高糖对脑微血管内皮细胞活力和内皮素-1的影响

目的：探讨体外培养条件下高糖状态对大鼠脑皮质微血管内皮细胞（Brain microvascular endothelial cells，BMEC）的影响。方法：建立大鼠脑皮质微血管内皮细胞体外培养模型，用透射电镜观察正常浓度（5．05mmol／L）和高浓度（15mmol／L、30mmol／L）葡萄糖培养基中培养24h后内皮细胞的超微结构变化，用MTT法评价内皮细胞活力，采用放射免疫方法测定内皮素-1（Endothelin-1，ET-1）含量，用原位杂交法测定ET-1mRNA表达。结果：高浓度葡萄糖可使内皮细胞超微结构损伤，细胞活力降低，ET-1分泌显著上调，并呈剂量依赖性损伤细胞，但ET-1mRNA表达无明显变化。结论：高糖对脑皮质微血管内皮细胞有显著的损伤作用，ET-1升高在糖尿病微血管病变早期可能起主要作用。     

吡格列酮对血管内皮细胞一氧化氮和内皮素分泌的影响

目的观察吡格列酮(Pio)对血管内皮细胞一氧化氮(NO)和内皮素1(ET-1)分泌的影响。方法不同浓度Pio处理体外培养的血管内皮细胞(ECV304)72 h,硝酸还原酶法和放射免疫法测定细胞上清液内NO和ET-1水平。结果(1×10-8~1×10-5)mmol/L Pio可显著促进ECV304细胞NO的释放和抑制其ET-1分泌,作用呈浓度依赖性。结论Pio可促进血管内皮细胞NO释放和抑制其ET-1分泌,这可能是Pio血管保护作用的机制之一。     

AGEs对老年大鼠内皮细胞NF-κB活性与Fn mRNA表达的影响

目的：探讨糖基化终末产物（AGEs）对老年大鼠内皮细胞中NF-κB活性及纤维结合蛋白fibronectin（Fn）mRNA表达的影响。方法：取24月龄的SD大鼠主动脉内皮细胞进行原代培养．实验分为3组。A组葡萄糖（5mmol／L）的对照组;B组AGEs（25mg／L,48h）处理组;C组AGEs（50mg／L．48h）处理组。采用荧光免疫化学法检测NF-κB活性和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测Fn mRNA的表达。结果：与对照组相比,AGEs呈浓度依赖性地诱导NF-κB的激活（P〈0．05）和上调Fn mRNA表达（P〈0．05）。结论：AGEs呈浓度依赖性地诱导内皮细胞NF-κB的活化、Fn的基因表达上调,这可能与糖尿病慢性血管并发症的发生发展有关。     

波动性高糖对人脐静脉内皮细胞中NO 合成的影响及作用机制

目的：探索波动性与持续性高糖对人脐静脉内皮细胞合成血管舒张因子一氧化氮（NO）的影响及其作用机制。方法：以体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）为研究对象,分别测定波动性高浓度葡萄糖(5.5 或20 mmol/L) 与持续性高浓度葡萄糖(20 mmol/L)环境下NO浓度,RT-PCR及Western印迹方法检测磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B（PKB/AKT）、内皮型一氧化氮合酶(eNOS）mRNA及蛋白表达水平。结果：波动性高糖组NO均明显低于持续高糖组和正常组（P<0.05）;波动组,持续高血糖组的PI3K,PKB,eNOS mRNA及蛋白表达水平均较正常组下调（P<0.01）,而波动组又低于持续组（P<0.05）。结论：波动性高血糖较持续性高血糖可能对血管内皮细胞具有更强的损伤效应,并可能通过影响信号通路PI3K/PKB/eNOS导致NO合成减少。     

葡萄糖和胰岛素对内皮细胞激肽释放酶mRNA表达的影响

目的观察葡萄糖、L-葡萄糖和胰岛素对内皮细胞激肽释放酶mRNA(TKA-mRNA)表达的影响.方法利用RT-PCR方法观察上述试剂对体外培养的内皮细胞TKA-mRNA表达的影响.结果葡萄糖浓度为4、8mmol/L时对TKA-mRNA的表达无影响;16、32mmol/L时则有明显抑制作用,浓度越高,抑制作用出现越早;等摩尔L-葡萄糖的抑制作用只在32mmol/L、培养15d时显现;胰岛素对TKA-mRNA表达无影响.结论高浓度葡萄糖是抑制内皮细胞TKA-mRNA表达的主要因素.     

高血糖水平对中度至极重度烧伤患者内皮细胞功能的影响

目的：探讨高血糖水平对中度至极重度烧伤患者内皮细胞功能的影响及其可能机制。方法选取中度至极重度烧伤患者20例,分离人静脉血管内皮细胞,分为对照组和培养基含有不同高浓度葡萄糖的实验组,其中实验A组葡萄糖10 mmol／L,实验B组葡萄糖15 mmol／L、实验C组葡萄糖20 mmol／L,检验内皮细胞活力、内皮细胞凋亡、内皮细胞迁移能力、细胞培养上清液丙二醛（ MDA）、超氧化物歧化酶（ SOD）水平。结果各实验组较对照组内皮细胞活力下降、内皮细胞凋亡率升高、内皮细胞迁移能力下降,MDA水平升高、SOD水平降低;实验B组较实验A组内皮细胞活力略下降、内皮细胞凋亡率升高、内皮细胞迁移能力下降,MDA水平升高、SOD水平降低,实验C组较实验B组内皮细胞活力明显下降、内皮细胞凋亡率升高、内皮细胞迁移能力下降,MDA水平升高、SOD水平降低。结论高血糖水平限制了内皮细胞的增殖和生长,随血糖浓度升高内皮细胞的爬行迁移能力明显减弱,且细胞凋亡速度加快,使血管通透性增加。     

游离脂肪酸及葡萄糖对鼠主动脉内皮细胞的影响及作用机制

目的探讨高糖高游离脂肪酸（freefattyacids,FFAs）对内皮细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法原代培养大鼠主动脉内皮细胞（rataortaendothelialcell,RAEC）,采用不同浓度的葡萄糖（5．5mmol／L,30mmol／L）及棕榈酸（200μmol／L、400μmol／L、600μmol／L）单独或联合作用于细胞24h、48h、72h。免疫组织化学染色方法鉴定内皮细胞并测定IL-8、Bcl-2、BAX表达水平：MTT比色法检测细胞增殖率。结果FFAs及葡萄糖单独及联合应用均可导致细胞出现凋亡形态学变化,增殖呈剂量-时间依赖性（P〈0．05）,且联合组明显低于单独培养组（P〈0．01）;干预后IL-8、BAX表达增加,Bcl-2蛋白表达逐渐减弱,Bcl-2／BAX比值逐渐减小,联合培养组表达更为明显。结论高浓度FFAs及高糖具有抑制内皮细胞生长、促进其凋亡的作用,其作用机制可能是通过葡萄糖及棕榈酸酯参与P13K／AKT等途径激活氧化应激诱导细胞凋亡。     

葡萄糖浓度对血管内皮细胞表达巨噬细胞炎性蛋白1αmRNA及蛋白的影响

目的:探讨葡萄糖浓度对人脐静脉内皮细胞表达巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1αt)mRNA及蛋白的影响.方法:将培养的人脐静脉内皮细胞用不同浓度(5.6,11.1,16.7,22.0,28.0 mmol/L)的葡萄糖孵育10 d及同一浓度(22.0 mmol/L)葡萄糖孵育0,5,10,15 d.采用原位杂交方法及Western Blot检测MIP-1αmRNA及蛋白的表达水平.结果:在一定浓度范围内(5.6～28.0 mmol/L),随着葡萄糖浓度增加,内皮细胞内MIP-1 α表达明显增加,22.0 mmol/L时表达最高,28.0 mmol/L时表达稍降低;各组内皮细胞内MIP-1α mRNA表达的平均积分光密度值分别为12.54±2.78,17.69±1.38,23.35±2.13,32.23±2.25及28.46±2.46(P＜0.05);各组内皮细胞内MIP-1α蛋白的表达量分别为5.6 mmol/L葡萄糖组的1.42倍、1.87倍、2.58倍及2.12倍(P＜0.05).同一浓度葡萄糖(22.0 mmol/L)孵育后,随着作用时间延长,内皮细胞内MIP-1α表达逐渐增加,至15 d时表达最高;各组内皮细胞内MIP-1α mRNA表达的平均积分光密度值分别为10.43±2.13,18.67±1.46,32.23±2.25及38.28±3.14(P＜0.05);各组内皮细胞内MIP-1α蛋白的表达量分别0 d组的1.75倍、3.06倍及3.64倍(P＜0.05).结论:葡萄糖浓度可促进内皮细胞MIP-1α mRNA及蛋白的表达,这种作用与葡萄糖的浓度及作用时间呈正相关.     

银杏叶提取物对同型半胱氨酸诱导LOX-1mRNA表达升高的拮抗作用

目的 观察同型半胱氨酸对血管内皮细胞血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)mRNA表达的影响并探讨银杏叶提取物对其拮抗作用.方法 采用含不同浓度(0.001,0.01和0.1 mmol/L)同型半胱氨酸的培养液孵育人脐静脉血管内皮细胞;取最能诱导LOX-1表达升高的同型半胱氨酸浓度,分别加入银杏叶提取物和B族维生素.结果 随着同型半胱氨酸浓度的增加,LOX-1 mRNA表达增加,0.1 mmol/L的同型半胱氨酸最能诱导LOX-1 mRNA的表达;同型半胱氨酸+银杏叶提取物组和同型半胱氨酸+B族维生素组LOX-1mRNA表达较同型半胱氨酸组明显减少(吸光度值0.42±0.03和0.65±0.04 vs 0.83±0.05,P＜0.05),且同型半胱氨酸+银杏叶提取物组降低幅度较同型半胱氨酸+B族维生素组更大(P＜0.05).结论同型半胱氨酸具有诱导血管内皮细胞LOX-1 mRNA表达的作用,且呈剂量依赖性.银杏叶提取物可拮抗同型半胱氨酸诱导的血管内皮细胞LOX-1 mRNA表达升高,有望应用于治疗高同型半胱氨酸所致的动脉粥样硬化.     

Cinaciguat对高糖损伤血管内皮细胞功能的影响

目的 糖尿病状态下，一氧化氮(NO)与可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylatecyclase,sGC)均被氧化，使NO-sGC-环磷酸鸟苷(cGMP)信号通路传导异常，NO-sGC-cGMP信号通路异常是糖尿病血管内皮功能障碍的重要病理基础。可溶性鸟苷酸环化酶激活剂(cinaciguat，CIN)可激活失活的sGC进而起到保护血管内皮细胞功能的作用。本研究通过体外实验制造高糖内皮细胞损伤模型，观察CIN对人脐静脉内皮细胞功能的影响。 方法 培养人脐静脉内皮细胞，并将细胞分为正常对照组、高糖组、CIN干预组，每组6例。高糖组及CIN干预组均加入33.3 mmol/L的葡萄糖制造高糖细胞损伤模型，而CIN组同时加入0.1 μmol/L CIN干预。各组细胞在培养6、24、48 h时，检测上清液中的NO水平及细胞内一氧化氮合酶(NOS)浓度；培养48 h后RT-PCR检测细胞内诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)mRNA的表达；培养48 h后Western blotting检测细胞间粘附分子-1(ICAM-1)及血管粘附分子-1(VCAM-1)蛋白的表达。 结果 与正常对照组相比，高糖组NO、NOS含量呈现早期升高晚期下降的趋势，而CIN组上述趋势消失；与正常组比较，高糖组内皮细胞的eNOS mRNA表达水平降低(P＜0.05)，iNOS mRNA、ICAM-1与VCAM-1蛋白表达明显升高(P＜0.05)，而CIN组eNOS mRNA表达水平较高糖组明显升高(P＜0.05)，iNOS、ICAM-1与VCAM-1蛋白的表达水平明显降低(P＜0.05)。 结论 CIN可平衡NOS的活性，调节NO的生成及ICAM-1与VCAM-1的表达，改善高糖状态下内皮细胞的功能。      

3,6-(二甲氨基)-二苯骈碘杂六环葡萄糖酸盐对AGEP引起的大鼠主动脉平滑肌细胞增殖及牛主动脉内皮细胞内皮素和一氧化氮改变的影响

目的 :观察 3 ,6 (二甲氨基 ) 二苯骈碘杂六环葡萄糖酸盐对AGEP引起的大鼠主动脉平滑肌细胞增殖及牛主动脉内皮细胞内皮素和一氧化氮改变的影响。方法 :采用牛血清白蛋白 (BSA)与不同浓度葡萄糖 (0 ,2 0 ,5 0 ,80mmol·L-1)体外孵育制备糖基化终产物 (AGEP) ,应用 [3 H] TdR掺入法和MTT比色法观察I-93对重度糖化的AGEP诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞 (ASMC)增殖的影响 ;应用放射免疫技术及Greiss法观察I -93对AGEP引起的牛主动脉内皮细胞 (BAEC)释放内皮素 1(ET 1)和一氧化氮 (NO)的影响。结果 :I-93 10 -7～ 10 -5mol·L-1能明显抑制AGEP引起的ASMC增殖 ,其 [3 H] TdR掺入量和MTT比色法的最大抑制率分别为79 .4%和 44 .2 %。随AGEP糖浓度的增加 (2 0～ 80mmol·L-1) ,BAEC培养液中ET 1含量亦逐渐上升 [(4 93± 63 )～ (779± 10 5 )ng·L-1] ,I -93 10 -7～ 10 -5mol·L-1能明显抑制重度糖化的AGEP促进ET 1释放的作用 ;I -93对AGEP灭活NO的作用有剂量依赖性抑制效应。结论 :I -93有抑制ASMC增殖的作用 ;对AGEP诱导的BAEC释放ET 1和NO间平衡失调有调节作用 ,在防治阻塞性血管疾病方面I -93具有潜在的应用价值     

The mechanical study of vascular endothelial growth factor on the prevention of restenosis after angioplasty

Restenosis following percutaneous transluminalcoronary angioplasty ( PTCA) is one of the majorre-search subjects of coronary heart disease( CHD) .The mechanism is quite complicated and not yetclear,buttheimpairmentofendothelium isknown asthe primary evocative factor of the progress ofrestenosis.It is supposed to prevent the restenosisfollowing PTCA by accelerating restoration of en-dothelial integrity and function.In the experimentalstudies,it was proved that exogenic vascular en-dothelial…     

人气道上皮细胞内皮素转换酶-1反义RNA构建

目的　研究内皮素转换酶 -1(ECE -1)反义RNA对人气道上皮细胞ECE -1表达的抑制作用。方法　构建ECE -1反义RNA表达载体 ,用脂质体 (FuGENG 6)转染人气道上皮细胞株 (16HBE) ,G418筛选得到稳定表达反义ECE -1RNA的细胞株 (anti -16HBE)。RT -PCR检测转染细胞ECE -1mRNA的表达 ,Westernbloting检测细胞ECE蛋白表达情况。结果　①经酶切及DNA测序鉴定证明 ,0 7kb的ECE -1DNA片段反向连接到带有萤光蛋白基因为报告基因的pEGPC1表达载体 ;荧光倒置显微镜显示大量细胞分泌荧光蛋白并能反复传代稳定表达 ;②anti -16HBE细胞ECEmRNA基因表达 (ECE/actinβ 0 0 12 5± 0 0 5 8)比 16HBE细胞 (ECE/actinβ 0 13 4 7± 0 0 67)明显低 (P <0 0 5 ) ;而Westerbloting亦显示anti -16HBE细胞ECE表达量比 16HBE细胞明显低。结论　ECE反义RNA表达载体可抑制人气道上皮细胞ECE -1表达与分泌     

血瘀证兔模型血管内皮细胞中一氧化氮合酶 的基因表达及其分泌一氧化氮的变化

【目的】了解实验性血瘀证动物模型血管内皮细胞中一氧化氮合酶(NOS)的基因表达及其分泌NO的变化。【方法】用半定量RT-PCR方法检测模型组体内血管内皮细胞及体外培养的细胞中组成型一氧化氮合酶mRNA的表达,并相应测定分泌的NO水平。【结果】与对照组比较,模型组兔体内血管内皮细胞中组成型NOS(cNOS)基因表达以及血浆和原代培养液中NO水平皆明显下降(P＜0.01),同期血浆中NO含量与内皮细胞中cNOSmRNA的表达水平呈正相关(r=0.739,P＜0.01)。两组间体外培养的传代细胞中cNOS基因表达及培养液上清中NO含量无明显差异(P＞0.05),但NO水平都比各自原代培养液中的明显升高(P＜0.01,P＜0.05)。【结论】短期内血瘀证兔模型体内内源性NO水平降低主要是cNOS基因表达下降导致的,随时间的延长,不排除诱导型NOS(iNOS)及体内其他因素对分泌NO的综合影响。     

Inhibitive effects of glucose and free fatty acids on proliferation of human vascular endothelial cells in vitro

Objectives To investigate the effects of glucose and free fatty acids (FFAs) on the proliferation and cell cycle of human vascular endothelial cells in vitro , and to examine whether the combined presence of elevated FFAs and glucose may cross-amplify their individual injurious effects.Methods Cultured human vascular endothelial cells (ECV304) were incubated with various concentrations of glucose and/or FFAs (palmitate and/or oleate) for 24-96 h. Morphologic alterations were observed using a phase contrast microscope and an electron microscope. Inhibition of proliferation was measured by a colorimetric 3-［4, 5-dimethyl thiazol-2-yl］-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. Cell viability was determined using trypan blue exclusion. Distribution of cells along phases of the cell cycle was analyzed by flow cytometry. Results Glucose 15 or 30 mmol/L, palmitate (PA) 0.25 or 0.5 mmol/L, and oleate (OA) 0.5 mmol/L inhibited proliferation and accelerated death of endothelial cells in a dose-and-time-dependent manner. After treatment with elevated glucose and/or FFAs, the G(0)/G(1) phase cells increased, whereas S phase cells decreased, suggesting that high glucose and/or FFAs mainly arrested endothelial cells at G(0)/G(1) phase. The inhibitive rates of proliferation and population of dead cells in endothelial cells incubated with glucose plus FFAs (glucose 30 mmol/L+PA 0.25 mmol/L, glucose 30 mmol/L+OA 0.5 mmol/L, glucose 30 mmol/L+PA 0.25 mmol/L+OA 0.5 mmol/L) increased more markedly than those treated with high glucose or FFAs (PA and/or OA) alone. Conclusion Both high ambient glucose and FFAs can inhibit proliferation and accelerate death of endothelial cells in vitro. These changes were cross-amplified in the combined presence of high levels of glucose and FFAs.     

阿托伐他汀对血管内皮细胞增殖过程中FKBP12mRNA和细胞上清液ET-1的影响

目的探讨不同浓度阿托伐他汀对血管内皮细胞（VEC）增殖过程中FK506结合蛋白12（FKBP12）表达和细胞上清液ET-1的影响。方法培养大鼠VEC并传代,观察其不同浓度阿托伐他汀作用下的不同时期FKBP12mRNA水平的表达和细胞上清液ET-1的变化。结果阿托伐他汀抑制血管内皮细胞增殖过程中FK—BP12的表达,抑制血管内皮细胞合成和分泌ET-1;血管内皮细胞FKBP12表达和ET-1分泌基本一致,呈正相关,阿托伐他汀对它们的抑制作用且呈时间依赖性和剂量依赖性。结论阿托伐他汀通过降低FKBP12表达抑制血管内皮细胞增殖并对ET-1合成和分泌起负性调节作用。     

瘦素在诱导血管内皮细胞纤溶酶原激活物抑制物-1表达中的作用

目的通过体外研究探讨瘦素对血管内皮细胞纤溶酶原激活物抑制物-1表达的影响。方法Ⅱ型胶原酶消化法分离和培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）,在不同时间采用不同剂量瘦素培养HUVECs,应用荧光定量PCR、Northern blot以及Western blot检测技术研究瘦素对HUVECs PAI-1 mRNA及蛋白表达的影响。结果100ng／ml瘦素作用于内皮细胞,PAI-1 mRNA表达水平随着时间延长呈升高的趋势,8h达到最高（P〈0．001）,24h后仍高于起点（P〈0．005）,而tPA的表达则无显著变化（P〉0．05）。不同浓度的瘦素作用于内皮细胞,其PAI-1 mRaNA水平呈剂量依赖性升高（P〈0．001）;tPAmRNA表达亦无显著变化（P〉O．05）。100ng）ml瘦素孵育HUVECs时间依赖性促进PAI-1蛋白表达,24h达到最高峰。结论瘦素可能通过诱导血管内皮细胞PAI-1表达促进动脉粥样硬化和血栓的形成。     

依帕司他对高糖诱导的血管内皮损伤的保护作用

目的初步研究依帕司他保护高糖诱导的血管内皮细胞损伤的作用。方法体外培养脐静脉血管内皮细胞HUVEC,高糖刺激8 h后利用化学发光法检测细胞培养上清中NO的含量,利用Real time PCR和Western blot分别检测细胞中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的mRNA和蛋白表达水平,以同浓度的甘露醇作为对照。给予依帕司他(0.1μmol/L)预处理30 min,随后再进行高糖培养,检测NO的含量以及eNOS的mRNA和蛋白表达,同时检测依帕司他的靶向基因醛糖还原酶(AR)以及NO的上游基因NADPH氧化酶4(NOX4)的蛋白表达水平。结果高糖培养8 h之后,血管内皮细胞分泌NO下降,eNOS的mRNA和蛋白表达水平下降,与甘露醇对照组相比,具有统计学差异(P<0.05);预先给予依帕司他处理后再进行高糖培养,细胞中eNOS的mRNA和蛋白表达水平均升高,NO表达上调,与单独高糖培养组相比,具有统计学差异(P<0.05)。同时,细胞中AR和NOX4的蛋白表达下降。结论高糖可以诱导内皮细胞损伤,表现为NO的分泌水平降低。依帕司他可能是通过抑制AR和NOX4的表达而发挥对血管内皮细胞损伤的保护作用。     

血瘀证兔血清对培养的血管内皮细胞活性因子基因表达的影响

【目的】探索血瘀证形成和发展过程中血管内皮细胞活性因子内皮素和一氧化氮 (NO)改变的分子机理。【方法】用半定量RT -PCR方法 ,观察血瘀证兔模型血清对体外培养的血管内皮细胞内皮素 (ET)和组成型NO合成酶 (constitutivenitricoxidesynthase ,cNOS)基因表达的影响。【结果】血瘀证动物模型血清导致体外培养的内皮细胞中ET - 1mRNA表达升高 (P <0 .0 1) ,cNOSmRNA表达下降 (P <0 .0 1) ,两者呈显著负相关 (r=- 0 .857,P <0 .0 1)。【结论】血管内皮细胞中ET基因高表达及cNOS基因低表达导致的二者平衡失调在血瘀证形成和发展过程中起着重要作用。