化学剂法对兔卵母细胞孤雌激活的效果

目的 研究钙离子载体A23187和6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)及3种酶对兔卵母细胞的激活率,并观察其体外发育情况.方法 兔超排后获得卵母细胞,经脱颗粒处理后用A23187和6-DMAP处理不同时间,体外培养5～7 d,观察细胞发育与囊胚形成情况.结果 钙离子载体A23187激活处理5 min后, 继续在2.0 mmol/L 6-DMAP中分别处理3.5、4.0、4.5、5.0 h,均能激活兔卵母细胞;以处理4.0 h的卵裂率最高(58.82%,20/34),并有15%(3/20)的囊胚发育率.透明质酸酶、胶原酶和胰酶处理20 min后, 均能激活兔卵母细胞,其中透明质酸酶处理20 min的激活率和卵裂率最高,分别为58.33%(28/48)和63.64%(28/44).结论 兔卵母细胞孤雌激活率与激活方法密切相关.化学激活剂的处理时间及消化酶的不同均对兔卵母细胞的激活产生显著影响.     

小鼠卵母细胞的孤雌激活

目的 探讨一种有效的孤雌激活方法。方法 用乙醇、Ca^2＋载体A23187分别联合6-二甲氨基嘌呤对小鼠卵母细胞进行孤雌激活。结果 7％乙醇卵母细胞活化率、囊胚形成率分别达80.88％、10.29％、;5μmol/L Ca^2＋A23187卵母细胞活率、囊胚形成率分别达86.88％、11.48％。两者差异无显著性。结论 应用乙醇、Ca^2＋载体A23187联合6-二甲氨基嘌呤处理小鼠卵母细胞,均可实现小鼠卵母细胞孤雌发育。     

猪体细胞核移植胚的体外发育及其影响因素

以卵丘细胞为核供细胞组成重构胚 ,卵裂率达以5 6 .7% ,发育至桑椹胚达 11.7%、孵化囊胚率为 6 .7% ,显著高于成纤维细胞重构胚 (P<0 .0 5 )。作者还研究了卵母细胞的采集方法、激活程序和卵龄对卵丘细胞核移植重构胚体外发育的影响 ;以血清饥饿法将卵丘细胞诱导至 G0或 G1期 ,抽吸法 /解剖法采集卵母细胞 ,体外培养 33或 4 4 h,将卵丘细胞置于去核卵母细胞的卵周隙中 ,重构胚以钙离子载体 A2 3817或电脉冲结合6 - DMAP激活处理 ,体外培养 6 d,结果表明 ,卵母细胞采集方法、激活液中细胞松弛素 (CB)、激活程序并不影响重构胚的发育 (以…     

钙离子载体A23187联合嘌呤霉素对人体外成熟卵母细胞孤雌激活作用的研究

目的：探讨钙离子载体A23187或联合嘌呤霉素（puromyein）对人类体外成熟卵母细胞的孤雌激活作用。方法：收集体外培养成熟的人卵母细胞124枚,根据体外成熟培养的时间分为24、48、72h组。分别采用A23187、A23187联合嘌呤霉素进行孤雌激活,然后应用荧光原位杂交（FISH）技术对孤雌胚胎进行性染色体分析。结果：A23187或联合嘌呤霉素能激活体外成熟的卵母细胞．激活率分别为38．9％、71．8％;二者联合应用能有效地提高孤雌胚胎的发育潜能。随着体外成熟培养的时间延长．A23187联合嘌呤霉素对卵母细胞激活率呈下降趋势;其中24、48h组成熟的卵母细胞激活率和胚胎发育潜能显高于72h组。FISH对9个孤雌胚胎的性染色体分析示,7个孤雌胚胎为XX,2个为X。结论：钙离子载体A23187联合嘌呤霉素能有效地激活人体外成熟卵母细胞．形成的孤雌胚胎核型多数为双倍体。     

羊卵泡卵母细胞孤雌激活研究

目的卵母细胞孤雌激活是胚胎体外生产的一项重要技术。本试验通过乙醇、离子霉素和6-DMAP不同浓度和不同激活时间的优化组合，提高孤雌激活效果和孤雌胚发育能力。方法与结果试验1，体外成熟的卵母细胞经5M离子霉素或7％的乙醇激活5min，然后在6-DMAP中激活4h，6-DMAP的浓度设置为0．5mM、1．0mM、2．0mM和3．0mM；结果表明，浓度为2．0mM和3．0mM6-DMAP激活的卵母细胞卵裂率（37．50％）显著高于其他各组（P〈0．01）。试验2，体外成熟的卵母细胞经5M离子霉素激活5min，然后在2．0mM6-DMAP中激活1h、3h、5h、7h和9h；结果表明，卵母细胞在6-DMAP中激活5h和7h其囊胚率（12．38％和10．48％）显著高于其他各组（P〈0．01）。结论本研究认为Ionomycin和乙醇为激活剂时，6-DMAP的孵育时间以5h为宜。Ionomycin比乙醇激活效果好，但乙醇与Ionomycin简单便捷。     

实验兔胞内单精子注射技术

目的 建立实验兔胞内单精子注射技术(intracytoplasmic sperm injection,ICSI).方法 实验1比较了hCG注射后不同取卵时间对ICSI胚体外发育的影响.实验 2 比较了不同的激活方式对ICSI胚体外发育的影响.实验 3 比较了不同状态的兔精子ICSI胚胎体外发育结果.结果 (1)hCG注射后14 h取卵,其卵裂率、桑椹胚率和囊胚率(82.2%、72.9%和62.2%)都比16 h(75.9%、70.0%和53.3%)的高,但是差异无显著性(P>0.05);18 h取的卵注射后不能卵裂.(2)机械刺激组和离子霉素 6-DMAP组,ICSI后其卵裂率分别为82.2%和81.1%(P>0.05),桑椹胚率分别为72.9%和66.2%(P>0.05),囊胚率分别为51.3%和62.3%(P<0.05),机械刺激组和离子霉素组之间卵裂率和桑椹胚率差异无显著性,但是囊胚率差异有显著性.(3)新鲜精子组和冻融活精子组卵裂率(81.1%和68.8%)和囊胚率(62.3%和40.4%)差异有显著性(P<0.05),而桑椹胚率(66.2%和61.9%)差异无显著性(P>0.05).结论 精子冷冻前后,通过ICSI所得的桑椹胚均能孵化,表明已初步建立了实验兔的ICSI技术.     

不同浓度雷帕霉素对小鼠卵母细胞体外成熟及发育潜能的影响

目的 探究不同浓度雷帕霉素对小鼠卵母细胞体外成熟(in vitro maturation, IVM)结局的影响及其在最佳浓度下对卵母细胞质量产生的具体效应。方法 收集雌性ICR小鼠的未成熟卵母细胞(GV期)进行IVM,在培养液中添加不同浓度的雷帕霉素(1 nmol/L～10μmol/L),通过比较成熟率和激活率,筛选最佳作用浓度。随后,在处理组的培养液中加入最佳浓度的雷帕霉素,对处理组与对照组中IVM卵母细胞的激活后发育情况、纺锤体组装、染色体排列情况进行比较。结果 10 nmol/L雷帕霉素培养组的卵母细胞在IVM后呈现出较高的成熟率[(84.5±1.6)%]和激活率[(62.4±1.5)%],故选择10 nmol/L作为添加雷帕霉素的最佳浓度。在随后的培养中,10 nmol/L雷帕霉素组激活胚胎的卵裂率和囊胚形成率也较对照组显著升高[卵裂率：(54.9±2.6)%vs.(41.9±2.1)%,P=0.0178;囊胚形成率：(12.5±1.6)%vs.(6.4±1.4)%,P=0.0441]。此外,与对照组相比,10 nmol/L雷帕霉素组的成熟卵母细胞染色体排列异常率降低[染色体异...     

不同活化方法对小鼠孤雌发育的影响

目的:探讨细胞核移植程序中电融合与氯化锶(SrCl2)活化处理对小鼠卵母细胞孤雌发育的影响。方法:用不同浓度SrCl2作用不同时间,不同条件的电脉冲对小鼠卵母细胞进行孤雌激活。结果:10 mmol/L SrCl2与5mmol/L SrCl2处理6 h,卵母细胞的活化率差异不显著(82.4％vs 85.4％),但显著高于10 mmol/L SrCl2与5 mmol/L srCl2处理4 h。10 mmol/L SrCl2处理6 h的体外发育至桑胚椹和囊胚的比显著高于5 mmol/L SrCl2处理6 h组(42.4％vs 24.4％,P<0.05)。单独电脉冲激活(1.0 kV/cm,320 μs,3次)的活化率(70.9％)最高,但体外发育至囊胚比率低(7.9％)。电脉冲与SrCl2结合处理时,以1.8 kV/cm 10 μs 1次脉冲刺激后,再经10 mmol/L SrCl2处理6 h,活化率和囊胚率分别为75.0％和57.3％。结论:电脉冲与SrCl2联合处理小鼠卵母细胞,可以促进小鼠卵母细胞的孤雌发育。     

操作台温度对小鼠卵母细胞受精及胚胎发育的影响

目的:探讨操作台温度对小鼠卵母细胞受精及胚胎发育的影响。方法:应用超促排卵技术获得小鼠卵母细胞,体外培养后受精,继续培养胚胎至囊胚期。观察在不同的操作台温度下小鼠卵母细胞的受精及胚胎的发育情况。结果:卵母细胞收集期操作台温度升高至38.0±0.2°C,两原核形成率(2PN率)和囊胚形成率分别为89.82%和41.66%,显著低于操作台温度为37.0±0.2°C的2PN率96.25%(P<0.05)和囊胚形成率57.50%(P<0.05)。胚胎培养期操作台温度升高至38.0±0.2°C,受精率、卵裂率和囊胚形成率与操作台温度为37.0±0.2°C时期的受精率、卵裂率和囊胚形成率无显著差异。结论:卵母细胞收集期操作台温度升高至38.0±0.2°C会降低小鼠卵母细胞2PN受精率、胚胎卵裂率和囊胚形成率,提高异常受精率。胚胎培养期操作台温度升高对小鼠卵母细胞受精率、胚胎卵裂率和囊胚形成率无影响。     

激活方法和培养体系两种因素对大鼠-牛异种核移植重组胚胎体外发育的影响

目的 :构建大鼠 -牛异种体细胞核移植重组胚胎 ,探讨激活方法和培养体系两种因素对重组胚胎体外发育的影响。方法 :采用血清饥饿法同步处理的 SD大鼠成纤维细胞为供体细胞 ,以牛去核卵母细胞为受体 ,显微直接注射法构建重组胚 ,在 M199成熟培养基中 ,分别采用透明质酸酶、放线菌酮和 6- DMAP+乙醇 3种化学激活方法激活重组胚 ,并分别观察重组胚被放线菌酮激活后在 M16 、M199和改良的 CZB3种培养基中的发育情况。结果 :透明质酸酶、放线菌酮和 6- DMAP+乙醇激活重组胚胎 ,卵裂率分别是 5 .36%、1 5 .42 %、1 7.86% ;M16 、M199和改良的 CZB培养重组胚胎 ,卵裂率分别是 9.0 9%、1 6.1 7%、1 7.0 5 %。结论 :放线菌酮和 6- DMAP+乙醇均可有效激活重组胚 ;M199和改良的 CZB均可支持胚胎的体外发育 ,且二者胚胎培养的效果显著优于 M16 。     

注核方法对大鼠-小鼠种间体细胞核移植重组胚发育的影响

目的 :探讨胞质内直接注核法和电融合法对大鼠 -小鼠种间体细胞核移植重组胚发育的影响。方法 :采用血清饥饿法同步化处理的 SD大鼠成纤维细胞作为供体细胞 ,常规超排 KM小鼠获得卵母细胞 ,采用盲吸法去核 ,分别采用直接注核法和电融合法构建重组胚胎 ,6- DMAP+ CCB+乙醇激活重组胚 ,CZB培养液中培养。结果 :电场强度 ( V/cm)和脉冲 ( ms)为 :1 5 0 0 /30 ;1 5 0 0 /40 ;1 80 0 /30 ;1 80 0 /40时 ,融合率为 :81 .5 % ;83.3% ;77.6% ;82 .0 %。直接注核法和电融合法构建重组胚的卵裂率分别为 33.1 %和 2 8.9% ,桑椹胚发育率为 1 7.8%和 1 5 .5 %。结论 :电场强度为 1 5 0 0～ 1 80 0 V/cm,脉冲为 30 ms或 40 ms时 ,都能获得较高的融合率 ;直接注核法构建的核移植重组胚胎的卵裂率要比电融合法略高 ,但统计学分析差异不显著     

核方法对大鼠-小鼠种间体细胞核移植重组胚发育的影响

目的探讨胞质内直接注核法和电融合法对大鼠-小鼠种间体细胞核移植重组胚发育的影响.方法采用血清饥饿法同步化处理的SD大鼠成纤维细胞作为供体细胞,常规超排KM小鼠获得卵母细胞,采用盲吸法去核,分别采用直接注核法和电融合法构建重组胚胎,6-DMAP+CCB+乙醇激活重组胚, CZB培养液中培养.结果电场强度(V/cm)和脉冲(ms)为 1500/30; 1500/40; 1800/30; 1800/40时,融合率为 81.5%; 83.3%; 77.6%; 82.0%.直接注核法和电融合法构建重组胚的卵裂率分别为33.1%和28.9%,桑椹胚发育率为17.8%和15.5%.结论电场强度为1500～1800V/cm, 脉冲为30ms或40ms时,都能获得较高的融合率;直接注核法构建的核移植重组胚胎的卵裂率要比电融合法略高,但统计学分析差异不显著.     

昆明小鼠成熟卵母细胞体外受精及受精卵体外培养的研究

目的通过比较获能受精液成分及成熟卵母细胞的处理方法，观察对昆明小鼠体外受精(IVF)效果的影响和用于早期胚胎培养的三种发育培养液培养效果，探讨并建立起适合于昆明小鼠卵子体外受精与受精卵体外发育的实验体系。方法用T6或FM两种获能受精液对采自昆明雄鼠附睾尾的精子与成熟卵母细胞进行体外受精(IVF)，受精前对成熟卵母细胞选用透明质酸酶去除卵丘细胞和不去卵丘细胞(对照组)两种方法进行处理，受精卵分别用M16、改良的CZB液(mCZB)和改良的M16液(mM16)三种发育培养液对体外受精胚进行培养。结果选用FM获能受精液的受精率极显著高于T6液(92．3％对64．7％)，且体外受精前先用透明质酸酶处理的成熟卵母细胞比对照组成熟卵母细胞受精率要低(59．2％对64．7％)，但差异不显著；用mM16培养液进行培养时桑胚率及囊胚率(55．3％和35．6％)显著高于mCZB(13．3％和8．1％)和M16培养液(17．3％和14．7％)，后两者差异不显著。结论昆明小鼠卵子体外受精时宜选用FM受精获能液，不宜用透明质酸酶去除卵丘细胞，且宜选用mM16培养液对昆明小鼠体外受精卵进行早期培养，其中的亚硫磺酸钠可有效的克服2-细胞胚后的体外发育阻滞现象。     

一种非Piezo依赖的高卵子存活率小鼠显微授精技术

目的对已建立的非Piezo依赖的小鼠显微授精技术作进一步改良,以获得更高的卵子存活率。方法将卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)技术中对卵子深吸持后直接深穿刺(一步法非Piezo-ICSI组)的步骤分成两步进行(两步法非Piezo-ICSI组):先浅吸持后浅穿刺,再进一步深吸持后深穿刺;另以孤雌激活发育的卵子作为卵子质量对照组。比较两步法非Piezo-ICSI组与一步法非Piezo-ICSI组卵子的存活率、原核出现率和卵裂率。结果两步法非Piezo-ICSI组的卵子存活率(92.2%)显著高于一步法非Piezo-ICSI组(83.7%)(P<0.01);而原核出现率和卵裂率与一步法非Piezo-ICSI组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论小鼠卵子胞膜在被新型持卵管深吸持时的变形造成了部分卵子胞膜变脆,两步法吸持穿刺在深吸持前进行了穿刺,避免了脆性敏感时的穿刺,有利于卵子存活。     

细胞松弛素B和解冻方法对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响

 【目的】探讨细胞松弛素B和解冻程序对玻璃微细管法（GMP）玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响。【方法】以小鼠MII期卵母细胞为模型，研究冷冻前细胞松弛素B预处理、不同解冻程序对小鼠卵母细胞冷冻效果的影响；随后对经GMP玻璃化冷冻的卵母细胞直接进行培养以检测冷冻是否诱发孤雌发育。【结果】与对照组相比．细胞松弛素B预处理的卵母细胞存活率、受精率、卵裂率及囊胚率没有显著差异（89．3％vs91．3％．44．0％vs40．4％，30．0％vs27．7％，4．0％vs6．4％；P〉0．05）；采用连续浓度梯度递减解冻法的受精率明显高于间断浓度梯度递减解冻法（57．4％vs40．4％；P〈0．05），且前者的卵裂率和囊胚发育率也相对较高f40，2％vs27，7％，14．5％vs6．4％；P〉0．05）。冷冻复苏后卵母细胞的孤雌发育率稍高于未经冷冻的卵母细胞（17．1％vs3．2％；P〉0．05）。【结论】细胞松弛素B预处理对MII期小鼠卵母细胞的GMP玻璃化冷冻保存效果没有影响：采用连续浓度梯度递减解冻法能明显提高复苏后卵母细胞的体外发育能力。     

人卵母细胞的电脉冲辅助激活

[目的]探讨电脉冲刺激进行人卵母细胞的人工辅助激活的可行性。[方法]不同卵龄和来源的人卵母细胞分为4组,49个新鲜成熟的卵母细胞作为A组,42个常规体外受精(IVF)中未受精的成熟卵母细胞为B组,C组为卵浆内单精子注射(ICSI)后未受精卵母细胞57个,D组为体外培养48h的ICSI后未受精卵母细胞37个,所有卵母细胞以直流电脉冲刺激2次,观察电脉冲刺激后卵母细胞激活和胚胎发育情况。[结果]A组卵母细胞激活率为43％(21/49),与B、C、D3组相比偏低,差异具有统计学意义(P均<0.05),A组中激活后卵母细胞主要表现为一原核二极体(IPN+2PB),而C组和D组则以二原核二极体(2PN+2PB)占多数。A、B、C组激活后卵母细胞分裂率分别为81％(17/21),83％(24/29)和88％(38/43),较D组(19％,5/26)显著增加(P<0.01),在电脉冲刺激后第3天,A、B、C组分别有18％(3/17),29％(7/24),31％(11/35)的胚胎发育到8-细胞阶段。[结论]不同来源和卵龄的人卵母细胞在电脉冲刺激后表现为不同的激活类型和胚胎发育情况,直流电脉冲作为一种有效的卵母细胞人工激活方法可以应用于辅助受精。     

促性腺激素在促排卵周期未成熟卵母细胞体外培养中的应用

目的 评价卵泡刺激素和人绒毛膜促性腺激素在促排卵周期未成熟卵母细胞体外培养过程中的应用价值。方法 收集控制性超促排卵周期行单精子显微注射(ICSI)过程中得到的未成熟卵母细胞(MⅠ期和GV期), 随机分为加促性腺激素培养组和不加促性腺激素培养组, 培养24~28 h后成熟卵母细胞进行ICSI授精, 并观察胚胎发育情况, 记录成熟率、受精率、卵裂率和优胚率。结果 对于MⅠ期卵母细胞, 是否使用促性腺激素不影响其24 h成熟率、受精率、分裂率和优胚率(P>0.05)。对于GV期卵母细胞, 培养液中加入促性腺激素能提高优质胚胎率(31.3% vs 4.2%, P<0.05), 但两组的成熟率、受精率和卵裂率差异无统计学意义(P>0.05)。结论 控制性超促排卵中获得的未成熟卵母细胞进一步体外培养, 无论是否添加促性腺激素都可自然成熟, 在GV期卵母细胞的体外培养过程加入促性腺激素可获得更高的优胚率。     

mDRA-6诱导Jurkat细胞凋亡的外源性机制

目的:探讨抗人死亡受体5(DR5)单克隆功能抗体(mDRA-6)对人白血病Jurkat细胞诱导凋亡的外源性机制。方法:用显微镜观察mDRA-6作用后的Jurkat细胞形态学变化,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术定量分析技术对Jurkat细胞的凋亡进行定量分析;利用免疫印迹技术检测凋亡细胞的Caspase 10、Caspase 9、Caspase8、Caspase 7、Caspase 3等凋亡相关蛋白的表达及活化情况。结果:mDRA-6在5 mg/L浓度作用Jurkat细胞30min时就出现典型的细胞凋亡形态改变,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测显示,Jurkat细胞在30 min、60min1、20 min的凋亡率分别为30.20%、69.03%、79.55%。免疫印迹技术检测显示Caspase 9、Caspase 8、Caspase7、Caspase 3均呈现活化片断的表达,而Caspase 10无变化。结论:mDRA-6可通过细胞膜表面死亡受体信号传导途径诱导Jurkat细胞的凋亡,本研究为mDRA-6的人源化改造及后续的实验研究打下了基础。