益心解毒方对NOX2亚基和NOX4亚基过表达及小干扰RNA引起的心肌细胞还原型辅酶Ⅱ氧化酶活性变化的机制研究

观察益心解毒方含药血清对NOX2、NOX4 亚基过表达和小干扰RNA（RNAi）导致的H9C2心肌细胞还原型辅酶Ⅱ（NADPH）氧化酶活性的变化,探讨益心解毒方的作用机制。方法 采用正常雄性Sprague-Dawley大鼠16只,构建针对NOX2、NOX4亚基的过表达质粒和RNAi质粒。采用转染试剂瞬时转染H9C2心肌细胞,流式细胞术检测转染率,转染24 h后分组（正常H9C2细胞组、过表达组、H9C2转阴性对照质粒组、RNAi质粒组、益心解毒方高剂量组、益心解毒方中剂量组、益心解毒方低剂量组）给予不同剂量的含药血清干预,24 h后检测NADPH氧化酶活性。结果 转染NOX2亚基过表达质粒的各组NADPH氧化酶活性比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。其中,过表达组、益心解毒方高剂量组、益心解毒方低剂量组与正常H9C2细胞组NADPH氧化酶活性比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;H9C2转阴性对照质粒组、RNAi质粒组、益心解毒方中剂量组与过表达组NADPH氧化酶活性比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;RNAi质粒组、益心解毒方高剂量组、益心解毒方低剂量组与H9C2转阴性对照质粒组NADPH氧化酶活性比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;益心解毒方高剂量组、益心解毒方低剂量组与RNAi质粒组NADPH氧化酶活性比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;益心解毒方中剂量组与益心解毒方高剂量组NADPH氧化酶活性比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;益心解毒方低剂量组与益心解毒方中剂量组NADPH氧化酶活性比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。转染NOX4亚基过表达质粒的各组NADPH氧化酶活性比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。其中,过表达组、益心解毒方高剂量组、益心解毒方低剂量组与正常H9C2细胞组NADPH氧化酶活性比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;H9C2转阴性对照质粒组、RNAi质粒组、益心解毒方中剂量组、益心解毒方低剂量组与过表达组NADPH氧化酶活性比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;RNAi质粒组、益心解毒方高剂量组、益心解毒方低剂量组与H9C2转阴性对照质粒组NADPH氧化酶活性比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;益心解毒方高剂量组、益心解毒方低剂量组与RNAi质粒组NADPH氧化酶活性比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;益心解毒方中剂量组与益心解毒方高剂量组NADPH氧化酶活性比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;益心解毒方低剂量组与益心解毒方中剂量组NADPH氧化酶活性比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 NOX2、NOX4亚基的过表达可以提高NADPH氧化酶活性,而RNAi表达可以沉默NOX2、NOX4亚基,从而降低NADPH氧化酶活性,益心解毒方不会直接影响NADPH氧化酶活性。实验研究表明干预和抑制NOX2、NOX4亚基的NADPH氧化酶活性调控环节,降低心肌活性氧（ROS）水平,保护心肌细胞,改善心功能,可能是益心解毒方发挥药效的重要机制。     

FGF6基因高表达对鼠心肌细胞凋亡和增殖的影响

目的:克隆小鼠成纤维细胞生长因子6 (FGF6)基因cDNA的读码框(CDS),构建携带FGF6基因的重组真核表达载体,并将重组质粒转染至心肌细胞系H9C2细胞中进行表达,测定转染后FGF6基因对心肌细胞增殖及凋亡的影响.方法:从小鼠心脏组织提取总RNA,通过逆转录得到总cDNA,PCR法扩增,产物连接pGEM-T Easy载体测序分析正确后,再以PCR方法扩增,将其连接入真核表达质粒PIRES2-DsRed2.以PCR、双酶切和测序鉴定正确后,将重组载体PIRES2-DsRed2-FGF6用脂质体包裹转染大鼠心肌细胞(H9C2),分组:空白对照(BC)组、转染空质粒(NC)组、转染重组FGF6-PIRES2-DsRed2质粒(P-FGF6)组,RT-PCR法检测转染后FGF6 mRNA表达水平,荧光显微镜观察转染效率.Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测转染后细胞的增殖能力;以血清饥饿诱导心肌细胞凋亡,同时进行FGF6质粒转染,流式细胞仪检测细胞凋亡指数,Western blot方法检测活化半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)表达.结果:成功克隆了小鼠FGF6基因cDNA,重组真核表达载体PIRES2-DsRed2-FGF6构建成功,且证实转染后大鼠心肌细胞的FGF6mRNA表达明显高于BC组(P＜0.05)及NC组(P＜0.05),转染FGF6基因能提高心肌细胞的增殖能力(P＜0.05),FGF6基因能明显抑制血清饥饿引起的细胞凋亡(P＜ 0.05),同时下调活化caspase-3表达(P＜0.05).结论:成功克隆了FGF6基因,并构建了真核表达载体PIRES2-DsRed2-FGF6,重组FGF6真核表达载体能够在H9C2细胞中获得有效过表达,并证实FGF6基因可促进心肌细胞的增殖及保护心肌细胞的凋亡.     

NADPH氧化酶在人真皮成纤维细胞氧化应激损伤中的作用

目的探讨NADPH氧化酶在人真皮成纤维细胞氧化应激损伤中的作用。方法H2O2 构建氧化应激模型,将实验分为正常 组、氧化损伤组和NADPH氧化酶抑制剂（DPI）组,MTT检测细胞活力,DCFH-DA 荧光探针检测细胞内活性氧（ROS）改变, Western blot分析NADPH氧化酶胞膜亚基gp91phox表达变化。结果H2O2 对成纤维细胞的氧化损伤呈时间和浓度依赖,H2O2 700 μmol/L处理24 h后细胞活力下降约40%（P<0.05）,ROS升高2倍（P<0.05）。而抑制剂组细胞活力较氧化损伤组增加20% （P<0.05）,ROS下降至正常水平（P<0.05）。Western blotting结果显示氧化损伤组gp91phox表达随H2O2 浓度逐渐升高,而抑制 剂组表达接近正常水平。结论H2O2 可通过影响NADPH氧化酶特别是胞膜亚基gp91phox引发成纤维细胞氧化损伤。     

重组Nox1在NIH3T3细胞中的表达及其对活性氧的影响

目的构建Nox1的真核表达载体,探讨其在NIH3T3细胞中表达后对活性氧水平和药物细胞毒易感性的影响.方法构建携带Nox1基因的真核表达载体pcDNA3 Nox1,并将其转染NIH3T3细胞,采用RT PCR方法检测Nox1在mRNA水平上的表达,检测细胞活性氧和细胞活力.结果RT PCR显示转染后的NIH3T3细胞可以有效地转录Nox1 mRNA,细胞中的活性氧水平明显升高,同时对As2O3细胞毒作用更加敏感.结论含有Nox1 cDNA的重组质粒pcDNA3 Nox1转染细胞后可有效表达Nox1,使活性氧水平升高,并因此增加细胞对药物细胞毒的敏感性.     

益心解毒方对大鼠心肌细胞内活性氧水平及信号转导通路的影响

目的 研究益心解毒方含药血清抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的大鼠心肌细胞内活性氧(ROS)水平及信号转导通路相关分子的变化。 方法 取对数生长期的大鼠H9c2心肌细胞,同步化后进行实验,实验分为正常组:无造模刺激,无干预;模型组:10^-6mol/L的AngⅡ刺激24h,1%正常大鼠血清干预;益心解毒方组:10^-6mol/L的AngⅡ刺激24h,1%益心解毒方含药血清干预;二亚苯基碘(DPI)对照组:10^-6mol/L的AngⅡ刺激,10μmol/L的NADPH氧化酶抑制剂DPI干预24h,采用乙酰乙酸双氯荧光素(DCFH-DA)法测定H9c2心肌细胞ROS水平; Western blot法测定各组H9c2心肌细胞信号转导通路相关分子的变化。 结果 研究发现AngⅡ诱导的H9c2心肌细胞中ROS水平显著提高,而益心解毒方含药血清对增高的ROS水平都有明显的抑制作用,与模型组相比,低剂量组作用最为显著(P< 0.05);在给予AngⅡ培养24h后,低剂量组信号转导通路上的血管紧张素受体(AT1受体)、信号转导子和转录激活子3(STAT3)蛋白、基质金属蛋白酶(MMP9)蛋白表达水平低于模型组,差异有统计学意义(P< 0.01,P< 0.05)。 结论 益心解毒方通过降低心肌ROS水平;抑制AngⅡ引起的交感神经系统、肾素-血管紧张素系统(RAAS)过度激活、降低AT1受体的表达水平,抑制STAT3的作用而延缓心肌肥厚的过程,发挥其在心肌肥厚过程中的心肌保护作用;同时抑制MMPs的活性,减缓心肌重构。     

重组Nox1在NIH3T3细胞中的表达及其对活性氧的影响

目的构建Nox1的真核表达载体，探讨其在NIH3T3细胞中表达后对活性氧水平和药物细胞毒易感性的影响。方法构建携带Nox1基因的真核表达载体pcDNA3-Nox1，并将其转染NIH3T3细胞，采用RT-PCR方法检测Nox1在mRNA水平上的表达，检测细胞活性氧和细胞活力。结果RT-PCR显示转染后的NIH3T3细胞可以有效地转录Nox1 mRNA，细胞中的活性氧水平明显升高，同时对As2O3细胞毒作用更加敏感。结论含有Nox1 cDNA的重组质粒pcDNA3-Nox1转染细胞后可有效表达Nox1，使活性氧水平升高，并因此增加细胞对药物细胞毒的敏感性。     

腺病毒介导vasostatin-1基因转染表达对大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的:构建并鉴定携带人嗜铬粒蛋白A的N端1~76片段(CGA1-76) 即vasostatin-1（VS-1）基因的腺病毒表达载体,观察重组腺病毒在大鼠心肌细胞中的表达,探讨VS-1转基因治疗对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。方法:（1）利用CGA1-58cDNA模板,设计引物,利用PCR合成、扩增CGA1-76的cDNA并将其克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack,经PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠埃希菌BJ5183中同源重组。将鉴定正确的同源重组质粒pAd-VS-1线性化后转染QBI-293A细胞进行包装、扩增得到重组腺病毒颗粒Ad-VS-1,将该病毒感染大鼠心肌细胞H9c2并通过蛋白质印迹法检测其表达。（2）建立心肌细胞缺氧/复氧（H/R）损伤模型,分为4组:空白组、H/R组、空载腺病毒转染+H/R组、Ad-VS-1转染+H/R组;测定各组心肌细胞活力,超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。结果:（1）经PCR、基因测序、酶切鉴定证实重组质粒pAd-VS-1构建成功,将其导入QBI-293A细胞,通过蛋白质印迹法证实病毒颗粒Ad-VS-1感染心肌细胞后VS-1蛋白表达。（2）H/R组心肌细胞活力和SOD含量较空白组明显降低,MDA增加;而VS-1基因转染提高了心肌细胞H/R模型心肌细胞活力和SOD含量,并降低了MDA生成量。结论:成功构建Ad-VS-1,将其感染大鼠心肌细胞后能够表达VS-1并对心肌细胞H/R损伤具有保护作用,其机制和抗氧化作用有关。     

miR-133a真核表达载体的构建及转染大鼠心肌H9C2细胞

目的:构建miR-133a真核表达载体后,体外转染大鼠H9C2心肌细胞.方法:设计并合成DNA模板引物,用T4 DNA 连接酶将pre-miR-133a连接到线性化的PgenesIL-1.1质粒中,对重组质粒进行酶切及测序鉴定.以LipofectamineTM 2000 Reagent将鉴定正确的重组质粒瞬时转染H9C...     

白介素1受体相关激酶4重组过表达质粒pcDNA3.1-IRAK4的构建及转染

目的构建重组过表达质粒pc DNA3.1-IRAK4并检验其在H9c2细胞中的表达。方法在全球科学家质粒共享非盈利组织Addgene申请到p DONR223-IRAK4质粒菌种,摇菌提取质粒后测序。设计引物将目的片段扩增并跑胶回收。将目的片段PCR扩增产物和空质粒pc DNA3.1采用Bam HⅠ和EcoRⅠ酶切,构建重组表达质粒。将重组质粒使用两种转染试剂转染入H9c2细胞中,并借助Western blot法检测IRAK4蛋白在H9c2细胞中的表达。结果重组过表达质粒经菌落PCR、序列测定证实,扩增基因片段IRAK4与基因数据库中序列一致,并且含有终止密码子。转染入H9c2细胞中能够过表达,表明IRAK4重组过表达质粒构建成功。结论成功构建IRAK4基因过表达重组质粒,获得外源性IRAK4转染的H9c2细胞。     

稳定高表达TGF-β1的大鼠心肌细胞H9c2细胞株的构建及鉴定

目的 构建及鉴定稳定高表达TGF-β1的大鼠心肌细胞H9c2细胞株.方法 利用RNA干扰技术提取pEGFP-TGF-β1质粒后采用ABI3130基因测序仪进行测序鉴定,将鉴定后的质粒转染到大鼠心肌细胞H9c2细胞株,利用G418筛选转染的H9c2细胞,通过RT-PCR和Western blot技术对转染后的H9c2细胞进行鉴定,本实验将转染了pEGFP-TGF-β1质粒和pEGFP对照质粒的细胞株分为pEGFP-TGF-β1质粒组和pEGFP对照质粒组.结果 pEGFP-TGF-β1质粒测序结果包含TGF-β1序列,筛选后的pEGFP-TGF-β1质粒组和pEGFP对照质粒组细胞转染效率分别为85%和93%.RT-PCR结果显示,pEGFP-TGF-β1质粒转染组的TGF-β1 mRNA相对表达量为(2.563±0.198),与对照组(1.037±0.022)比较差异具有统计学意义(t=3.056,P=0.028);Western blot结果显示,pEGFP-TGF-β1质粒转染组的TGF-β1蛋白相对表达量为(3.275±0.234),显著高于对照组的(1.011±0.015),差异具有统计学意义(t=4.372,P=0.015).结论 本研究所构建的大鼠心肌细胞H9c2细胞株能稳定高表达TGF-β1,可用于后续TGF-β1在大鼠心肌细胞的生物学作用及相关信号通路的研究.     

Normobaric hyperoxia protects the blood brain barrier through inhibiting Nox2 containing NADPH oxidase in ischemic stroke

ABSTRACT: Normobaric hyperoxia (NBO) has been shown to be neuro- and vaso-protective during ischemic stroke. However, the underlying mechanisms remain to be fully elucidated. Activation of NADPH oxidase critically contributes to ischemic brain damage via increase in ROS production. We herein tested the hypothesis that NBO protects the blood-brain barrier (BBB) via inhibiting gp91phox (or called Nox2) containing NADPH oxidase in a mouse model of middle cerebral artery occlusion (MCAO). Wild-type C57/BL6 mice and gp91phoxknockout mice were given NBO (95% O2) or normoxia (21% O2) during 90-min MCAO, followed by 22.5 hrs of reperfusion. BBB damage was quantified by measuring Evans blue extravasation. The protein levels of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9), tight junction protein occludin and gp91phox were assessed with western blot. Gel zymography was used to assess the gelatinolytic activity of MMP-9. In the wild type mice, cerebral ischemia and reperfusion led to remarkable Evans blue extravasation, significantly increased gp91phox and MMP-9 levels and decreased occludin levels in the ischemic brain tissue. In gp91phox knockout mice, the changes in Evans blue extravasation, MMP-9 and occludin were at much smaller magnitudes when compared to the wild type. Importantly, NBO treatment significantly reduced the changes in all measured parameters in wild type mice, while did not cause additional reductions in these changes when gp91phox was knocked out. These results indicate that activation of Nox2 containing NADPH oxidase is implicated in the induction of MMP-9, loss of occludin and BBB disruption in ischemic stroke, and inhibition of Nox2 may be an important mechanism underlying NBO-afforded BBB protection.     

Nox4在糖尿病及慢性并发症中的作用研究进展

随着生活方式的改变和预期寿命的延长,世界范围内糖尿病及其慢性并发症的患病率逐年升高。糖尿病慢性并发症(糖尿病肾病、糖尿病大血管病变、糖尿病心肌病、糖尿病视网膜病变、糖尿病神经病变等)是糖尿病患者致死致残的主要原因。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(Nox4)是催化氧生成活性氧类(ROS)的关键酶,Nox4的活性直接受组织氧分压的调控,由Nox4生成的ROS通过氧化应激在糖尿病及其慢性并发症的发病及进展过程中发挥重要作用。     

瑞舒伐他汀抑制同型半胱氨酸诱导的内皮祖细胞凋亡涉及Nox4氧化应激途径

目的研究瑞舒伐他汀（Rosu）对同型半胱氨酸（Hcy）诱导的内皮祖细胞（EPCs）活性氧（ROS）产牛以及凋亡的影响。方法从外周血中分离EPCs与Hey共孵育,或经Rosu、不同的应激信号通路抑制剂甲羟戊酸（100μmlol／L）、乙酰半胱馘酸（NAC,10μmol／L）、NADPH氧化酶（Nox）抑制剂（DPI,10wmol／L）、内皮一氧化氮合成酶抑制剂（LNMA,1mmol／L）预培养后再加入Hcy共孵育。采用流式法检测细胞凋亡率,2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐法（H。DCF—DA）检测细胞内ROS水平,光泽精化学发光法检测Nox活性,RT—PCR检测Nox4mRNA的表达。结果Rosu显著抑制了Hcy诱导的ROS蓄积和EPCs凋亡,拮抗了Hcy诱导的Nox激活以及Nox4mRNA表达。Nox4siRNA转染EPCs可以产生相似的效果。结论Rosu对EPCs的保护作用口f能址通过Nox4途径抑制Hcy诱导的Nox激活、ROS蓄积和EPCs凋亡来实现。     

Nox1基因启动子表达载体的构建

目的 克隆烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(Nox)上游启动子序列,为研究Nox1基因的转录调控奠定基础.方法 以人基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得1 415 bp(-1415～0)、1 276 bp(-1415～-140)、997 bp(-1415～-419)、839 bp(-1415～-577)、470 bp(-1415～-946)大小的Nox1启动子片段,将其定向克隆人pGL3-Basic荧光素酶表达载体,构建荧光素酶报告基因载体,进行真核细胞转染后鉴定目的片段启动子活性.结果 在A549细胞中,各Nox1启动子片段均有活性;-140～-419 bp和-577～-946 bp区域可能存在Nox1启动子核心区域.结论 成功克隆了在肺泡上皮样细胞中具有活性的Nox1启动子序列,为进一步研究Nox1基因的转录调控机制奠定了基础.     

沙棘黄酮对粥样硬化大鼠NADPH氧化酶亚基Nox4及ox-LDL的影响

目的：探讨沙棘黄酮（TFH）对粥样硬化大鼠NADPH氧化酶亚基Nox4及ox-LDL的影响及机制。方法将50只SD大鼠随机分为：正常对照组（CON组）、粥样硬化组（AS组）、沙棘黄酮低、中、高剂量组,除CON组其余4组喂高脂饲料,TFH低、中、高剂量组以不同剂量TFH灌胃,60 d后,取血清测定SOD、MDA及ROS水平, ELISA技术测主动脉ox-LDL和Nox4蛋白表达水平。结果 AS组比CON组SOD下降,MDA及ROS含量升高;沙棘黄酮干预能改善以上指标;沙棘黄酮降低了AS大鼠Nox4及 oxLDL蛋白表达水平。结论沙棘黄酮可降低AS大鼠Nox4及ox-LDL蛋白表达从而减少ROS生成防治粥样硬化。     

nox5表达异常对缺血性心肌病患者循环EPCs功能的影响

目的探查缺血性心肌病患者循环内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)功能是否异常,了解活性氧(reac-tive oxygen species,ROS)和ROS生成的相关基因nox5表达对EPCs功能的影响。方法入选缺血性心肌病患者及健康对照组各7例,测定外周血EPCs数量、增殖、迁移、成血管能力的改变,检测nox5蛋白及mRNA的表达,进一步沉默nox5表达,检测对EPCs功能及ROS产量的影响。结果与健康对照组比较,缺血性心肌病患者循环EPCs数目、增殖、迁移能力等未见异常;但体外培养过程中内皮系表面标志KDR的表达减少,体外成血管能力下降,伴随nox5蛋白及mRNA表达增加、活性氧生成增加;沉默nox5表达可降低细胞内ROS产量,改善EPCs成血管能力。结论本研究提示,缺血性心肌病患者循环EPCs体外成血管能力异常,细胞内ROS生成增加,ROS生成的相关基因nox5蛋白及mRNA表达上调;沉默nox5表达可降低细胞内ROS产量并改善EPCs功能。     

抗人胸腺细胞单克隆抗体2G_2B_2和2G_2C_2的制备及特性鉴定

用杂交瘤技术制备２株单克隆抗体（单抗）２Ｇ２Ｂ２、２Ｇ２Ｃ２。经研究发现,它们主要与胸腺细胞、脐血及ＰＨＡ激活的外周血单个核细胞等反应;免疫组化显示其主要作用于皮质胸腺细胞;与造血系统中分化早期的瘤细胞、骨髓瘤细胞等反应阳性率较高。生物学特性鉴定结果提示,单抗均属免疫球蛋白ＩｇＧ１亚类,腹水效价达１：１２８０００,所识别抗原分子量为４５／４６ＫＤａ,无抗原调变作用。故２Ｇ２Ｂ２、２Ｇ２Ｃ２是类似ＯＫＴ１０的抗ＣＤ３８单抗,但竞争抑制结果表明三者分别作用于不同的抗原决定簇,即２Ｇ２Ｂ２、２Ｇ２Ｃ２是两个抗ＣＤ３８新单抗。     

评价房颤CHADS2评分及其衍生评分对冠心病及其严重程度的预测价值

目的：探讨房颤评分系统CHADS2(欧洲)评分及其衍生评分对冠心病及其严重程度的预测价值。方法纳入2013年1月1日-2013年12月1日就诊于本院心血管内科怀疑冠心病并行冠状动脉造影检查的连续病例429例,根据其造影结果分为对照组(n=51)及冠心病组(n=378)。根据患者的临床资料计算其CHADS2、CHA2DS2-VASc和CHA2DS2-VASc-HSF评分,根据其冠状动脉造影结果计算Gensini积分评价其病变严重程度,并对3种评分的冠心病预测能力进行评价。结果 CHADS2、CHA2DS2-VASc和CHA2DS2-VASc-HSF评分与病变支数(r=0.317,P＜0.01;r=0.332,P＜0.01;r=0.330,P＜0.01)及Gensini积分均有一定相关性(r=0.240,P＜0.01;r=0.274,P＜0.01;r=0.295,P＜0.01)。截断点分析显示, CHA2DS2-VASc-HSF评分≥3对冠心病的预测价值最高,其灵敏度、特异度、曲线下面积分别为0.860、0.804、0.832(95%CI：0.766~0.898)。结论 CHADS2及其衍生评分对冠心病有一定的预测价值,尤其是CHA2DS2-VASc-HSF评分≥3对冠心病有较高的预测价值。