经含4mL/LFBS的DMEM/F12同步后分为四组:①rhIL-1β干预组;②rhIL-1β 姜黄素组,姜黄素分5mg/L和10mg/L两个浓度;③姜黄素组,只分别加入5mg/L和10mg/L姜黄素;④空白对照组(4mL/LFBS DMEM/F-12)。所有样本干预24h后收集培养上清液和该孔细胞蛋白裂解液。ELISA法检测rhIL-1β(5μg/L)和姜黄素诱导hfRPE细胞分泌IL-8和sICAM-1的量。结果:rhIL-1β(5μg/L)组RPE细胞分泌的IL-8和sICAM-1分别比空白对照组升高了20倍和8倍,加入姜黄素能显著抑制其分泌。5mg/L姜黄素使IL-8和sICAM-1含量分别降低了36.88%和14.90%,10mg/L则分别达到55.73%和41.78%。姜黄素本身不刺激hfRPE细胞分泌IL-8和sICAM-1。结论:姜黄素可显著抑制IL-1β刺激的RPE细胞分泌炎前因子IL-8和sICAM-1,有可能防止PVR的发生。     

姜黄素对IL-1β诱导的兔RPE细胞中核因子-κB相关炎性因子表达的抑制作用

背景 白细胞介素-1β(IL-1β)是增生性玻璃体视网膜病变(PVR)早期释放的重要炎性因子,研究证实姜黄素能抑制IL-1β诱导的兔视网膜色素上皮(RPE)细胞的增生,但其是否能够对PVR发挥抗炎作用尚不清楚. 目的 观察姜黄素对IL-1β诱导的兔RPE细胞移行的影响,探讨姜黄素对IL-1β诱导的RPE细胞中炎性因子表达的影响.方法 采用对数生长期原代培养的第4代兔RPE细胞进行实验,在无血清DMEM培养基中分别添加0、0.1、1.0和10.0 μg/L的IL-1β作用于细胞24 h,分别采用Western blot和逆转录PCR法检测细胞中环氧合酶-2(COX-2)蛋白和mRNA的表达以筛选IL-1β最佳质量浓度.将培养的RPE细胞分为IL-1β组和姜黄素+IL-1β组,分别在无血清培养基中添加1.0 μg/L IL-1β和1.0μg/L IL-1β联合10 μg/ml姜黄素作用于细胞24、48和72 h,仅用无血清培养基培养的细胞作为对照组.培养的细胞行苏木精-伊红染色,于光学显微镜下计算进入损伤区的细胞数,比较各组细胞的移行能力;分别采用Western blot法和逆转录PCR法检测各组RPE细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量,采用Western blot法检测并比较各组细胞中核因子-κBp65(NF-κBp65)蛋白和核因子κB抑制蛋白-α(IκB-α)的相对表达量;采用免疫化学染色法检测NF-κBp65、IκB-α和COX-2在各组RPE细胞中的表达和定位. 结果 初分离的兔RPE细胞呈球形,细胞中可见大量黑色素颗粒;第4代细胞色素颗粒明显减少,接近融合的细胞形态为长梭形,呈拉网状分布.免疫细胞化学染色法结果显示,细胞角蛋白(AE1/AE3)在细胞质呈阳性表达.对照组在培养24、48和72 h移行的细胞数分别为(31.93±1.21)、(36.27±2.50)和(38.33±2.40)个,IL-1β组分别为(45.73±2.30)、(71.13±1.92)和(80.60±1.71)个,而姜黄素+IL-1β组分别为(13.13±2.20)、(14.93±1.10)和(12.60±1.51)个,各时间点IL-1β组细胞移行细胞数均明显高于对照组,而姜黄素+IL-1β组移行细胞数均明显低于对照组和IL-1β组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).IL-1β质量浓度为1.0 μg/L时,RPE细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量达峰,以1.0 μg/L IL-1β的剂量进行后续实验.细胞培养后24、48和72 h,姜黄素+IL-1β组细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量均明显低于IL-1β组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).IL-1β作用于细胞后48 h,细胞中NF-κBp65蛋白的相对表达量最高,与IL-1β组相比,各时间点姜黄素+IL-1β组细胞中NF-κBp65蛋白相对表达量降低,差异均有统计学意义(均P＜0.05).IL-1β组药物作用于细胞后48 h细胞中IκB-α降至最低,各时间点姜黄素+IL-1β组细胞中IκB-α值均明显高于IL-1β组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).免疫细胞染色结果显示,IL-1β组RPE细胞的细胞核及细胞质中NF-κBp65呈强阳性表达,对照组表达较弱,姜黄素+ IL-1β组细胞中NF-κBp65的表达强度较IL-1β组明显降低;与对照组相比,IL-1β组细胞的细胞质中IκB-α表达强度明显减弱,而COX-2表达明显增强;与IL-1β组比较,姜黄素+IL-1β组细胞中IκB-α表达明显增强,而COX-2表达明显减弱.结论 姜黄素可抑制IL-1β引起的兔RPE细胞的移行,IL-1β通过激活NF-κB信号通路刺激细胞中COX-2的表达,姜黄素可通过阻断这一途径而抑制炎性因子的表达,从而发挥抗炎作用.     

肝细胞生长因子对培养的视网膜色素上皮 细胞移行及增生的作用

目的研究肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)对视网膜色素上皮 (retinal pigment epitheliaum, RPE) 细胞的促增生和促移行作用。方法在无血清培养液培养的人RPE细胞中分别加入1、2、10、50、100 μg/L不同浓度的HGF,四唑盐比色法(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)测定促细胞增生情况; 采用RPE细胞损伤愈合模型,在无血清培养液中分别加入1、2、10、50、100 μg/L 不同浓度的HGF,培养20 h后计数进入刮痕区的细胞,观察HGF对RPE细胞移行的作用。结果HGF浓度处于10 ～100 μg/L时对RPE细胞具有促增生作用(P<0.05或P<0.01), 增生率为18.2 %～34.8 %,其中浓度为50 μg/L作 用3 d达到最大促增生效果(P<0.01）,增生率为32.8 %;HGF可明显促进RPE细胞移行,促移行能力分别为113.0 %(10 μg/L), 91.7 %(50 μg/L) 和50.3 %(100 μg/ L )。浓度自2 μg/L开始出现促细胞移行作用(P<0.05),促移行能力为9.3 %。结论HGF可促进RPE细胞增生和移行,是RPE细胞的有丝分裂原和强力的促移行因子。(中华眼底病杂志,2001,17:307-310)     

白介素1受体拮抗剂抑制视网膜色素上皮细胞炎前因子的表达

目的　观察视网膜色素上皮 (retinal pigment epithelium,RPE)细胞白细胞介素 6 (inter-leukine 6 ,IL - 6 )和白细胞介素 8(interleukine 8,IL - 8)的表达及白细胞介素 1受体拮抗剂 (interleukine 1receptor antigonist,IL- 1ra)对 RPE细胞 IL- 6和 IL- 8表达的影响。　方法　培养的人 RPE细胞分为对照组和 IL - 1ra组 (IL - 1ra,1、10、10 0 ng/ ml) ,用酶联免疫吸附、免疫组织化学和原位杂交等方法观察 RPE细胞 IL- 6和 IL- 8的表达。　结果　对照组 RPE细胞培养上清液中 IL- 6、IL- 8分别为 2 0 0 0、5 0 0 0 pg/ ml。与对照组比较 ,IL - 1ra组 IL - 6、IL - 8分别为 30 0 pg/ ml(t=8.0 11,P <0 .0 1)、4 5 0 pg/ ml(t=11.4 4 6 ,P<0 .0 1)。经白细胞介素 1β(interleukine1β,IL- 1β)刺激后 RPE细胞 IL- 6和 IL- 8m RNA表达原位杂交表现为细胞浆中浓淡不一的蓝色着色 ,IL - 1ra作用组细胞染色较淡。　结论　在 IL - 1β刺激下 ,培养的人 RPE细胞可以表达 IL- 6、IL- 8的 m RNA和蛋白质 ,IL- 1ra能有效抑制其 IL- 6、IL- 8m RNA和蛋白质的表达     

IL-1ra对IL-1α诱导的眼眶成纤维细胞合成糖胺多糖的抑制作用

目的 :明确白介素 1受体拮抗剂 (IL 1ra)是否对白介素 1α(IL 1α)诱导的眼眶成纤维细胞合成糖胺多糖 (gly cosaminoglycans,GAG)有抑制作用 ,探讨IL 1ra在Graves’眼病(GO)治疗及预防中的临床应用前景。方法 :以下述方法分别处理培养的GO患者和正常人眼眶成纤维细胞 :IL 1α 30U/ml或 /和不同浓度的IL 1ra孵育 4 8h ;用IL 1α 30U/ml处理后 ,再加入IL 1ra 75ng/ml共孵育不同时间 (2 4h、4 8h、72h)。用 [3 H]葡萄糖胺掺入法测定 [3 H]GAG的产量。结果IL 1α 30U/ml明显刺激GO患者和正常人成纤维细胞合成GAG ,增加率达 4 6 .6 %～ 12 7.9% (平均 10 3.5 % ,P <0 .0 0 1)。与IL 1α 30U/ml克分子浓度比为 2 5∶1、4 0∶1和 10 0∶1的IL 1ra ,分别抑制IL 1α诱导的GO患者和正常人成纤维细胞合成GAG达 (30 .93± 11.4 6 ) %、(5 9.34± 9.3) %和 (83.15± 8.5 6 ) % (P <0 .0 0 5 )。在 2 4h、4 8h、72h时 ,IL 1ra分别抑制IL 1α诱导的眼眶成纤维细胞合成GAG(2 4 .18± 6 .3) %、(6 0 .4 8± 12 .83) %和 (73.0 4± 7.14 ) % (前两组相比 ,P <0 .0 0 1;后两组相比 ,P =0 .15 9)。结论 :IL 1ra能够剂量和时间依赖性地抑制IL 1α诱导的眼眶成纤维细胞合成GAG ,IL 1ra可望用于GO的治疗和预防。     

葛根素抑制糖基化终产物诱导的人视网膜色素上皮细胞增殖及低氧诱导因子-1α的表达

目的:研究葛根素是否抑制糖基化终产物(AGEs)诱导的人视网膜色素上皮(RPE)细胞增殖及低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达。方法:应用MTT比色法检测不同浓度(0,0.01,0.1,1g/L)的葛根素对糖基化终产物(AGEs)诱导的人RPE细胞增殖的影响;应用免疫组织化学法和Western-blot分析法检测不同浓度(0,0.01,0.1,1g/L)葛根素对100mg/L的AGEs作用于人RPE细胞24h后HIF-1α的表达,并以计算机图像分析仪进行分析。结果:MTT比色法显示,不同浓度(0,0.01,0.1,1g/L)的葛根素对AGEs诱导的人RPE细胞增殖具有不同程度的抑制作用,抑制率分别为5.7%,24.1%,30.7%;不同浓度(0.01,0.1,1g/L)的葛根素与100mg/LAGEs共同作用于RPE细胞24h,免疫组织化学法检测显示,与AGEs组比较,0.01g/L以上浓度葛根素均能显著抑制AGEs诱导的RPE细胞HIF-1α的表达,0.01g/L葛根素使HIF-1α表达降低了10.2%,0.1g/L葛根素则降低了38.9%,1g/L葛根素则达到53.4%。Western-blot分析显示,与AGEs组比较,0.01g/L以上浓度葛根素均能显著抑制AGEs诱导的RPE细胞HIF-1α的表达,随着葛根素浓度的增加,HIF-1α免疫印迹带逐渐减弱,0.01g/L葛根素使HIF-1α表达降低了11.0%,0.1g/L葛根素则降低了40.3%,1g/L葛根素则达到54.4%。结论:葛根素可显著抑制AGEs诱导的人RPE细胞的增殖及HIF-1α的表达。     

IL-1ra对大鼠高危角膜植片IL-1β影响的实验研究

目的 探讨炎性细胞因子白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)β在高危角膜移植免疫排斥反应中的作用及IL-1受体拮抗剂(IL-1 receptor antagonist,IL-1ra)抑制大鼠高危角膜移植免疫排斥反应的作用机制.方法 诱导新生血管后的大鼠行穿透性角膜移植术,受体鼠随机分为3组:生理盐水对照组、10 g·L-1 环孢霉素A(cyclosporin A,CsA)滴眼液治疗组、50 mg·L-1的IL-1ra滴眼液治疗组,每组15只.分别采用原位杂交和免疫组织化学方法 检测术后不同时间点各组大鼠角膜移植物IL-1β mRNA及蛋白表达情况.结果 正常大鼠角膜IL-1β mRNA在上皮细胞基底层微量表达,IL-1β蛋白无表达;术后不同时间点各移植组角膜植片上皮层、基质层均可检测到IL-1β mRNA及蛋白的阳性表达.术后同一时间点不同移植组相比: IL-1β mRNA及蛋白的表达依次减低顺序为生理盐水对照组、10 g·L-1 CsA组、50 mg·L-1 IL-1ra 组,差异有显著统计学意义(P＜0.01);在急性排斥期,与10 g·L-1 CsA滴眼液组相比,IL-1ra组降低更明显,两治疗组间比较差异有显著统计学意义(P＜0.01).结论 IL-1ra可通过影响IL-1β的表达抑制高危角膜移植免疫排斥反应,减少新生血管生成,减轻免疫性炎性反应,延长角膜植片的存活时间.     

细胞因子及苏拉明对视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的：研究在血小板源性生长因子（PDGF）和白介素-1β（IL-1β）作用下苏拉明（suramin）对培养的人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞增殖的影响。方法：将不同浓度的（15,150,250mg／L）苏拉明分别加入用PDGF 10μg／L或IL-1 10μg／L培养的RPE细胞培养液中,继续培养3d后采用四甲基偶氮唑盐（tetrazolium,MTT）比色法,细胞分裂指数计数和核仁组成区嗜银染色（AgNORs）检测在细胞因子作用下不同浓度苏拉明对RPE增殖活力的影响。结果：含有PDGF 10μg／L或IL-1β10μg／L的培养液显著刺激RPE的增殖,苏拉明明显抑制了这两种细胞因子条件下RPE的增殖,在150mg／L时的抑制率分别为26％$H18％,对细胞的形态无明显影响。结论：苏拉明对PDGF或IL-1β刺激的RPE的增殖有显著抑制作用,该作用为非毒性作用。进一步证明苏拉明对增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy,PVR）中相关细胞因子的拮抗作用,为临床防治PVR提供了新的用药思路。     

苏拉明联合地塞米松对体外培养的视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的:探讨苏拉明(suramin,Sur)联合地塞米松(dexamethasone,Dex)对体外培养的猪视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞增殖的影响。方法:选择0.05,0.1,0.2,0.4g/L Sur单独作用及联合0.2g/LDex作用于RPE细胞4d,MTT比色法检测对RPE细胞增殖的影响;0.2g/L Sur和0.2g/L Dex分别作用于RPE细胞,流式细胞术检测细胞周期变化;Sur浓度为0.2g/L,0.4g/L及0.2g/L Sur联合0.2g/L Dex时,透射电镜观察细胞超微结构情况。结果:MTT比色法检测表明各浓度Sur对RPE细胞有抑制作用(P<0.05),呈剂量效应关系;0.2g/L Dex与各浓度Sur联合应用对RPE细胞的抑制率由单独应用Sur的16.0%,27.3%,40.5%,64.1%增至42.3%,52.1%,65.6%,78.8%。流式细胞检测提示Sur将细胞阻滞于G2/M期(P<0.01);Dex将细胞阻滞于S期(P<0.01)。透射电镜结果显示,Sur浓度为0.2g/L时,单独应用及联合0.2g/L Dex应用,RPE细胞结构无明显变化,而Sur0.4g/L时,细胞表面微绒毛减少,细胞核皱缩。结论:Sur联合Dex能有效抑制体外培养的RPE细胞增殖。     

蛋白酪氨酸激酶抑制剂对RPE细胞趋化因子表达和Ca2+的影响

目的 研究蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK)抑制剂染料木黄酮(Genistein)对白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)诱导的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞趋化因子表达和细胞内Ca2+的影响.方法 应用不同剂量IL-1β对RPE细胞进行刺激,RT-PCR法观察细胞IL-8和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotaetic protein-1,MCP-1)mRNA表达的变化.应用Genistein对RPE细胞培养进行干预,观察其对IL-1β诱导RPE细胞IL-8和MCP-1 mRNA表达的影响.应用Fura2/AM、荧光分光光度计检测IL-1β和Genistein对RPE细胞内Ca2+的影响.结果 RT-PCR结果显示,0.1μg·L-1、1μg·L-1、10μg·L-1IL-1β刺激组IL-8 mRNA相对表达值分别为0.446±0.133、0.727±0.054和0.523±0.106,对照组为0.272±0.088;1μg·L-1、10μg·L-1IL-1β刺激组与对照组比较,差异有统计学意义(P=0.001、0.015).10μg·L-1IL-1β诱导的RPE细胞MCP-1 mRNA相对表达值与对照组比较,差异有显著统计学意义(P=0.002).10 mg·L-1、50 mg·L-1 Genistein对IL-1β诱导的IL-8和MCP-1 mRNA表达具有明显的抑制作用,差异均有显著统计学意义(均为P<0.01).IL-1β引起细胞内ca2+浓度升高,Genistein对细胞内Ca2+作用与之相反.结论 Genistein对IL-1β诱导的1L-8和MCP-1 mRNA表达具有明显的抑制作用,其机制可能为抑制IL-1β诱导的细胞内Ca2+增加.     

白介素1α和白介素1受体拮抗剂对培养的Graves'眼眶成纤维细胞增殖作用的影响

目的探讨白介素1α(IL-1α)和白介素1受体拮抗剂(IL-1ra)对培养的Graves'眼病(GO)患者眼眶成纤维细胞增殖的影响.方法以下述方法分别处理培养的GO和正常人眼眶成纤维细胞:不同浓度的IL-1α刺激成纤维细胞48 h;30 U/ml的IL-1α刺激成纤维细胞24～72 h;不同浓度的IL-1ra或/和30 U/ml的IL-1α处理成纤维细胞48 h;75 ng/ml的IL-1ra和30 U/ml的IL-1α处理成纤维细胞24～72 h.用MTT法测定成纤维细胞增殖的刺激或抑制率.结果IL-1α以剂量和时间依赖的方式刺激GO和正常人眼眶成纤维细胞增殖,而IL-1ra以剂量和时间依赖的方式抑制IL-1α诱导的GO和正常人眼眶成纤维细胞的增殖活性,刺激和抑制作用在GO和正常人眼眶成纤维细胞之间无明显差异.结论IL-1ra是IL-1α诱导的人眼眶成纤维细胞增殖的强有力的抑制剂,可望用于GO的治疗.     

转化生长因子-β诱导视网膜色素上皮细胞增殖中NLRP3炎症小体的表达及意义

目的　探讨转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）刺激下Nod样受体蛋白3（nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体在视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium，RPE）增殖中的表达变化及意义。方法　利用TGF-β刺激RPE细胞增殖模拟增生性玻璃体视网膜病变模型，随机分为空白对照组（Sham组）和TGF-β诱导RPE细胞增殖组（TGF-β组），TGF-β组再根据浓度（0.5 μg·L^-1、2.5 μg·L^-1、10.0 μg·L^-1、12.5 μg·L^-1）分组。利用MTT 微量酶比色法检测RPE细胞增殖情况；Western blot观察NLRP3蛋白的表达变化；利用标准ELISA试剂盒检测白细胞介素（interleukin，IL)-1β和 IL-18表达情况。结果　与Sham组比较，0.5 μg·L^-1 TGF-β组RPE细胞增殖不明显，差异无统计学意义（P>0.05），但NLRP3、IL-1β和 IL-18表达明显提高（均为P<0.01）；2.5 μg·L^-1、10.0 μg·L^-1和12.5 μg·L^-1TGF-β组RPE细胞增殖明显，NLRP3、IL-1β和 IL-18表达均提高（均为P<0.05）；与0.5 μg·L^-1 TGF-β组相比，2.5 μg·L^-1、10.0 μg·L^-1和12.5 μg·L^-1TGF-β组RPE细胞增殖显著增加，NLRP3、IL-1β和 IL-18表达均下降，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　不同浓度TGF-β诱导RPE细胞增殖中NLRP3炎症小体表达变化不同，两者可能相互调控影响RPE细胞增殖，在增生性玻璃体视网膜疾病发生发展中具有重要的作用。     

shRNA抑制人RPE细胞中HIF-1α表达下调后IGF-1对VEGF表达的影响

背景 增生性玻璃体视网膜疾病(PVD)是一组眼底视网膜血管性疾病,主要由视网膜色素上皮( RPE)细胞增生所致,胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和血管内皮生长因子(VEGF)与RPE细胞的异常增生和病理性新生血管生成有关,但其信号机制及功能尚不完全明了. 目的 探讨利用小发卡环核糖核酸( shRNA)使人RPE细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)基因沉默后,IGF-1对VEGF表达的影响. 方法 收集健康男性供体眼球4只,分离、收集、培养RPE细胞,用SABC法行抗人角蛋白免疫细胞化学染色进行鉴定.用体外转录法合成针对HIF-1α mRNA序列靶点的shRNA,对3～5代RPE细胞的HIF-1α进行干扰后再经50 μg/L IGF-1处理24 h,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测人RPE细胞中HIF-1α及VEGF mRNA的表达,采用Western blot法检测人RPE细胞中HIF-1α及VEGF蛋白的水平.结果 分离培养的细胞呈扁平不规则多角形,97％的细胞对人角蛋白呈阳性反应.50 μg/L IGF-1作用后,人RPE细胞HIF-1α mRNA表达量(1.49±0.18)与0 μg/L IGF-1组(1.46±0.17)比较差异无统计学意义(t=0.335,P=0.743),而HIF-1α蛋白表达量(1049.86±172.54 vs 0.00±0.00)、VEGF mRNA(0.95±0.15 vs 0.35±0.07)及VEGF蛋白(391.98±56.77 vs 214.36±37.15)表达量均明显增高,差异均有统计学意义(t=16.098、9.935、6.928,P＜0.05).shRNA干扰HIF-1α mRNA表达后,RNAi转染组HIF-1α、VEGF mRNA及其蛋白水平较RNAi空白对照组及RNAi-C转染组明显下降,3个组间各指标的总体比较差异均有统计学意义(F=68.679、89.904、21.770、6.205,P＜0.05). 结论 IGF-1可通过促进人RPE细胞中HIF-1α蛋白的累积诱导VEGF的表达,是导致PVD重要的细胞因子之一.     

表皮生长因子对人视网膜色素上皮细胞增生及移行的影响

目的　观察表皮生长因子 (epidermalgrowthfactor,EGF)及血清对体外培养的人视网膜色素上皮 (retinalpigmentepithelium ,RPE)细胞增生及移行的影响。 方法　对培养的人 3～ 6代RPE细胞采用MTT比色法观察不同浓度的EGF(0 .1、1、10、5 0、10 0 μg·L-1)及血清对人RPE细胞增生的影响 ;应用RPE细胞损伤模型 ,计数进入缺损区的细胞 ,定量观察EGF及血清对RPE细胞移行的影响。结果　在细胞增生的实验中 :无血清组 ,10～ 10 0 μg·L-1EGF达到最佳刺激浓度 ,其增生率为 81.8% ;5 0mL·L-1血清组 ,1～10 μg·L-1EGF的刺激作用最强达到 12 2 .7% ;无血清组与 5 0mL·L-1血清组间有显著性差异 (P <0 .0 0 1) ,且 5 0mL·L-1血清可明显促进人RPE细胞的增生 (P <0 .0 0 1)。在细胞的移行实验中 :无血清组 ,1～ 10 0 μg·L-1EGF可促进RPE细胞移行 ,但作用较弱 ;10 0mL·L-1血清组中 1～ 10 μg·L-1EGF促移行作用最强达 4 38.9% ;1～ 10 0 μg·L-1EGF的促进基础RPE细胞移行能力 (最强为 36 % )低于 10 0mL·L-1血清诱导的RPE细胞的移行能力 (强度为 14 7% ) ;无血清组与 10 0mL·L-1血清组间有显著性差异 (P <0 .0 0 1)。结论　EGF对体外培养的人RPE细胞具有浓度依赖性促增生和移行的作用 ;血清自身也具有此作用     

IL-1受体拮抗剂缓释系统抑制兔眼后发性白内障的研究

目的 探讨IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)缓释系统抑制后发性白内障发生的可行性和有效性.方法 将30只健康日本大耳白兔(30眼)晶状体囊外摘出术后随机分为A组(空白对照组)、B组(囊袋内植入空白缓释系统)及C组(囊袋内植入IL-1ra缓释系统).术后8周对3组兔眼进行裂隙灯显微镜、角膜内皮镜检查及组织病理学、电镜观察,并检测房水中IL-1的质量浓度.结果 术后12周A、B、C组发生晶状体后囊膜混浊分别为10、10、3眼,差异有统计学意义(P＜0.01);术前及术后C组角膜内皮细胞计数与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);术后1、3、7、14、28、56 d,C组IL-1质量浓度与A组和B组间差异有统计学意义(P＜0.01);术后3、7、14、28、56 d,A组和B组比较IL-1质量浓度差异无统计学意义(P＞0.05).光镜和电镜下C组兔眼晶状体后囊膜细胞增生不活跃,未发现眼内毒性反应.结论 后房内植入IL-1ra缓释系统,可明显抑制房水中的IL-1质量浓度,可有效抑制后发性白内障的发生.     

IL-1β,IL-6反义寡核苷酸脂质体抑制兔后发性白内障

目的探讨IL-1β、IL-6反义寡核苷酸脂质体抑制后发性白内障的可行性和有效性。方法将20只健康新西兰大白兔双眼行透明晶状体囊外摘出术,均设左眼为实验眼,术后前房立即注射IL-1β、IL-6反义寡核苷酸脂质体,右眼为对照眼,术后前房注射单纯脂质体。分别于术前1d、术后1d、3d、1周、2周、1月、2月和3月抽取房水,用ELISA双抗体免疫夹心法检测IL-1β、IL-6的含量,定期裂隙灯检眼镜观察后囊混浊情况,术后3月行组织病理学检查。结果(1)术后3月实验眼与对照眼发生晶状体后囊膜混浊的眼数分别为16眼及20眼,差异有极显著意义(P=0.002<0.01);(2)实验眼和对照眼房水中IL-1β的浓度均值分别为(8.570±1.686)×10-9g·L-1、(11.900±3.873)×10-9g·L-1,有显著性差异(P=0.002<0.01),IL-6的浓度均值分别为(12.530±4.068)×10-9g·L-1、(16·600±6·636)×10-9g·L-1,亦有显著性差异(P=0.033<0.05);(3)光镜和电镜下实验眼晶状体后囊膜细胞增生不活跃,未发现眼内毒性反应。结论前房注射IL-1β、IL-6反义寡核苷酸脂质体对后发性白内障可能有一定的抑制作用。     

视网膜色素上皮细胞表达IL-1β和IL-6与细胞自噬的关系

目的：研究细胞自噬在缺氧条件下视网膜色素上皮(RPE)细胞表达炎性因子IL-1β和IL-6中的作用。

方法：将体外培养的人RPE细胞系随机分为缺氧组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)+缺氧组、氯喹(CQ)+缺氧组和对照组。培养24h后采用Western blot法检测各组细胞的自噬关键蛋白微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)、Beclin-1及p62的相对表达水平; 采用ELISA法检测各组细胞上清液中IL-1β和IL-6的浓度。

结果：缺氧组IL-1β和IL-6的浓度明显高于对照组、3-MA+缺氧组和CQ+缺氧组(均P<0.01)。缺氧组细胞中LC3B-Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1的相对蛋白表达量均明显高于对照组和3-MA+缺氧组,缺氧组中LC3B-Ⅱ/Ⅰ的相对蛋白表达量低于CQ+缺氧组(均P<0.01)。缺氧组细胞中p62相对蛋白表达量明显低于对照组、3-MA+缺氧组和CQ+缺氧组(均P<0.01)。

结论：缺氧使RPE细胞LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1表达增强,p62表达减弱,并促进细胞分泌IL-1β和IL-6,自噬抑制剂3-MA和CQ能够减少RPE细胞表达IL-1β和IL-6。     

IL-1ra-壳聚糖缓释剂对兔后发性白内障的抑制作用

目的:探讨IL-1ra-壳聚糖缓释剂对兔眼晶状体囊外摘除术后房水中炎性细胞因子IL-1含量及后囊膜混浊的影响。方法:将健康日本大耳白兔30只随机分为A,B,C3组,对右眼30只均行透明晶状体囊外摘除术,术中囊袋内分别注入缓冲液0.1mL(A组),注入5g/LIL-1ra0.1mL(B组),置入IL-1ra-壳聚糖缓释剂一粒(C组)。分别于术后1,3,7,14,28,56,84d抽取房水0.1~0.2mL,用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法测定IL-1的含量。定期裂隙灯显微镜观察角膜,前房及晶状体后囊膜混浊情况,术后84d处死白兔,做病理标本,行光镜及电镜检查。结果:术后84dA,B,C组之间后囊膜混浊情况差别有显著意义(P<0.01)。房水中IL-1含量测定表明B组较A组IL-1峰值明显降低;C组与A组IL-1含量差异显著,且C组呈持续下降趋势。光镜观察A组晶状体上皮细胞增生并有多层皮质纤维出现,B组偶见晶状体上皮细胞,C组晶状体后囊膜增生不活跃,囊膜光滑,后囊表面几乎无细胞及纤维蛋白粘附。结论:IL-1ra-壳聚糖缓释剂具有抑制兔眼后发性白内障的作用,较单纯用IL-1ra作用明显。     

白介素1a和白介素1受体拮抗剂对培养的Graves’眼眶成纤维细胞增殖作用的影响

目的 探讨白介素1a(IL-1a)和白介素1受体拮抗剂(IL-1ra)对培养的Graves’眼病(GO)患者眼眶成纤维细胞增殖的影响。方法 以下述方法分别处理培养的GO和正常人眼眶成纤维细胞：不同浓度的IL-1a刺激成纤维细胞48h；30U／ml的IL—1a刺激成纤维细胞24～72h；不同浓度的IL—1ra或／和30U／ml的IL—1a处理成纤维细胞48h；75ngml的IL—1ra和30U／ml的IL-1a处理成纤维细胞24～72h。用MTT法测定成纤维细胞增殖的刺激或抑制率。结果IL-1a以剂量和时间依赖的方式刺激GO和正常人眼眶成纤维细胞增殖，而IL—1ra以剂量和时间依赖的方式抑制IL—1a诱导的GO和正常人眼眶成纤维细胞的增殖活性，刺激和抑制作用在GO和正常人眼眶成纤维细胞之间无明显差异。结论IL—1ra是IL—1a诱导的人眼眶成纤维细胞增殖的强有力的抑制剂，可望用于GO的治疗。