pEGFP-HPV16 E6重组质粒的构建及其在Hela细胞中的表达定位

目的 构建以绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)为报告基因的重组表达质粒pEGFP-HPV16 E6.方法 利用脂质体转染体外培养的Hela细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察pEGFP～HPV16 E6融合蛋白在细胞中的分布和定位,用Western blot方法验证其蛋白的表达.结果 在空载体pEGFP-C2转染组中,Hela细胞内绿色荧光呈弥散分布;重组质粒pEGFP-HPV16 E6转染组中,绿色荧光集中在细胞核中.结论 pEGFP-HPV16 E6融合基因真核表达载体在真核细胞Hela中获得了表达,细胞所表达的融合蛋白具有HPV16 E6和EGFP的双重活性,可用荧光显微镜直接观察其表达情况及亚细胞定位,为HPV16 E6的功能研究提供了线索.     

血管生成素与绿色荧光蛋白融合蛋白的表达及纯化

目的:表达并纯化血管生成素(ANG)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白,以进一步探讨血管生成素的生物学功能。方法:PCR扩增人ANG基因,将其与EGFP基因融合后克隆到高表达载体pMFHT,构建了原核表达质粒pHIS鄄ANG鄄EGFP。该质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并用金属螯合亲和层析纯化目的蛋白。激光共聚焦显微镜和Westernblot鉴定融合蛋白的表达情况。结果:重组蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,并从破菌上清中一步纯化目的蛋白,纯度可达95%以上。Westernblot分析表明表达产物具有良好的抗原性和特异性。诱导表达的菌体在激光共聚焦显微镜下可发射明亮的绿色荧光。结论:成功的表达并纯化了ANG鄄EGFP融合蛋白,利用EGFP的荧光示踪作用,该融合蛋白可用于血管生成素核转位和胞内共定位蛋白质研究。     

凋亡抑制因子survivin基因的克隆及在真核细胞中的表达

目的:克隆Survivin编码序列并在真核细胞中表达.方法:RT-PCR扩增Survivin编码序列,建立与绿色荧光蛋白(GFP)共表达的融合重组质粒,转染哺乳动物细胞,利用GFP绿色荧光和WesternBlot检测Survivin蛋白的表达.结果:RT-PCR扩增出421bp的Survivin编码序列,构建融合重组质粒pEGFP-C1-Survivin,利用GFP荧光和Western Blot证实Sur-vivin蛋白的表达.结论:成功克隆Survivin基因并在真核细胞中表达.     

融合蛋白表达质粒pUL54S-EGFP的构建及在AD293细胞中的表达

目的 探讨构建人巨细胞病毒(HCMV)截短UL54(UL54S)基因融合增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达质粒pUL54S-EGFP转染人胚肾293细胞,瞬时表达UL54S和EGFP的可行性.方法 采用PCR法扩增UL54s基因并将其克隆入真核表达载体pEGFP-N1中,采用脂质体法转染AD293细胞后通过荧光显微镜和流式细胞仪分析EGFP的表达情况.结果 重组质粒pUL54S-EGFP转染AD293细胞12h后即可见到荧光蛋白的表达,至48h表达达高峰;转染48h pUL54S-EGFP组平均转染率为47%.平均荧光强度为547.结论 重组质粒pUL54S-EGFP可在人胚肾293细胞内瞬时表达UL54S和EGFP融合蛋白,EGFP的表达可报告UL54基因的表达,质粒pUL54S-EGFP构建成功.     

用pdx-1和EGFP建立核定位信号的实验教学模型

目的建立核定位信号的实验教学模型．方法构建pdx-1基因和EGFP基因融合表达的表达载体,脂质体转染法将载体转入培养的HeLa细胞,荧光显微镜下观察．结果转染的HeLa细胞仅在细胞核发荧光,证明pdx-1蛋白的核定位信号将融合蛋白EGFP-pdx-1引导到细胞核．结论用转录因子pdx-1和增强型绿色荧光蛋白EGFP建立核定位信号的实验教学模型是可行的．     

Lipopolysaccharide induces RAW264.7 macrophageautophagy-related LC3B-GFP fluorescent aggregates formed

目的 构建pEGFP-C1/LC3B重组质粒并转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,观察脂多糖(LPS)诱导其自噬相关LC3B-GFP荧光聚集体形成的过程.方法 根据编码小鼠微管相关蛋白1轻链3β(LC3B)的开放读码框(ORF)设计引物,RT-PCR扩增小鼠LC3B的ORF,构建pEGFP-C1 /LC3B重组质粒;脂质体法转染并筛选稳定表达RAW264.7细胞株,荧光显微镜观察及Western blot鉴定LC3B-GFP融合蛋白表达;LPS刺激稳定转染的RAW264.7细胞株,激光共聚焦显微镜检测不同时间绿色荧光聚集体的分布.结果 成功构建真核表达质粒pEGFP-C1 /LC3B,并获得稳定表达LC3B-GFP融合蛋白的RAW264.7细胞株,荧光显微镜下可见细胞内有绿色荧光蛋白分布,Western blot鉴定表达LC3B-GFP融合蛋白,激光共聚焦结果 显示LPS刺激前融合蛋白呈弥散性分布在胞浆中,而LPS刺激后细胞内有明显绿色荧光聚集体形成并呈时间依赖性逐渐增加.结论 成功构建pEGFP-C1/LC3B,转染RAW264.7细胞可正确表达LC3B-GFP融合蛋白,LPS刺激后显示绿色荧光聚集体形成.     

绿色荧光蛋白与鼠盘状结构域受体2融合基因的构建与表达

目的: 构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组表达质粒DDR2/pEGFP-N3 并分析该融合基因在活细胞中的表达.方法: 利用反转录PCR扩增鼠盘状结构域受体2(DDR2)cDNA,并重组于pEGFP-N3载体.脂质体体外瞬时转染培养的COS-7细胞,RT-PCR和Western Blot分析该融合基因的表达.结果: 从NIH3T3细胞中克隆到DDR2基因的cDNA,并成功构建DDR2-EGFP融合表达载体.以该质粒转染细胞48 h后,RT-PCR和Western Blot分析表明该融合基因能够在COS-7细胞中正确表达.结论: DDR2/pEGFP-N3融合基因真核表达载体构建成功.该融合蛋白具有DDR2和EGFP双重特性,为进一步研究DDR2的功能提供了工具.     

构建及在血管内皮细胞中的表达

目的:构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)及绿色荧光蛋白报告基因的融合蛋白真核表达质粒,并检测其在血管内皮细胞中的表达.方法:采用PCR扩增VEGF165基因全长,并将其定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP/VEGF165重组质粒,经酶切、PCR及序列分析鉴定,脂质体介导转染体外培养的血管内皮细胞,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹等方法检测EGFP/VEGF融合蛋白的表达.结果:PCR、酶切及测序证实目的基因VEGF165正确连接至pEGFP-N1的多克隆位点,pEGFP/VEGF165重组质粒转染血管内皮细胞后,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹检测均显示EGFP/VEGF蛋白在血管内皮细胞中表达.结论:成功构建了携带人VEGF165及EGFP报告基因的融合蛋白真核表达质粒,pEGFP/VEGF165可在血管内皮细胞中表达,此为进一步研究VEGF基因治疗缺血性血管疾病奠定了实验基础.     

重组pEGFP-C2-p100质粒构建及表达

目的:将人类p100基因定向连入pEGFP-C2质粒,使p100蛋白可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达,为进一步研究p100蛋白的功能及定位奠定实验基础.方法:采用EcoR I和BamH I双酶切方法,从pSG5-p100质粒中获得p100蛋白的cDNA全长;将该cDNA连接入pEGFP-C2质粒.将构建成功的pEGFP-C2-p100质粒转染入HeLa细胞.荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达.结果:(1)将该质粒进行双酶切鉴定可见p100片段.(2)转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达.结论:(1)p1OO cDNA全长成功载入pEGFP-C2质粒.(2)p100蛋白可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞中融合表达.     

TNIP1真核表达载体的构建及表达

目的构建肿瘤坏死因子α诱导蛋白3相互作用蛋白1(TNIP1)真核表达载体(p EGFP-N3-TNIP1),观察了解外源TNIP1蛋白的细胞内定位及其在He La细胞中的表达.方法应用RT-PCR从人外周血淋巴细胞中扩增TNIP1基因的开放阅读框(ORF),将目的片段亚克隆入p EGFP-N3中,筛选阳性克隆,提取质粒测序进行鉴定.将表达质粒转染He La细胞,荧光显微镜观察融合蛋白在细胞内的表达与定位,实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和蛋白质免疫印迹分别从m RNA水平和蛋白水平来检测TNIP1在He La细胞中的表达情况.MTT实验检测细胞增殖情况、流式细胞仪检测细胞周期.结果重组质粒双酶切鉴定,在1.9 kb左右有明显的条带,DNA测序结果证实重组质粒p EGFP-N3-TNIP1中含有的目的基因片段与Gen Bank上登录号为BC014008.1的TNIP1基因序列完全一致;荧光倒置显微镜观察重组质粒转染He La细胞后有绿色荧光蛋白的表达,转染48 h后通过q RT-PCR和Western blot分别检测到TNIP1m RNA和蛋白质的表达,均较对照明显升高,外源性的TNIP1蛋白主要定位于细胞质中.结论成功构建了p EGFP-N3-TNIP1真核表达载体,外源表达的TNIP1蛋白主要分布于He La细胞的细胞质部分,过表达TNIP1蛋白不影响He La细胞的细胞周期及细胞生长存活.     

人转录因子sp1在大肠杆菌中的表达与体外纯化

目的：在大肠杆菌中表达人源转录因子spl蛋白,并进行体外纯化。方法：首先将人源sp1真核表达质粒pCMV-sp1中的sp1 cDNA用限制性内切酶切开,连入原核表达质粒pET28b,构建原核表达重组质粒pET28b-sp1-699c;然后将重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）菌株,经IPTG诱导表达带His-Tag的融合蛋白His-sp1（88-786aa）,通过包涵体的变复性和Ni-IDA亲和层析纯化后,SDS-PAGE鉴定纯化后的蛋白。结果：融合蛋白His-sp1在大肠杆菌内得到高效表达,纯化后可得到较高纯度的蛋白。结论：本研究获得了较高纯度的融合蛋白His-sp1,为进一步研究sp1蛋白对靶基因的转录调控奠定了基础。     

颗粒溶素的表达纯化及生物学活性分析

目的:采用原核表达系统对颗粒溶素(granulysin,GNLY)进行体外表达,纯化及活性鉴定.方法:以体外培养的人外周血单个核细胞(PBMC)为模板,RT-PCR扩增编码GNLY的cDNA片段,插入pMD-18-T 载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a( ) 中,构建重组表达质粒pET28a( )-GNLY,转化大肠杆菌BL21(DE3) plysS,IPTG诱导表达融合蛋白,包涵体经变复性后用Ni亲和层析纯化,CFU法测定蛋白活性.结果:成功地将GNLY cDNA片段插入载体pET28a( )中,构建了表达质粒pET28a( )-GNLY.经诱导在原核表达系统中以包涵体形式高效表达了相对分子质量为9 000的融合蛋白,变复性纯化后的GNLY蛋白经CFU法检测,发现其具有细胞毒活性且细胞毒作用具有剂量依赖性.结论:本实验利用原核表达系统成功地表达了具有生物学活性的GNLY,为研究其功能、作用机制及临床应用奠定了基础.     

GST-HPV16E7融合蛋白的原核表达与纯化

目的 构建HPV16地方株E7基因原核表达质粒,使其在原核细胞中高效表达并进行纯化.方法 将成都本地某宫颈癌患者所感染的HPV16 E7全长片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组子pGEX-4T-1-HPV16E7,转化宿主菌E.coli BL-21.经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE、Western blot分析证实蛋白表达的特异性.并用GST亲和层析法对融合蛋白进行纯化.结果 该患者所感染的HPV16为东亚株,成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1-HPV16E7并表达出GST-HPV16E7融合蛋白,证实了蛋白表达的特异性,并获得了GST-HPV16E7融合蛋白的纯品.结论 成功表达、纯化了本地流行株GST-HPV16E7融合蛋白,为进一步研究HPV16E7蛋白的功能奠定了实验基础.     

用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素

目的 利用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素（endostatin）.方法 采用PCR技术从pMFGendo质粒上扩增出小鼠endostatin完整的cDNA序列,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pThiohisA中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物为包涵体,将包涵体纯化后通过镍柱亲和层析得到纯化的、可溶性的小鼠内皮抑素,经SDS-PAGE分析鉴定.结果 高效表达出相对分子量约32KD的重组融合蛋白,灰度扫描软件分析显示,其表达量占菌体总蛋白质的35.9%,经镍柱亲和层析获得了高纯度的小鼠内皮抑素重组融合蛋白,纯度可达95%,得率为0.27g/L.结论 用硫氧还蛋白融合表达系统在大肠杆菌中表达的小鼠内皮抑素重组融合蛋白易纯化并具有高活性.     

pET15b-EGFP原核表达载体的构建及其表达和纯化

目的:利用中间载体pGEM-T easy vector构建表达型载体pET15b-EGFP,在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白EGFP并将其纯化。方法:以质粒pLEGFP-C1为模板采用聚合酶链反应(PCR)的方法特异性扩增EGFP cD-NA序列,利用Taq DNA聚合酶的非模板依赖性末端转移酶活性催化PCR扩增的EGFP序列和三磷酸脱氧腺苷(dATP)反应,在EGFP序列两3’端加“A”,将纯化后的EGFP序列与中间载体pGEM-T easy vector连接后转化感受态大肠杆菌DH5α,经蓝白筛选,挑取白色单菌落进行扩增、酶切鉴定,正确重组的质粒命名为pGEM-T-EGFP。用XhoI和BamH I分别双酶切pGEM-T-EGFP和pET15b,低熔点琼脂糖回收EGFP cDNA和线性化的pET15b片段后将两片段相连,转化感受态大肠杆菌DH5α并对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序,获取正确重组的表达型质粒并命名为pET15b-EGFP。将正确重组的质粒pET15b?EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。利用表达蛋白N端的组氨酸“标签”(H is-tag)进行N i2+-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE和W estern b lotting鉴定纯化蛋白质。结果:经测序证实重组质粒pET15b-EGFP中的EGFP cDNA序列与从C lontech公司购买的质粒pLEGFP-C1中的EGFP cDNA序列完全一致,从而成功构建了表达型重组质粒pET15b-EGFP。pET15b-EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)并经诱导后得到高效表达,表达量可达66 mg/100 m l菌液,SDS-PAGE和W estern b lotting显示纯化蛋白为目的蛋白EGFP。结论:表达型重组质粒pET15b-EGFP的成功构建和表达、纯化为细胞穿透肽-EGFP融合蛋白穿透细胞能力的研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌cagA蛋白的克隆表达与鉴定

目的　构建表达幽门螺杆菌 (Hp)毒素相关基因A蛋白 (cagA)的重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白 ,为检出幽门螺杆菌致病株和运用于临床检测Hp感染奠定基础。 方法　PCR扩增出编码毒素相关基因蛋白DNA片段后构建出重组质粒 pET -cagA ,并经质粒酶切筛选、DNA测序、IPTG诱导DE3 表达融合蛋白和Western blot予以证实。表达的融合cagA蛋白经过纯化和凝血酶酶切验证cagA蛋白抗原性。 结果　克隆的cagA核苷酸序列与GeneBank(AB116 74 4 )公布的序列相比较 ,同源性达 99.34% ,推定氨基酸序列同源性为 99.0 1%。SDS -PAGE和Western blot检测到带有His tag的约 4 0kD融合蛋白中表达。融合蛋白酶切后能与抗cagA人抗血清发生阳性反应。 结论　重组cagA的原核表达质粒构建正确 ,蛋白表达成功 ,具有反应原性     

鼠HMGB1蛋白的原核表达及分离纯化

目的:克隆小鼠HMGB1基因,构建原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并分离纯化获得His-HMGB1的融合蛋白.方法:脂多糖刺激后的RAW264.7细胞,提取总RNA,经RT-PCR扩增出含HMGB1的目的片段,克隆于pMD-19T载体,再亚克隆至含有pelB引导肽及His-标签肽的高效表达载体pET-26b( ),转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后行SDS-PAGE鉴定目标蛋白表达,用镍鳌合琼脂糖凝胶亲和层析法分离纯化含His-标签肽的目的蛋白.结果:经PCR扩增出大小为648 bp的HMGB1基因片段,成功构建目标蛋白的融合表达载体,经诱导表达及分离纯化,获得了约30 kD的融合蛋白.结论:构建HMGB1的融合表达载体,获得分离纯化融合蛋白His-HMGB1,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

pEGFP-NeuroD重组质粒在肝癌细胞中的表达及其功能探讨

目的:利用含绿色荧光蛋白的重组表达质粒pEG-FP-NeuroD做基因转染,观察其在肝癌细胞(HepG2)中的表达,探讨其在体外诱导肝细胞分泌胰岛素的可能性.方法:将酶切验证正确的重组质粒pEGFP-NeuroD,用脂质体法转染3种不同葡萄糖浓度培养的HepG2细胞,荧光显微镜下观测各组绿色荧光蛋白的表达情况;采用RT-PCR方法检测HepG2细胞中NeuroD-1及insulin mRNA的表达;采用Western Blot方法检测EGFP-NeuroD融合蛋白的表达.结果:①重组质粒体外成功转染入HepG2细胞,在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白的表达,重组质粒转染率在30%～40%之间;②RT-PCR方法及Western Blot在3种不同葡萄糖浓度培养的细胞组中均榆测到NeuroD-EGFP融合蛋白的表达,其中RT-PCR方法扩增出NeuroD-1目的片段大小为634 bp,而融合蛋白Mr大小约为67×103,但是3组间蛋白表达量均无明显差异;③RT-PCR法未检测到肝癌细胞胰岛素的分泌.结论:重组表达质粒pEGFP-NeuroD可体外转染入HepG2细胞,功能探讨提示单一NeumD-1表达质粒的转染可能不足以诱导肝癌细胞分泌胰岛素.     

pET15b-YARA-EGFP原核表达质粒的构建及融合蛋白YARA-EGFP的表达与纯化

目的:构建原核表达载体pET15b-YARA-EGFP,并进行YARA-EGFP融合蛋白的表达和纯化。方法:用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b-YARA-EGFP,在E.coliBL21(DE3)中表达融合蛋白YARA-EGFP,并进行Ni2+-NTA树脂柱亲和层析以纯化蛋白。结果:经测序证实成功构建了表达型载体pET15b-YARA-EGFP,YARA-EG-FP融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中得到表达,纯化后的蛋白浓度为1.098mg/mL。SDS-PAGE和Western blot分析表明纯化蛋白为目的蛋白YARA-EGFP。结论:已成功制备出YARA-EGFP融合蛋白。