利用固定化酵母细胞生产ATP

利用明胶戊二醛制备的固定化啤酒酵母细胞,由腺苷酸(AMP)生产腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)。在含有15 mmol/L AMP,75 mmol/L葡萄糖,5mmol/L硫酸镁(MgSO_4·7 H_2O)的0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)中,在34℃振荡反应1h,ATP转化率可达100%,分批连续反应10次,ATP转化率保持在90%以上。     

甲氨喋呤和三磷酸腺苷诱导U937细胞凋亡机制探讨

目的 :探讨甲氨喋吟、三磷酸腺苷诱导髓性白血病细胞系U937细胞凋亡过程中P73mRNA的表达变化 ,以进一步了解P73基因在U937细胞凋亡中的作用。方法 :用上述药物诱导U937细胞凋亡 ,凋亡指标采用细胞形态学、DNA片段电泳、流式细胞术检测DNA含量等方法 ;采用半定量逆转录PCR (RT -PCR)检测P73mRNA的表达变化。结果 :甲氨蝶呤、三磷酸腺苷均可诱导U937细胞凋亡。 5 μmol/L的甲氨蝶呤和0 .2 5g/L的三磷酸腺苷分别作用于U937细胞 6h、2 4h ,光镜下见细胞明显聚集、体积缩小 ,Wright’s Giemsa染色见染色质明显浓缩、核碎裂等现象 ,而对照组未出现上述现象 ;DNA片断电泳见清晰的梯形条带 ;流式细胞仪检测 :5 μmol/L的甲氨蝶呤作用于U937细胞 6h、8h、10h ,细胞的凋亡率分别为 :5 .15 %、11.4 3%、14 .7% ,0 .2 5 g/L的三磷酸腺苷作用于U937细胞 2 4h、36h、4 8h细胞的凋亡率分别为 :2 .33%、11.90 %、35 .4 9% ,而对照组的细胞凋亡率分别为 :0 .0 0 %和 1.0 9% ;半定量RT -PCR结果 :与对照组相比 ,仅三磷酸腺苷处理 4 8h组P73mRNA的表达下调。结论 :在U937细胞凋亡过程中P73的mRNA表达差异无统计学意义。     

溶血卵磷酯对人内皮细胞CD73的调节

【目的】探讨溶血卵磷脂（LPC）对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）胞外5′-外核苷酸酶CD73的调节作用。【方法】将已汇聚HUVEC的细胞培养皿分为3组：①对照组：培养皿中仅加入乙烯-单磷酸腺苷（eAMP,5μmol/L）;②LPC组：培养皿中在加入eAMP（5μmol/L）前加入LPC10μmol/L;③AOPCP组：培养皿中加入eAMP（5μmol/L）前加入胞外5′-外核苷酸酶抑制剂α,β-甲基腺苷-5′-二磷酸（AOPCP,50μmol/L）及LPC10μmol/L。在试验第15、30、45min时以高性能液相色谱仪（HPLC）测定各培养皿中乙烯-腺苷（eAD）含量。【结果】在上述3个时间点LPC组eAD生成较对照组显著增高（P〈0.05）,而AOPCP组较对照组显著减少（P〈0.001）。【结论】①HUVEC细胞外存在腺苷分泌;②采用eAMP的细胞培养皿试验模型可很好地观察CD73活性,可用于CD73活性研究;③LPC可兴奋HUVEC细胞外5′-核苷酸酶,增加腺苷的分泌。     

溶血卵磷酯对人内皮细胞CD73的调节

【目的】 探讨溶血卵磷脂(LPC)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)胞外5′-外核苷酸酶CD73的调节作用。【方法】 将已汇聚HUVEC的细胞培养皿分为3组:①对照组:培养皿中仅加入乙烯-单磷酸腺苷(eAMP,5 μmol/L);②LPC组:培养皿中在加入eAMP (5 μmol/L)前加入LPC 10 μmol/L;③AOPCP组:培养皿中加入eAMP(5 μmol/L)前加入胞外5′-外核苷酸酶抑制剂α,β-甲基腺苷-5′-二磷酸(AOPCP,50 μmol/L)及LPC 10 μmol/L。在试验第15。30。45 min时以高性能液相色谱仪(HPLC)测定各培养皿中乙烯-腺苷(eAD)含量。【结果】 在上述3个时间点LPC组eAD生成较对照组显著增高(P < 0.05),而AOPCP组较对照组显著减少(P < 0.001)。【结论】 ①HUVEC细胞外存在腺苷分泌;②采用eAMP的细胞培养皿试验模型可很好地观察CD73活性,可用于CD73活性研究;③LPC可兴奋HUVEC细胞外5′-核苷酸酶,增加腺苷的分泌。     

血清5′-核苷酸酶测定

5′-NT催化各种核苷-5′-磷酸和脱氧核苷-5′-磷酸水解,生成相应的核苷或脱氧核苷和无机磷酸。临床检验中5′-NT的测定主要有比色法、紫外分光光度法、放射性同位素法等。其比色法试剂价廉,操作简便,可作自动分析,目前国内最常用的方法需要除去蛋白、操作繁琐,结果精密度低。笔者采用Wood方法并加以改良SDS作为蛋白增溶剂,是一种不除蛋白,标本用量少、反应灵敏、快速,试剂较稳定的直接测定方法。1　材料与方法1.1试剂　(1)0.04mol/L的巴比妥缓冲液(pH7.5)。(2)0.04mol/L的硫酸锰溶液。(3)0.1mol/L的氯化镍溶液。(4)5′-AMP基质液:精确…     

环磷腺苷中5′-磷酸腺苷的纸色谱鉴别

目的:改进环磷腺苷中5′-磷酸腺苷的纸色谱鉴别方法.方法:采用ψ(4%醋酸铵溶液∶75%乙醇)=2∶5为展开剂,调节供试品溶液pH值与对照品溶液一致.结果:5′-磷酸腺苷Rf值增大,分离效果好.     

腺苷对脐静脉内皮细胞合成VEGF蛋白及表达VEGF mRNA的影响

目的:探讨腺苷对脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell,HUVEC)合成血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白及表达VEGF mRNA的影响.方法:实验分5组进行:组1为对照组,腺苷浓度0mol/L,组2～组5为实验组,腺苷浓度分别为10-4mol/L、10-6mol/L、10-8mol/L和10-10mol/L.用免疫组织细胞化学法检测VEGF蛋白质合成,原位杂交检测VEGF mRNA表达.结果:对照组和实验组均有VEGF蛋白在胞浆中表达,呈浅黄至深棕黄色颗粒,对照组的VEGF染色阳性细胞少,染色程度轻;10-4molv、10-6mol/L浓度的腺苷作用48h后,阳性细胞明显增加,染色深,10-8mol/L、10-10mol/L浓度的腺苷对VEGF染色基本无影响.对照组与实验组均有VEGF mRNA表达,对照组原位杂交后染色阳性细胞百分率为(29.00±4.18)%.10-4mol/L、10-6mol/L腺苷作用48h后,染色阳性百分率分别上升为(73.61±4.72)%和(68.42±2.28)%,与对照组比较有统计学意义(P＜0.05);10-8mol/L、10-10mol/L腺苷作用后染色阳性率分别为(34.04±5.92)%和(33.80±5.54)%,与对照组比较无统计学意义(P＞0.05).结论:腺苷有促进HUVEC合成和分泌VEGF蛋白的作用,并可上调VEGF mRNA的表达.     

DNA与对氨基苯酚相互作用的初步研究

目的：探讨DNA与对氨基苯酚的相互作用。方法：在0．05mol／L Na2HPO4-0．05mol／L NaH2PO4-0．10mol／L NaCl缓冲体系（pH=7．30）中研究对氨基苯酚在核苷三磷酸修饰电极及DNA修饰电极上的电化学行为。结果：双链DNA（dsDNA）和单链DNA（ssDNA）均可减小对氨基苯酚的氧化峰峰电流，在三磷酸腺苷（dATP）、三磷酸鸟苷（dGTP）修饰电极上的电化学行为与之相似。结论：三磷酸腺苷（dATP）、三磷酸鸟苷（dGTP）和DNA与对亚氨基苯醌以较强的氢键结合，与对氨基苯酚作用力较小。     

川芎嗪抗伤害性反应作用机制初探

目的　观察川芎嗪(TMP)对嘌呤2 X(P2 X)受体激动剂[三磷酸腺苷(ATP)和α,β-亚甲三磷酸腺苷(α,β- me ATP) ]、前列腺素E2 (PGE2 )及P物质(SP)所致大鼠足底急性伤害性反应的影响。方法　通过大鼠痛行为反应确定局部应用TMP对ATP等P2 X受体激动剂、PGE2 及SP所致大鼠足底急性伤害性反应和足底炎症水肿的影响。结果　TMP (10 mm ol/L )明显抑制ATP (1μm ol/L )或α,β- m e ATP (0 .6μm ol/L )引起的大鼠足底急性伤害性反应。TMP(10 m mol/L)可抑制PGE2 (5 μmol/L)或α,β- me ATP(0 .2 μm ol/L)加PGE2 (5 μmol/L )引起的伤害性反应。TMP (10 m mol/L )不影响α,β- me ATP (0 .2μmol/L )加SP (10μmol/L )引起的伤害性反应。TMP对PGE2 、SP或α,β- m e ATP分别加PGE2 或SP引起的大鼠足底炎症水肿无明显影响。结论　TMP主要通过抑制P2 X受体兴奋介导的伤害性信息传递产生抗伤害性反应作用。     

歧化反应合成对氨基苯甲醛的动力学

用动力学方法研究对硝基甲苯(PNT)和多硫化钠(Na_2S_x)在碱性乙醇介质中形成对氨基苯甲醛(PAB)的时间进程。结果表明反应速度只与PNT浓度有关,属准一级反应;在微沸温度(83℃)及反应物PNT的起始浓度为0.304mol/L和0.152mol/L时,表观速度常数k′分别为3.32×10~(-2)min~(-1)和3.42×10~(-2)min~(-1);在最佳条件下,反应可于160min完成,转化率为94%(实际产率91%);还报道了不同条件下的转化率,为指导生产实践提供依据。     

分化抑制因子1相互作用蛋白AGGF1的筛选

目的 利用酵母双杂交方法,筛选成人肺组织文库中与分化抑制因子1(Id1)相互作用的蛋白.方法 PCR方法扩增Id1的编码序列并定向克隆入诱饵质粒pHybLex/Zeo,构建重组诱饵质粒pHybLex/Zeo-Id1,酶切鉴定后转化人酵母株EGY48/pSH18-34,检测重组诱饵质粒有无非特异激活报告基因Leu2、LacZ作用;扩增并提取成人肺组织文库质粒,将文库质粒及重组诱饵质粒转化入酵母细胞,依次筛选Leu2 ,Leu2 LacZ 克隆;设置阴性及阳性对照,重复筛选Leu2 LacZ 克隆并排除假阳性克隆,获取真阳性文库质粒,进行测序和同源性比对.结果 酶切证实,重组诱饵质粒构建成功.重组诱饵质粒转化入酵母细胞后.经检测无非特异激活报告基因作用.扩增并筛选成人肺组织文库.获得198个Leu2 及19个Leu2 LacZ 克隆.经排除假阳性克隆,最终获得1个Leu2 LacZ 真阳性克隆,经测序和同源性比较证实该克隆与蛋白AGGF1高度同源(556/559,99.5%),Westem blotting证实其在酵母细胞中有表达.结论 利用酵母双杂交方法,通过筛选成人肺组织文库,发现Id1与AGGF1存在相互作用.     

利用膜蛋白酵母双杂交系统构建人尿道上皮细胞cDNA文库

利用基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交技术,构建人永生尿道上皮细胞(SV-HUC-1)cDNA文库。Trizol法提取人尿道上皮细胞总RNA,并分离纯化其mRNA;以mRNA为模板,合成cDNA第一链、第二链;通过T4 DNA聚合酶将DNA链两端加上5′接头;并将其大于1 kbp的片段与膜蛋白酵母双杂交载体pPR3-N连接,经电转化大肠杆菌感受态细胞,以构建基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,并检测文库的库容量和随机性。本研究成功构建了人尿道上皮细胞的基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,为进一步研究泌尿生殖道感染病原体与宿主尿道上皮细胞的相互作用奠定了实验基础。     

用固定化啤酒酵母细胞合成胞嘧啶核苷二磷酸胆碱

κ－卡拉胶－魔芋多糖复配胶包埋的啤酒酵母细胞，经冻融处理后用于合成胞嘧啶核苷二磷酸胆碱（CDP－胆碱）。结果表明：250mL摇瓶中加入50mL反应液（葡萄糖400mol/L，CMP10mmol/L，磷酸碍碱50mmol/L,K2HPO4-KH2PO4缓冲液100mmol/L，MgSO410mmol/L,pH=8.0），固定化细胞1200g/L,34℃、150r/min下，反应4h后补加400mmol/L葡萄糖，反应8h可使60％以上的CMP转化为CDP－胆碱。反应液经灭菌和添加辅酶I（NAD^ ）后，固定化细胞可连续使用4次，CDP－胆碱转化率维持在40％以上。     

人早幼粒细胞cDNA文库的构建及其鉴定

目的：构建人早幼粒细胞HL60的cDNA文库,阐明文库内相关基因在急性早幼粒细胞白血病（APL）发生发展中的相关机制。方法：采用Trizol法提取HL60细胞总RNA,离心柱法分离纯化样本中的mRNA,逆转录PCR法合成cDNA第一链,酶促法直接合成cDNA第二链,胶回收目的长度的cDNA片段后将其与pPR3-N载体连接,通过同源重组方法在酵母Y187菌株中构建人早幼粒细胞cDNA文库。将培养的菌液涂布于LB平板进行库容量鉴定,PCR法鉴定插入片段大小及分布。结果：提取到的HL60细胞RNA条带清晰无降解且弥散度低,以纯化后的细胞mRNA为模板成功合成cDNA,经胶回收cDNA片段后顺利将其与pPR3-N载体连接。将重组载体转化至酵母菌株Y187,通过同源重组方法在菌株中成功构建人早幼粒细胞cDNA文库。在原始电转化菌稀释100倍后取10 μL涂板,共长约250个克隆子,库容量为2.5×10⁶ CFU·mL^-1,转化后原始菌液共计5 mL,总库容量为1.25×10⁷ CFU。文库的插入片段电泳检测,平均插入片段大于1200 bp,阳性率为100%。结论：成功构建人早幼粒细胞的cDNA文库,为白血病的发病机制及治疗机制的研究奠定了基础。     

酵母菌凋亡

凋亡是多细胞动物生长中重要的细胞自杀性程序。凋亡的异常可以引起一系列的疾病。虽然其在肿瘤、神经系统疾病、艾滋病中的重要性引起广泛的关注，并取得了一些成果，但许多调节机制或凋亡袁型仍不清楚。本文综述了酵母菌的凋亡过程，可以更好地理解凋亡的遗传过程。     

慢性肾炎红细胞免疫粘附功能测定

本文测定了33例慢性肾炎病人的红细胞免疫功能,证明慢性肾炎红细胞免疫活性低于正常人。这种红细胞免疫功能异常与BUN和肾性贫血无关。     

毒黄素对酵母菌呼吸的影响

椰毒假单胞菌为引起酵米面和变质银耳中毒的病原菌。毒黄素是该菌产生的一种毒素。为探讨毒黄素中毒机理及寻找对毒黄素的解毒方法,我们用气体压力计法研究了毒黄素对啤酒酵母和缺陷酵母“58”两种菌株耗氧量的影响。实验结果表明,毒黄素有增加这两株酵母菌耗氧量的作用,实验也证实了毒黄素在促进这两株酵母菌耗氧量增加的同时有过氧化氢生成或生成增加。研究毒黄素对啤酒酵母氧化磷酸化的影响,显示毒黄素对氧化磷酸化有抑制作用,P/O比值降低,在0.5左右。     

Neo-Sensitabs药片扩散法与CLSI纸片扩散法氟康唑抗真菌药敏试验比较分析

目的 以临床实验室标准化研究所(CLSI)酵母菌纸片扩散法药敏试验为参照,评价Neo-Sensitabs(Rosco,丹麦)酵母菌药片扩散法药敏试验及其判定标准在中国应用的可行性.方法 分别采用Neo-Sensitabs药片扩散法与CLSI纸片扩散法药敏试验检测氟康唑对80株临床分离酵母菌的药敏结果.结果 Neo-Sensitabs药片扩散法药敏试验选取基本判读标准(R≤11 mm and S≥20 mm),氟康唑药敏结果与CLSI结果差异无显著性意义(P>0.05);而Neo-Sensitabs选取严格判读标准(R≤22mm and S≥30mm),氟康唑药敏结果与CLSI结果差异显著(P<0.05),对于热带念珠菌,应用严格判读标准时氟康唑Neo-Scnsitabs药敏结果与CLSI结果差异无显著性意义(P>0.05),而对于白色念珠菌,结果则存在显著差异.结论 Rosco Neo-Sensitabs酵母菌药片扩散法药敏试验操作简便,适合常规实验室开展,其药敏基本判读标准适合我国临床菌株,结果判读准确;而其严格判读标准不适合白色念珠菌的结果判读.     

人α-防御素5在毕赤酵母中分泌表达的研究

目的 探索人α-防御素5成熟肽(mHD5)在酵母中高效分泌表达的可行性.方法 PCR扩增获得酵母菌偏好的mHD5密码子序列,应用基因重组方法构建表达质粒,电击转化酵母菌株GS115,应用G418浓度梯度、表型和PCR技术筛选高拷贝转化株.经摇瓶发酵和甲醇诱导,Tricine-SDS-PAGE分析重组mHD5(rmHD5)表达量,并采用Western blot鉴定.选用琼脂扩散法检测rmHD5的抑菌活性.结果 构建了pPIC9K-mHD5酵母表达质粒.筛选得到3株His /Mut 表型,且耐受8 mg/ml G418的多拷贝转化酵母菌株,成功获得表达量约120 mg/L的发酵上清.rmHD3对大肠杆菌(EC25922)和金黄色葡萄球菌(SA25923)2种标准菌株均具有明显的抑菌活性.结论 防御素基因可以在毕赤酵母中实现分泌型离表达,此策略可能是抗菌肽工业化开发的有效途径之一.