转染的FasL基因诱导HCC9204细胞凋亡的形态学研究

目的 构建含FasL基因的腺病毒载体，转染肝癌9204细胞株，观察FasL基因对9204细胞株的影响。方法 以腺病毒作载体，把FasL基因克隆入腺病毒载体，构建成含FasL基因的转基因载体并酶切鉴定，用脂质体包裹法把含FasL的腺病毒载体转染HCC9204细胞株，用RT－PCR方法证实转染后有无FasL基因表达，采用电镜观察9204细胞形态学变化。结果 酶切鉴定证实含FasL基因的转基因载体构建成功；RT－PCR显示转染后9204细胞株FasL基因表达水平显高于未转染细胞株（P＜0.01）；肝癌细胞株9204转染FasL基因72h后，在光镜下可见调亡细胞体积缩小，生长不良，染色质浓度，密度增高，胞核中出现颗粒样物质，电镜下可见调亡小体。结论 成功地构建了FasL基因的转基因载体；转染FasL基因可诱导肝癌9204细胞株出现凋亡。     

基因转移FasL诱导人黑色素瘤细胞凋亡的体外实验

目的 探讨体外基因转移Fas配体（Fas-ligand,FasL)对人恶性黑色素瘤细胞凋亡的影响。方法 用携带人FasL,cDNA的缺陷型重组腺病毒载体（Ad-FL)，在体外转导两株黑色素瘤细胞，并使其表达；通过流式细胞仪，RT－PCR法进行Fas/FasL表达检测，TUNEL法及荧显微镜相关凋亡检测，分析，结果 流式细胞仪和RT－PCR检测两株黑色素瘤细胞表面均表达Fas，不表达FasL，而Ad-FL转导的两株黑色素瘤细胞均能表达FasL，Ad-FL能显著诱导两株黑色素瘤细胞在体外凋亡或抑制其生长。结论 重组腺病毒FasL在体外诱导人黑色素瘤凋亡效果显著。     

重组腺病毒载体介导人抑瘤素M基因对胰腺癌细胞体外增殖的抑制作用

目的构建了含人抑瘤素M（HOSM）基因的复制缺陷型重组腺病毒载体AD—HOSM，观察其对人胰腺癌细胞株Capan－2在体外生长抑制情况，为胰腺癌的基因治疗提供参考。方法通过同源重组方法构建含HOSM基因的缺陷型腺病毒载体AD—HOSM，报告基因AD—GFP检测腺病毒的对胰腺癌细胞系的转染效率；人胰腺癌细胞株Capan－2转染含HOSM基因的缺陷型腺病毒载体AD—HOSM后，用RT—PCR法检测外源HOSM基因在其中的表达；苔盘兰染色、细胞计数法检测AD—HOSM对Capan－2的体外增殖抑制情况。结果成功构建了重组腺病毒载体AD—HOSM，AD—HOSM对胰腺癌细胞Capan－2有较高的转染效率，HOSM基因在转染细胞能有效的表达。休外试验示AD—HOSM明显抑制CAPAN－2的的生长。结论重组腺病毒介导HOSM表达能有效抑制Capan－2在体外的增殖，提示重组腺病毒介导的HOSM基因治疗可能成为胰腺癌治疗的侯选方案。     

腺病毒介导的eNOS基因转移时血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的：探讨腺病毒载体介导的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因转染血管平滑肌细胞（VSMC）的效率及其对冠状动脉旁路移植术后再狭窄基因治疗的可行性。方法：构建带有eNOS基因的复制缺陷型重组腺病毒转染体外培养的VSMC，应用聚合酶（PCR），逆转录PCR（RT－PCR）技术和免疫组化法检测外源基因转染及表达效率；应用MTT法和流式细胞仪检测eNOS基因对VSMC的抑制作用。结果：外源性eNOS基因成功导入了VSMC；VSMC中有eNOS基因mRNA的表达；外源性eNOS蛋白呈高效表达。eNOS基因重组腺病毒载体转染细胞后，可显著抑制VSMC的生长，DNA合成减少。结论：腺病毒介导的eNOS基因可高效地转染VSMC，并可有抑制细胞生长。     

hTERT启动子调控的TRAIL基因载体的构建及表达

目的：构建hTERT启动子调控的TRAIL基因载体，探讨hTERT启动子调控的转基因表达。方法：PCR法扩增膜结合型TRAIL基因，回收产物与带有hTERT启动子的载体连接，构建重组载体ph—TERT—TRAIL；瞬时转染乳腺癌细胞系MCF-7／ADR；采用RT—PCR法检测外源基因TRAILmRNA水平的表达，流式细胞术(FCM)检测蛋白水平的表达。结果：重组载体phTERT—TRAIL经PCR、酶切出现相应长度的片段；测序结果连入TRAIL基因；目的基因的序列分析结果与Genebank中的数据高度同源；RT—PCR显示细胞中外源基因TRAIL在mRNA水平明显表达；FCM显示转染了重组载体phTERT—TRAIL的细胞较未转染带有TRAIL基因载体的细胞TRAIL蛋白表达水平上调。结论：成功构建重组载体ph—TERT-TRAIL，hTERT启动子调控的TRAIL基因在乳腺癌细胞系MCF-7／ADR中明显表达。     

携带内皮型一氧化氮合酶基因重组腺病毒载体的构建

目的：构建带有内皮型一氧化氮合酶（eNOS)基因的重组腺病毒载体。方法：将eNOS cDNA克隆于腺病毒穿梭质粒pCA14，得到重组质粒pCA14-CMV-eNOS。采用磷酸钙－DNA沉淀法将质粒pCA14-CMV-eNOS与腺病毒拯救质粒pBHG10共转染293细胞，通过同源重组，生成带有eNOS基因的复制缺陷型重组腺病毒载体（AdCMVeNOS)。eNOScDNA重组进入腺病毒E1区并受CMV启动子控制。结果：经形态学、病毒DNA酶切、PCR和RT－PCR等方法的鉴定，证实了载体构建的正确性。结论：带有eNOS基因的重组腺病毒载体的成功构建，为心血管等疾病的基因治疗打下了基础。     

重组凋亡素真核表达载体诱导人卵巢癌细胞凋亡

目的 观察凋亡素基因（VP3）在卵巢癌细胞株CoCl中诱导凋亡的情况。方法 用Kpn Ⅰ、Xba Ⅰ分别双酶切pMD18-CAVP3和pcDNA3．1（＋），分别回收365bp和5．0kb大小的片断，然后常规行连接反应，构建重组凋亡素真核表达栽体pcDNA3．1-VP3。采用Lipofectamine^TM 2000介导的基因转染法，在体外将pcDNA3．1-VP3转染入卵巢癌细胞株CoCl中，RT—PCR检测凋亡素在细胞中的表达，用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 酶切鉴定及测序结果表明重组凋亡素真核表达载体pcDNA3．1-VP3构建成功。RT—PCR证实VP3基因在COCl中存在并在转录水平表达。转染pcDNA3．1-VP3细胞凋亡率明显高于转染空质粒组（P〈0．01）。结论 凋亡素可有效诱导卵巢癌细胞COCl凋亡。     

小鼠T-bet基因重组腺病毒载体的构建

【目的】构建小鼠T-bet基因重组腺病毒载体，为T-bet基因在支气管哮喘治疗中的作用研究提供有效的T-bet生物表达系统。【方法】采用内切酶从质粒T-bet／GFP-RV中切获约1．7kb的小鼠T-betcDNA片段，与穿梭质粒pShuttle连接，再通过稀有酶切位点将含T-betcDNA的表达盒与Adeno-X腺病毒载体骨架连接，构建重组载体pAdeno-T-bet，测序鉴定无错配及插入移位等DNA顺序改变，并转染HEK293细胞，出现CPE后取含病毒上清的细胞培养液抽提病毒DNA行PCR鉴定。【结果】PCR及酶切证实：T-betcDNA正确克隆到穿梭质粒pShuttle中，带T-betcDNA的表达盒成功重组到腺病毒载体基因组E1A缺失区，并在HEK293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒pAdeno-T-bet。【结论】本实验成功构建了小鼠T-bet基因重组腺病毒载体，并在HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒。     

双自杀基因融合基因重组腺病毒的制备与鉴定

目的：制备含胞嘧部氨酶（CD）基因，胸苷激酶（TK）基因的融合基因重组腺病毒，为恶性肿瘤的基因治疗研究作准备。方法：构建包含有CD，TK融合基因的重组粘粒，将其与腺病毒DNA末端肽复合物混合后以磷酸钙共沉淀法转染人胚肾293细胞株细胞，获取重组腺病毒，并进行鉴定。结果：酶切结果及PCR结果显示，重组粘粒中CD，TK融合基因插入正确，经鉴定所获重组腺病毒带有融合基因，并且无具有复制能力的腺病毒存在。结论：所获重组病毒为E1，E3缺陷型，含有所需的双自杀基因，可进一步用于基因治疗研究。     

乙肝病毒X基因真核表达载体pEGFP-X的构建及其表达

目的：构建pEGFP—X真核表达载体,观察其在肝癌细胞株中的表达。方法：从质粒pcDNA3．1（＋）-X酶切获HBVX基因片段,克隆至pEGFP—N1;用酶切、PCR和测序鉴定pEGFP—X载体;用脂质体法,将重组载体（pEGFP—X）和空载体（pEGFP-N1）瞬时转染肝癌细胞细胞株BEL-7402;分别用RT—PCR、荧光显微镜鉴定HBVX和EGFP基因表达。结果：鉴定证实pEGFP-X载体构建成功;该质粒瞬时转染的BEL-7402有HBVX基因表达,并发绿色荧光。结论：构建的pEGFP—X真核载体能在BEL-7402中表达,绿色荧光蛋白示踪利于表达HBVX基因稳定细胞株的筛选,并为探讨HBVX基因在HCC中的致瘤机理提供实验模型奠定基础。     

氯通道阻断剂NPPB对肾癌细胞系GRC-1生长的抑制作用

目的：研究NPPB对肾癌细胞系GRC—1增殖的抑制作用．方法：采用倒置光学显微镜观察、MTT比色实验、流式细胞仪检测细胞周期研究NPPB对肾癌细胞系GRC—1生长的抑制作用．结果：倒置光学显微镜观察和MTT比色实验显示NPPB对肾癌细胞系GRC—1的生长具有明显抑制作用，流式细胞仪检测NPPB使肾癌细胞系GRC—1绝大多数细胞的生长停滞于G0／G1期．结论：NPPB对肾癌细胞系GRC—1生长的抑制作用明显，其作用机制为NPPB抑制肾癌细胞系GRC—1的生长停滞于G0／G1期。     

白细胞介素-6与肾癌细胞生长关系的实验研究

目的　研究白细胞介素 6 (IL 6 )在肾癌细胞系GRC 1中的表达及其意义。方法　运用ELISA方法检测GRC 1培养上清中IL 6的浓度 ,运用免疫细胞化学和反转录聚合酶链反应 (RT PCR)在翻译和转录水平上检测IL 6及其受体系统的表达 ;观察重组人IL 6和IL 6中和抗体对GRC 1生长的影响 ;用表达IL 6反义RNA的质粒转染GRC 1,观察其增殖的改变。结果　GRC 1培养上清IL 6浓度为 46 5pg/ml,RT PCR显示IL 6mRNA及IL 6受体mRNA有表达 ;在重组人IL 6和IL 6中和抗体作用下生长无明显改变 ;转染表达IL 6反义RNA的质粒以后 ,GRC 1细胞IL 6分泌下降到 2 5 0pg/ml,但生长未受抑制。结论　尽管肾癌细胞系GRC 1可以表达IL 6 ,但重组人IL 6不能促进GRC 1的增殖 ,中和抗体和反义基因不能抑制细胞增殖 ,提示IL 6可能不是GRC 1的生长因子 ;GRC 1可以表达IL 6受体系统 (IL 6R和gp130 ) ,提示IL 6的信号传导中断可能发生在受体下游。     

苦参碱抑制人肾癌细胞系GRC-1细胞株增殖和促凋亡的实验研究

目的观察苦参碱对体外人肾癌细胞系GRC-1细胞株增殖及细胞凋亡的影响,探讨苦参碱诱导GRC-1细胞株凋亡的作用机制。方法应用不同浓度的苦参碱分别作用于人肾癌细胞系GRC-1细胞株24、48、72、96h。采用MTT法观察苦参碱对GRC-1细胞株的细胞毒作用;透射电镜和流式细胞术观察、检测苦参碱诱导的细胞凋亡;免疫细胞化学技术检测苦参碱对GRC-1细胞株Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。结果不同浓度的苦参碱对GRC-1细胞株均有一定的增殖抑制作用,且呈量效和时效关系。苦参碱能明显诱导GRC-1细胞株凋亡。经苦参碱作用后,GRC-1细胞株Bcl-2蛋白表达明显减弱而Bax蛋白表达明显增强。结论苦参碱对体外人肾癌细胞系GRC-1细胞株有一定的增殖抑制作用,其机制可能与调节Bcl-2/Bax蛋白表达比值以诱导细胞凋亡相关。     

Different Wnt-5A gene expressions in the renal cell carcinoma GRC-1 cell line during the cell cycle

ＴｈｅＷｎｔｇｅｎｅｂｅｌｏｎｇｓｔｏａｎｅｖｅｒｅｘｐａｎｄｉｎｇｆａｍｉｌｙｏｆｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅｓｔｈａｔｅｘｐｒｅｓｓｉｎｓｐｅｃｉｅｓｒａｎｇｉｎｇｆｒｏｍＤｒｏｓｏｐｈｉｌｉａｔｏｈｕｍａｎｂｅｉｎｇｓ1　Ｗｎｔ5ＡｉｓａｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅＷｎｔｇｅｎｅｆａｍｉｌｙａｎｄｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｂｒａｉｎ,ｌｉｍｂｓ,ｇｏｎａｄｓａｎｄｋｉｄｎｅｙｓｉｎｈｕｍａｎ,ｂｕｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＷｎｔ5Ａｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｉ…     

金雀异黄素对肾癌细胞系GRC-1细胞生物学行为的影响

目的：观察酪氨酸蛋白激酶抑制剂金雀异黄素（genistein)对GRC－1细胞的体外生物学行为的影响，探讨蛋白酪氨酸激酶（PTK）抑制效应用于肿瘤治疗的可能。方法：将细胞用金雀异黄素处理后，分别用MTT法、激光共聚焦显微镜、电子显微镜观察金雀异黄素对肿瘤细胞的体外生物学行为的影响。结果：金雀异黄素可显著抑制GRC－1细胞的增殖，使肿瘤细胞增殖停滞在G1期和G2期，并明显改变细胞的外在形态和细胞内波形蛋白的排列方式。结论：酪氨酸蛋白激酶抑制剂genisein可抑制肾肿瘤细胞的增殖（P＜0．01），并改变其细胞骨架的排布方式。酪氨酸激酶抑制剂有望开发成为有效的抗恶性肾肿瘤的药物。     

重组人生长激素对肾癌细胞株细胞周期动力学影响

目的　本实验试图阐明生长激素对于肾癌细胞有无促增殖和分化作用。方法　取对数生长期的人肾癌细胞株GRC -1,以氟尿嘧啶和 /或不同浓度的重组人生长激素 (rhGH)体外培养 ,2 4小时以后流式细胞仪测定细胞增殖周期和细胞凋亡等指标。结果　在空白对照组 ,G0 ～G1期的细胞数约占 5 3%,S期细胞数次之 ,G2 ～M期占不足 4%。在生长激素组 ,G0 ～G1期细胞数率降低 (P <0 .0 5 ) ,S期细胞百分率增高 (P <0 .0 1)。在单纯氟尿嘧啶组 ,G0 ～G1期细胞数增高 ,S期细胞数降低 ;同时加氟尿嘧啶和生长激素组与单纯氟尿嘧啶组相比 ,G0 ～G1期细胞数进一步增加 ,S期细胞数进一步降。结论　rhGH在体外作用于GRC -1细胞 ,能诱导细胞分化 ,促使静止细胞群进入增殖周期 ,并使处于DNA合成期的细胞增多 ,说明rhGH在体外有促进肾癌细胞生长增殖的作用 ,所以 ,我们推断肾癌细胞膜表面可能存在生长激素受体。氟尿嘧啶能使S期细胞数降低即抑制细胞的增殖 ,与氟尿嘧啶的作用机理相符。生长激素和氟尿嘧啶合用 ,S期细胞数进一步降低 ,说明生长激素能增强氟尿嘧啶抗肿瘤细胞生长增殖作用。     

感染慢病毒HSV1-sr39tk的肾癌细胞GRC-1的建立

目的建立携带增强的突变型单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV1-sr39tk）基因的慢病毒感染的肾癌细胞株GRC-1。方法采用改良的磷酸钙沉淀法将包装质粒、包膜蛋白质粒和含目的基因的转移质粒共转染293T包装细胞,收集的病毒上清感染GRC-1细胞。结果三质粒系统共转染293T细胞后获得较高滴度的慢病毒（2&#215;10^9U/L）。经RT-PCR检测证实HSV1-sr39tk基因已导入GRC-1细胞。结论慢病毒载体可高效、稳定地感染GRC-1细胞,成功建立感染慢病毒HSV1-sr39tk的肾癌细胞株GRC-1。     

G1Na-TK基因转染联合无环鸟苷(ACV)对人肾癌细胞株GRC-1细胞的体外杀伤作用

目的：探索ＨＳＶ１－ＴＫ基因联合应用无环鸟苷（ＡＣＶ）对人肾癌细胞株ＧＲＣ－１细胞的杀伤作用。方法对分别培养及混合培养的ＧＲＣ－１细胞和ＣＲＣ１－ＴＫ细胞,用不同浓度ＡＣＶ进行处理,然后观察细胞形态及数量的改变。结果在ＡＣＶ作用下,ＧＲＣ－１细胞的形态及数量无明显改变;ＧＲＣ－１／ＴＫ细胞被明显杀伤,数量明显减少,当今２５．０％ＧＲＣ－１／ＴＫ细胞的混合培养细胞即可观察到明显杀伤作用。结论ＨＳＶ１