山茱萸环烯醚萜苷对蛋白磷酸酶2A催化亚基C磷酸化的调节机制

目的 探讨山茱萸环烯醚萜苷（Cornel iridoid glycoside,CIG）上调蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A,PP2A）,PP2A活性抑制tau蛋白磷酸化的作用机制。方法 1确定最佳转染条件：将Src质粒DNA（0.2、0.4、0.6、0.8 μg）瞬时转染入小鼠神经瘤母细胞（Neuro-2A cell,N2a细胞）,观察不同量Src对PP2A催化亚基C磷酸化和tau蛋白磷酸化的影响;2将0.6 μg Src质粒DNA转染入N2a细胞,24 h后加入CIG（50、100、200 μg/mL）共同孵育24 h,观察CIG对Src、蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B（protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1B）、p-PP2Ac及tau蛋白磷酸化的作用。结果 1转染Src（0.2、0.4、0.6 μg）质粒DNA到N2a细胞,Src蛋白表达明显增加,p-PP2Ac水平上调,PP2Ac蛋白总量表达无变化,tau蛋白在Ser 199/202、Ser 396位点磷酸化显著增加;转染0.8 μg Src质粒DNA到N2a细胞与转染0.6 μg Src相比,p-PP2Ac表达下降,PP2Ac蛋白总量表达无变化,tau蛋白在Ser 199/202、Ser 396位点磷酸化降低。2转染0.6 μg Src质粒DNA到N2a细胞,Src蛋白表达增加,p-PP2Ac表达增加,tau蛋白在Ser 199/202、Thr 205、Thr 217以及Ser 396位点的磷酸化明显增加;CIG对Src蛋白表达无影响,能够抑制p-PP2Ac的表达,抑制tau蛋白在Ser 199/202、Thr 205、Thr 217以及Ser 396位点的磷酸化。此外,CIG能上调PTP1B蛋白表达。结论 CIG对Src蛋白无明显调节作用,但能通过增加PTP1B的表达,降低PP2A催化亚基C磷酸化,从而升高PP2A活性,进一步降低tau的过度磷酸化。CIG对tau蛋白过度磷酸化的抑制作用,将会给阿尔茨海默病的治疗带来广阔的应用前景。     

微管相关蛋白tau转基因细胞和动物模型的建立及tau蛋白病变表征

目的 构建并表征tau及突变tau蛋白细胞和动物模型,检测模型tau蛋白及磷酸化tau蛋白表达情况及微管的形态,为tau蛋白及相关疾病的研究提供疾病模型。方法 将不同的质粒分别转染到HEK293细胞中,构建过表达野生型tau以及P301L/P301S突变tau的细胞模型。引进并繁育rTg4510小鼠（P301L突变tau转基因小鼠）以及PS19小鼠（P301S突变tau转基因小鼠）。通过Western blotting法检测总tau及磷酸化tau蛋白的表达,应用免疫组织化学的方法检测转基因小鼠脑内磷酸化tau蛋白的表达情况,应用免疫荧光的方法检测HEK293细胞微管形态的变化。结果 本研究成功构建过表达tau蛋白的细胞模型,繁育了两种tau转基因小鼠,在这些模型中tau蛋白表达及tau蛋白的磷酸化水平显著高于对照组。在不同突变类型的细胞和动物模型中,tau蛋白不同位点的磷酸化水平变化以及微管形态变化略有差异。结论 本研究成功构建了P301L/P301S突变tau蛋白的细胞和动物模型,这些模型均表现了显著的tau蛋白过度磷酸化的病变,并引起了细胞微管形态或tau蛋白病理的变化,进而为包括AD在内的tau蛋白病变提供了实验模型。     

新型冠状病毒Omicron变异株利用多种动物ACE2作为受体侵入细胞的能力

目的 探讨新型冠状病毒Omicron变异株利用不同动物血管紧张素转换酶Ⅱ(angiotensin-converting enzyme Ⅱ, ACE2)受体侵入细胞的能力,评价Omicron变异株潜在的跨宿主传播风险。方法 将不同动物来源的ACE2表达质粒转染至293T细胞,建立新型冠状病毒D614G株系、Delta株系及Omicron株系的假病毒感染系统,并进行假病毒感染实验;利用假病毒感染系统及荧光酶素报告基因检测Omicron刺突蛋白对不同动物来源的ACE2受体利用能力。结果 与D614G株相比,Omicron株利用小鼠ACE2受体侵入细胞的能力明显增高(t=16.09、 P<0.05),但其利用中华菊头蝠、墨西哥无尾蝠、雪貂獾、猪獾、猫、兔、穿山甲的ACE2受体侵入细胞的能力降低(t=17.80、P<0.05,t=8.43、P<0.05,t=18.10、P<0.05,t=10.46、P<0.05,t=22.00、P<0.05,t=10.08、P<0.05,t=4.83、P<0.05);与Delta株相比,Omicron株利用中华菊头蝠、雪貂獾、猪獾、猫的ACE2受体侵入细胞的能力降低(t=8.15、 P<0.05,t=7.91、P<0.05,t=8.59、P<0.05,t=8.43、P<0.05)。结论 新型冠状病毒Omicron株的刺突蛋白可以利用多种动物的ACE2作为受体感染细胞,提示Omicron株可能存在多种跨宿主传播的风险。     

敲低造血前B细胞白血病转录因子相互作用蛋白对胰腺癌细胞增殖、周期和凋亡的影响

目的 探讨造血前B细胞白血病转录因子相互作用蛋白(HPIP)对胰腺癌细胞增殖、周期及凋亡的影响。方法 采用免疫组织化学染色方法检测胰腺癌组织及对应癌旁组织中HPIP的表达水平,小干扰RNA瞬时转染的方法敲低胰腺癌细胞中HPIP的表达水平,细胞计数试剂盒-8实验、克隆形成实验、流式细胞术检测敲低HPIP对细胞增殖、周期及凋亡的影响,免疫印迹法检测敲低HPIP对于cyclin D1、caspase 7和cleaved caspase 7表达水平的影响。结果 胰腺癌组织中HPIP的表达明显高于癌旁组织(Z=-2.060,P=0.039)。敲低HPIP表达水平后,在24 h起MIA PaCa-2和BxPC-3细胞的生长受到抑制(P均<0.05);MIA PaCa-2(t=4.706,P=0.009)和BxPC-3细胞(t=9.514,P=0.000)形成的阳性克隆数明显减少;MIA PaCa-2(t=7.642,P=0.001)及BxPC-3细胞(t=2.714,P=0.051)中S期细胞比例明显降低,G₀/G₁ 期细胞比例明显增加(t=3.244,P=0.031;t=6.095,P=0.003);MIA PaCa-2(t=24.58,P=0.000;t=29.43,P=0.000)和BxPC-3细胞(t=36.45,P=0.000;t=43.52,P=0.000)中的晚期凋亡率和总凋亡率均明显上升;MIA PaCa-2(t=6.705,P=0.002)和BxPC-3细胞(t=6.238,P=0.003)的cyclin D1表达水平明显下降,caspase 7表达水平变化无统计学意义(t=0.711,P=0.516;t=0.027,P=0.979),cleaved caspase 7表达水平明显上升(t=3.991,P=0.016;t=6.536,P=0.002)。结论 与癌旁组织相比,HPIP在胰腺癌中表达水平较高。敲低HPIP可导致胰腺癌细胞生长受到抑制,细胞周期由G₀/G₁期向S期转化受阻,并促进胰腺癌细胞凋亡。HPIP可能在胰腺癌中发挥癌基因作用。     

微小RNA-145对卵巢癌细胞迁移和侵袭的影响

目的 评估微小RNA-145(miR-145)对卵巢癌细胞迁移和侵袭的影响。方法 选取上皮性卵巢癌细胞株SKOV3及3AO,过表达miR-145后,qRT-PCR检测转染前后细胞株miR-145的表达,Transwell小室实验检测转染前后细胞迁移及侵袭能力。采用生物信息学方法特异预测出miR-145靶基因zeb-2后,通过双荧光素酶报告实验进行验证,再敲低zeb-2后检测细胞移动能力。 结果 过表达miR-145后,SKOV3(t=10.752,P=0.000;t=5.617,P=0.005)及3AO细胞(t=10.111,P=0.001;t=21.746,P=0.000)的迁移及增殖能力均明显下降。双荧光素酶报告实验结果显示,共转染miR-145 mimic和WT 3’UTR表达载体细胞的相对荧光素酶活性明显低于共转染mimic control和WT 3’UTR表达载体的细胞(SKOV3:t=4.572,P=0.010;3AO:t=3.528,P=0.024),共转染miR-145mimic和MUT 3’UTR表达载体细胞的相对荧光素酶活性与共转染mimic control和MUT 3’UTR表达载体细胞差异无统计学意义(SKOV3:t=0.227,P=0.831;3AO:t=0.040,P=0.970)。过表达miR-145 48 h后,实时定量PCR检测结果显示,与阴性对照相比,SKOV3(t=1.490,P=0.211)和3AO细胞(t=0.114,P=0.914)中zeb-2 mRNA表达差异无统计学意义。过表达miR-145 72 h后,Western blot检测结果显示,与阴性对照相比,SKOV3(t=3.769,P=0.020)及3AO细胞(t=4.452,P=0.011)中zeb-2蛋白的表达水平明显下降。转染zeb-2 siRNA 72 h后,Western blot检测结果显示,SKOV3(t=4.660,P=0.010)和3AO细胞(t=4.594,P=0.010)中的zeb-2蛋白表达水平明显下调;Transwell小室实验检测结果显示,SKOV3(t=18.655,P=0.000;t=18.026,P=0.000)及3AO(t=5.500,P=0.005;t=8.780,P=0.001)细胞的迁移和侵袭能力明显下降。结论 miR-145可能是通过靶向抑制zeb-2来抑制卵巢癌细胞迁移和侵袭能力。     

马钱苷通过抑制蛋白磷酸酶2A催化亚基C磷酸化降低tau蛋白过度磷酸化

目的 探讨马钱苷对tau蛋白过度磷酸化的影响及其作用机制。方法 马钱苷（500、1 000 μmol/L）与人神经母细胞瘤细胞株（SK-N-SH细胞）预孵育24 h,之后加入PI3K抑制剂Wortmannin（WT）及PKA抑制剂GF-109203X（GFX）与SK-N-SH细胞孵育3 h,采用Western blotting方法观察马钱苷对tau蛋白在Thr205、Thr217、PHF-1位点的磷酸化,GSK-3β-Ser9、GSK-3β、PP2A催化亚基C（protein phosphatase 2A catalytic subunit C,PP2Ac）磷酸化/甲基化及PP2Ac的表达。结果 WT/GFX明显抑制p-GSK-3β-ser9的表达,引起GSK-3β活性增高,从而导致tau蛋白Thr205、Thr217、PHF-1位点高度磷酸化。马钱苷能够明显抑制模型细胞tau蛋白在Thr205、Thr217、PHF-1位点的过度磷酸化,但是不能增高p-GSK-3β-ser9的表达,提示马钱苷抑制tau蛋白磷酸化的作用不是通过影响GSK-3β通路实现的。但是实验显示马钱苷能够抑制PP2A催化亚基C Tyr307位点的磷酸化,但对Leu309位点甲基化无影响。结论 马钱苷能够抑制tau蛋白过度磷酸化,机制可能与其抑制PP2A催化亚基C Tyr307位点的磷酸化,提高PP2A活性有关,与GSK-3β通路无关。     

干扰MAD2L1基因表达对乳腺癌细胞凋亡的影响及机制

目的 探讨干扰有丝分裂阻滞缺陷2样蛋白1(MAD2L1)基因表达对乳腺癌(BC)细胞凋亡的影响及其机制。 方法 采用qRT-PCR检测正常乳腺上皮细胞系MCF-10A和4种BC细胞系(MDA-MB-231、MCF-7、SK-BR-3和BT-20)中MAD2L1 mRNA表达水平。将MAD2L1 siRNA转染至MDA-MB-231细胞中,qRT-PCR和Western blotting检测细胞中MAD2L1 mRNA和蛋白表达水平;MTT检测细胞增殖能力;流式细胞术法检测细胞凋亡率;Western blotting检测细胞中Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3、p-p38MAPK(Thr180/Thr182)和p38MAPK等蛋白表达水平。采用p38MAPK抑制剂SB203580联合处理上述细胞,Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡率的变化;Western blotting检测Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3、p-p38MAPK和p38MAPK表达水平的变化。 结果 BC细胞系中MAD2L1 mRNA表达水平高于MCF-10A细胞,其中MDA-MB-231细胞最为显著。干扰MAD2L1基因可降低MDA-MB-231细胞中MAD2L1 mRNA和蛋白表达水平(t_mRNA=10.51,P_mRNA<0.001;t_蛋白=18.30,P_蛋白<0.001),同时抑制细胞增殖(F_组别=243.36、F_时间=44.00、F_{组别×时间}=9.881,P均<0.001),促进细胞凋亡(t=9.10,P<0.001),并上调Bax、cleaved-caspase-3和p-p38MAPK蛋白表达水平(t_Bax=15.05,P_Bax<0.001;t_{cleaved-caspase-3}=5.26,P_{cleaved-caspase-3}=0.006;t_p-p38MAPK=28.46,P_p-p38MAPK<0.001),下调Bcl-2蛋白表达水平(t_Bcl-2=14.23,P<0.001)。然而,SB203580处理可抑制MAD2L1基因干扰对MDA-MB-231细胞凋亡的诱导作用(P=0.002)。 结论 干扰MAD2L1基因表达可抑制MDA-MB-231细胞增殖,并诱导其凋亡,其作用机制可能与激活p38MAPK信号通路有关。     

丝裂原活化蛋白激酶和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白激活剂3在膀胱癌中的表达及其临床意义

目的 检索Oncomine和Expression Atlas数据库,获得LAMTOR3相关的基因芯片数据,分析LAMTOR3在膀胱癌细胞及组织中的表达及其与膀胱癌临床病理特征的关系。采用RT-PCR、Western blot和免疫组织化学法检测LAMTOR3在膀胱癌细胞、癌组织及其配对的正常组织中的表达,验证其表达和临床相关性。 结果 Expression Atlas数据库检索结果显示,LAMTOR3在20株膀胱癌细胞中的基础表达水平存在差异,其中,在Hs 172.T、HT-1376、RT4、JMSU-1和T24细胞株中呈较高表达。Oncomine数据库检索结果显示,LAMTOR3在浸润性(t=2.857,P=0.005)及非浸润性膀胱癌组织(t=3.105,P=0.003)中的表达均明显高于正常膀胱组织,病理分级越高的膀胱癌组织中表达越高(P<0.05)。实验验证结果显示,LAMTOR3 mRNA在膀胱癌细胞株UMUC3(t=10.84,P=0.0084)、J82(t=21.75,P=0.0021)、5637(t=45.88,P=0.0005)和T24(t=87.58,P=0.0001)中的表达明显高于正常人膀胱永生化细胞SV-HUC-1,在膀胱癌组织中的表达也明显高于正常组织(P<0.05);LAMTOR3蛋白水平在癌组织中的表达也明显高于正常组织(P<0.05)。免疫组织化学检测结果显示,LAMTOR3蛋白在癌组织中高表达,在浸润性癌组织中较非浸润性癌组织高表达,其表达水平与膀胱癌临床分期(χ ²=9.189,P=0.002)、病理分级(χ ²=4.746,P=0.029)和淋巴结转移(χ ²=6.210,P=0.013)密切相关,但与性别(χ ²=0.965,P=0.326)、年龄(χ ²=2.126,P=0.145)、远处转移(χ ²=1.261,P=0.261)等无明显相关性.结论 LAMTOR3在膀胱癌细胞及组织中高表达,与膀胱癌发生发展密切相关。     

链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠坐骨神经硫氧还蛋白相互作用蛋白/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎症小体的表达

目的 初步探讨硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体通路在链尿佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠坐骨神经中的作用。方法 采用单次STZ腹腔注射的方法建立糖尿病大鼠模型,取年龄、体重匹配的雄性大鼠作为正常对照组,监测血糖、体重变化,成模后12周应用电子Von Frey仪测定机械痛阈值,处死取坐骨神经进行坚牢蓝染色,采用免疫组织化学及Western blot法检测TXNIP、NLRP3、半胱天冬酶-1和白细胞介素(IL)-1β的表达,ELISA法测定血清中IL-1β、IL-18水平。结果 糖尿病大鼠模型坐骨神经中TXNIP蛋白表达为3.78±0.08,较正常对照组0.99±0.06显著增加(t=26.980,P<0.0001);与正常对照组(0.97±0.05)相比,糖尿病组NLRP3蛋白表达(2.44±0.16)明显升高(t=8.885,P<0.0001);糖尿病组活化的半胱天冬酶-1蛋白表达为4.45±0.19,正常对照组为1.08±0.06,两组差异有统计学意义(t=16.900,P<0.0001)。糖尿病组IL-1β蛋白表达为4.50±0.16,较正常对照组1.19±0.08显著增加(t=18.630,P<0.0001);与正常对照组比较,糖尿病大鼠血清中IL-1β[(110.50±8.80)pg/ml比(17.97±3.18)pg/ml,t=9.892,P<0.0001]、IL-18[(591.70±8.78)pg/ml比(160.70±8.33)pg/ml,t=35.620,P<0.0001]均分泌增多。结论 糖尿病周围神经病变(DPN)的发病机制可能与TXNIP表达增加、NLRP3炎症小体激活以及下游炎症反应有关,该通路可成为DPN治疗的新靶标。     

大鼠抑郁行为与海马及额叶皮层S100β及脑源性神经影响因子表达的相关性

目的 研究慢性不可预见性温和刺激(CUMS)所致大鼠抑郁行为与前额叶及海马中脑源性神经营养因子(BDNF)和S100β表达的相关性。方法 大鼠分为安慰剂对照组、安慰剂应激组及药物应激组,使用CUMS方案建立大鼠抑郁模型,以旷场实验、糖水偏好实验、新物体识别实验评估大鼠行为,酶联免疫吸附方法测定S100β和BDNF的表达。结果 安慰剂应激组小鼠糖水偏爱率(52.48±13.14)%、基本动作(845.8±371.4) s、精细动作(565.6±211.9) s、静止时间(282.6±11.8) s,与安慰剂对照组(84.30±6.15)% (t=7.49,P=0.000)、(1239.1±281.6) s (t=2.83,P=0.008)、(801.8±150.9) s (t=3.05,P=0.003)、(268.2±12.8) s (t=2.72,P=0.001)相比差异有统计学意义,而和药物应激组相比,糖水偏爱率(80.55±11.31)%(t=5.39,P=0.000)、基本动作(1156.4±314.7) s (t=2.13,P=0.031)、精细动作(736.1±150.0) s (t=2.21,P=0.008)差异有统计学意义,安慰剂应激组大鼠前额叶与海马中BDNF蛋白表达量与药物应激组及安慰剂对照组相比差异均无统计学意义,安慰剂应激组大鼠前额叶内S100β的表达量(13.22±2.23) ng/g与药物应激组(10.55±2.72) ng/g相比差异有统计学意义 (t=2.67,P=0.014)。Pearson相关分析显示,大鼠前额叶及海马内BDNF蛋白表达水平与S100β表达呈正相关(r=0.35,P=0.034;r=0.36,P=0.034),行为学上新物体识别指数与海马内BDNF蛋白表达呈正相关(r=0.38,P=0.021),精细动作与前额叶内S100β表达呈负相关(r=-0.36,P=0.037)。结论 慢性应激导致大鼠出现的不同抑郁行为选择性地与不同脑区中S100β与BDNF蛋白表达具有相关性,S100β及BDNF蛋白独立参与调节抑郁症的病理过程。     

微小RNA-133b对心肌纤维化的影响

目的 研究微小RNA-133b(miR-133b)对心肌纤维化的影响。方法 选取人心肌成纤维细胞(CFs),采用CCK8检测过表达及敲低miR-133b时细胞增殖情况,qRT-PCR及Western blot检测结缔组织生长因子(CTGF)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ)及Ⅲ型胶原蛋白(collagen Ⅲ)的表达水平;生物学软件预测miR-133b的靶基因,双荧光素酶报告实验证实miR-133b与靶基因的直接调控作用。 结果 qRT-PCR检测结果显示,转染miR-133b mimic后miR-133b的表达水平明显高于阴性对照组(t=26.219,P=0.000),转染miR-133b inhibitor后miR-133b的表达水平明显低于阴性对照组(t=6.738,P=0.003)。转染CFs 21、45、69、93和117 h后,与阴性对照组相比,miR-133b mimic组CFs增殖能力明显降低,而miR-133b inhibitor组CFs增殖水平明显上升(P均<0.05)。与阴性对照组相比,过表达miR-133b后,CTGF(t=9.213,P=0.001;t=8.195,P=0.001)、α-SMA(t=6.511,P=0.003;t=4.434,P=0.011)、collagenⅠ(t=3.172,P=0.034;t=4.053,P=0.015)及collagen Ⅲ(t=6.404,P=0.003;t=5.319,P=0.006)的mRNA和蛋白表达水平均明显下调;敲低miR-133b后,CTGF(t=9.439,P=0.001;t=14.100,P=0.000)、α-SMA(t=4.519,P=0.011;t=4.377,P=0.012)、collagenⅠ(t=5.966,P=0.004;t=5.514,P=0.005)及collagen Ⅲ(t=4.622,P=0.010;t=4.996,P=0.008)的mRNA和蛋白表达水平均明显上升。共转染miR-133b mimic和WT 3’UTR表达载体细胞的相对荧光素酶活性明显低于共转染mimic control和WT 3’UTR表达载体的细胞(t=5.654,P=0.005),共转染miR-133b mimic和MUT 3’UTR表达载体细胞的相对荧光素酶活性与共转染mimic control和MUT 3’UTR表达载体的细胞差异无统计学意义(t=0.380,P=0.724)。结论 miR-133b可能是通过靶向抑制CTGF来影响CFs的活化增殖,从而改善心肌纤维化。     

肺癌肿瘤干细胞的分选及生物学特性

目的 探讨肺癌肿瘤干细胞分选及生物学特性的研究方法。方法 采用免疫磁珠分选经盐酸阿霉素(ADM)诱导的人肺腺癌SPC-A-1(SPC-A-1/ADM)细胞系中的ABCG2 ⁺和ABCG2 ^-细胞,流式细胞术和裸鼠体内移植针对ABCG2 ⁺和ABCG2 ^-细胞体内的成瘤率进行测定分析。结果 SPC-A-1细胞中的荧光强度平均为(1.001±0.014)×10 ²,明显低于SPC-A-1/ADM细胞的(10.257±0.023)×10 ²(t=17.320,P=0.001)。SPC-A-1细胞ABCG2/BCRP-FITC处理组与SPC-A-1细胞对照组(t=5.269,P=0.021)和SPC-A-1细胞同型对照组(t=6.869,P=0.012)间差异有统计学意义;SPC-A-1/ADM细胞对照组与SPC-A-1/ADM细胞同型对照组间差异有统计学意义(t=8.112,P=0.015)。SPC-A-1/ADM 细胞 ABCG2/BCRP-FITC 处理组阳性率为9.8%,是SPC-A-1细胞组的39.84倍。SPC-A-1/ADM 细胞 ABCG2/BCRP-FITC 处理组与SPC-A-1/ADM细胞组(t=9.120,P=0.005)和SPC-A-1/ADM细胞同型组(t=8.257,P=0.006)间差异有统计学意义。B 群细胞阳性率是 A 群细胞的 684 倍,差异有统计学意义(t=11.235,P=0.001),且 B 群细胞的荧光强度较强。接种SPC-A-1 细胞、A群细胞和B 群细胞的裸鼠平均成瘤体积分别为(6.96±1.82)、(6.70±2.55)和(9.17±2.41)mm ³,以接种B群细胞组最高,但3组间差异无统计学意义(F=2.362,P=0.086)。接种B群细胞组的成瘤率为75.00%,明显高于SPC-A-1 细胞组和A 群细胞组(F =19.780,P=0.002)。结论 ABCG2抗体与免疫磁珠分选法结合可以从人肺腺癌 SPC-A-1/ADM 细胞系内分离ABCG2 ⁺细胞,其在裸鼠体内成瘤情况良好,可用于肺癌肿瘤干细胞的分选及生物学特性研究。     

硫化氢对大鼠肢体再灌注损伤后炎症因子和线粒体能量代谢障碍的影响

目的 探讨硫化氢对大鼠肢体再灌注损伤后炎症因子和线粒体能量代谢障碍的影响。方法 60只大鼠分为3组:假手术组、对照组(缺血-再灌注损伤+生理盐水组)和实验组(缺血-再灌注损伤+H₂S 组)。建立Wistar大鼠肢体缺血再灌注损伤模型。采集骨骼肌标本测定坏死分解产物[包括肌红蛋白(MB)、脂蛋白复合物(LPC)以及脂质过氧化物(LPO)]的含量;采集血液标本测定白介素(IL)-1、IL-6及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量;提取骨骼肌细胞线粒体进行线粒体跨膜电位测定及ATP含量检测。对检测结果进行统计学分析。结果 对照组大鼠在缺血再灌注损伤后肢体骨骼肌、肝脏、肺脏及肾脏组织内MB、LPO和LPC的含量均明显增高(MB:P_骨骼肌=0.003,P_肝脏=0.001,P_肺脏=0.001,P_肾脏=0.001;LPO:P_骨骼肌=0.001,P_肝脏=0.001,P_肺脏=0.001,P_肾脏=0.002;LPC:P_骨骼肌=0.000,P_肝脏=0.002,P_肺脏=0.002,P_肾脏=0.003),而缺血再灌注时采用硫化氢处理可明显抑制MB、LPO及LPC的生成(MB:P_骨骼肌=0.021,P_肝脏=0.036,P_肺脏=0.005;LPO:P_骨骼肌=0.003,P_肝脏=0.008,P_肺脏=0.010,P_肾脏=0.015;LPC:P_骨骼肌=0.002,P_肝脏=0.026,P_肺脏=0.007,P_肾脏=0.006)。大鼠下肢缺血再灌注可导致大鼠血清中IL-1、IL-6及TNF-α的含量均升高,并且随着时间推移,IL-1、IL-6及TNF-α含量升高呈递增趋势,且自3 h时各组间IL-1、IL-6及TNF-α含量差异有统计学意义(IL-1:P_{3 h}=0.019,P_{6 h}=0.011,P_{9 h}=0.009,P_{12 h}=0.008,P_{15 h}=0.002;IL-6:P_{3 h}=0.026,P_{6 h}=0.009,P_{9 h}=0.002,P_{12 h}=0.002,P_{15 h}=0.003;TNF-α:P_{3 h}=0.002,P_{6 h}=0.002,P_{9 h}=0.005,P_{12 h}=0.002,P_{15 h}=0.003)。而缺血再灌注时采用硫化氢处理可明显抑制血清中 IL-1、IL-6及TNF-α的含量水平(IL-1:P_{3 h}=0.035,P_{6 h}=0.039,P_{9 h}=0.012,P_{12 h}=0.005,P_{15 h}=0.006;IL-6:P_{3 h}=0.042,P_{6 h}=0.025,P_{9 h}=0.023,P_{12 h}=0.006,P_{15 h}=0.005;TNF-α:P_{3 h}=0.005,P_{6 h}=0.003,P_{9 h}=0.022,P_{12 h}=0.005,P_{15 h}=0.005),随着时间推移,其抑制效果越明显。对照组大鼠肢体缺血再灌注后,骨骼肌细胞线粒体跨膜电位比假手术组大幅度下降(t=6.698;P=0.001),而实验组经过硫化氢处理后线粒体膜势能高于对照组(t=7.507;P=0.000)。对照组大鼠缺血再灌注骨骼肌细胞内线粒体的ATP含量比假手术组下降(t=7.526;P=0.000);而实验组经过硫化氢处理后线粒体ATP 含量高于对照组(t=8.604;P=0.000)。结论 硫化氢在肢体缺血再灌注后,可以减轻骨骼肌及远隔器官的损伤,减轻局部炎性反应程度,同时还对减轻再灌注损伤时线粒体跨膜电位和能量代谢障碍具有重要意义。     

泛素E3连接酶对多发性骨髓瘤细胞增殖、克隆形成能力的影响

目的 明确泛素E3连接酶(DTL)对多发性骨髓瘤细胞增殖、克隆形成的影响,并探讨其机制。方法 提取34例多发性骨髓瘤患者骨髓中CD138+细胞后,以14例健康志愿者骨髓单个核细胞为对照,实时定量PCR检测DTL在mRNA水平的变化,并选取12例骨髓瘤患者和2例对照,Western blot检测DTL在蛋白水平的变化。同时,人骨髓瘤细胞系RPMI8226分为对照(CON)与DTL敲低(DTL-shRNA)组,感染10 感染复数 CON与DTL-shRNA病毒48 h,使用流式细胞仪确认慢病毒的感染效率、实时定量基因扩增荧光检测系统和Western blot确认在mRNA和蛋白水平的敲低效率,使用细胞增殖及毒性检测试剂盒检测细胞在随后的0、24、48、72、96 h的细胞数量变化,将CON与DTL-shRNA细胞培养于半固体培养基中,10 d后倒置相差显微镜观察大于50个细胞的克隆数量,并使用膜联蛋白 V/碘化丙啶双染法检测凋亡的变化,碘化丙啶染色检测细胞周期的变化。使用Western blot检测核因子-κB(NF-κB)通路中P65和抑制因子κBα(IκBα)磷酸化水平的改变、凝胶迁移实验检测NF-κB转录活性的变化。结果 健康志愿者骨髓单个核细胞与骨髓瘤患者CD138+细胞中,DTL的表达量分别为1.00±0.12 和 9.36±3.71(t=3.65,P=0.0024),DTL在骨髓瘤CD138+细胞中蛋白水平同样呈现过表达。RPMI8226感染CON与DTL-shRNA病毒48 h后,绿色荧光蛋白阳性细胞的比率为90%,CON组与DTL-shRNA组DTL在mRNA水平相对表达量分别为1.00±0.01 和 0.21±0.04(t=33.19,P<0.0001),在蛋白水平 DTL的相对表达量分别为0.52±0.13 和 0.11±0.02(t=5.399,P=0.0057)。CCK8检测CON组与DTL-shRNA组细胞增殖后显示0、24、48、72、96 h的细胞增殖倍数分别为1.00±0.03 比 1.00±0.02、2.19±0.28 比 1.47±0.13、3.50±0.14 比 2.24±0.19、5.43±0.41 比 3.08±0.14、7.42±0.17 比 4.29±013(F=24.58,P=0.001)。检测CON组与DTL-shRNA组的克隆形成后显示,DTL-shRNA组大于50个细胞的克隆不可见,CON与DTL-shRNA克隆形成数量分别为76±4比0(P<0.01),在细胞周期中,CON与DTL-shRNA组G1期细胞比例分别为(28.61±8.64)%比(57.25±10.37)%(t=3.675,P=0.0213),细胞凋亡中,CON与DTL-shRNA组膜联蛋白 V+细胞比例为(3.21±0.89)%比(34.71±18.68)%(t=2.895,P=0.0443)。RPMI8226感染CON与DTL-shRNA慢病毒48 h后,CON与DTL-shRNA 磷酸化P65相对表达量分别为1.52±0.14 和 0.82±0.11(t=6.81,P=0.0024),而P65的表达分别为0.25±0.04 和 0.24±0.08(t=0.19,P=0.85),差异无统计学意义,CON与DTL-shRNA 磷酸化IκBα的相对表达量分别为0.19±0.03 和 0.13±0.02(t=2.882,P=0.0449),而IκBα相对表达量分别为0.22±0.05 和1.01±0.06(t=17.52,P<0.0001)。凝胶迁移实验检测DTL-shRNA NF-κB转录活性进一步确定了DTL的下调抑制了NF-κB转录活性。结论 DTL在多发性骨髓瘤细胞中高表达,且DTL的下调抑制了细胞增殖,阻断了克隆形成,促进细胞凋亡和细胞周期阻滞,而DTL对骨髓瘤细胞生物学功能的影响与NF-κB通路的改变相关。