人胚嗅粘膜嗅鞘细胞的分禽、培养和纯化

目的采用经我们改良的差速贴壁法结合神经营养因子3（NT3）和低浓度血清的培养方法对人胚嗅粘膜嗅鞘细胞进行分离和原代纯化培养，探讨建立嗅粘膜嗅鞘细胞体外培养的方法。方法对差速贴壁后的人胚嗅粘膜嗅鞘细胞交替应用含10％胎牛血清和含2．5％胎牛血清、NT3的DMEM—F12培养基进行原代培养。观察嗅粘膜嗅鞘细胞的形态学变化．采用p75^NTR和GFAP免疫细胞化学染色进行鉴定和纯度检测。结果人胚嗅粘膜嗅鞘细胞形态多呈双极、三极，伴有细长的突起。p75^NTR和GFAP染色均呈阳性反应，体外培养9d时纯度可达83％。结论差速贴壁法结合低浓度血清和NT3应用可以分离培养出人胚嗅粘膜嗅鞘细胞。     

人胚嗅粘膜嗅鞘细胞的分离、培养和纯化

目的 采用经我们改良的差速贴壁法结合神经营养因子3(NT3)和低浓度血清的培养方法对人胚嗅粘膜嗅鞘细胞进行分离和原代纯化培养,探讨建立嗅粘膜嗅鞘细胞体外培养的方法.方法 对差速贴壁后的人胚嗅粘膜嗅鞘细胞交替应用含10%胎牛血清和含2.5%胎牛血清、NT3的DMEM-F12培养基进行原代培养.观察嗅粘膜嗅鞘细胞的形态学变化.采用p75NTR和GFAP免疫细胞化学染色进行鉴定和纯度检测.结果 人胚嗅粘膜嗅鞘细胞形态多呈双极、三极,伴有细长的突起.p75NTR和GFAP染色均呈阳性反应,体外培养9 d时纯度可达83%.结论 差速贴壁法结合低浓度血清和NT3应用可以分离培养出人胚嗅粘膜嗅鞘细胞.     

不同分离纯化法建立人早孕滋养细胞模型的效果比较

目的：对4种建立滋养细胞的方法进行比较,以期寻求一种简便高效的人早孕滋养细胞的体外培养方法,为相关研究提供基础。方法早孕绒毛通过胰酶联合胶原酶消化分离后,分别采用直接接种、差速贴壁联合差速消化法、人外周血淋巴细胞分离液分离纯化法、完整绒毛消化联合简化的 percoll 密度梯度分离法4种方法纯化培养,倒置显微镜观察细胞形态,应用 HE 染色、免疫组化和免疫细胞化学法检测细胞纯度。结果直接接种、差速贴壁联合差速消化法、人外周血淋巴细胞分离液分离纯化法得到的细胞细胞角蛋白7（CK －7）表达阳性率不足60％;简化的 percoll 密度梯度分离法得到的细胞 CK －7表达阳性率达90％以上。结论完整绒毛消化联合简化的 percoll 密度梯度分离纯化可以得到大量较高纯度的滋养细胞以供后期实验。     

不同纯化方法体外培养人胚嗅球嗅鞘细胞

目的 采用不同纯化方法原代培养人胚嗅球嗅鞘细胞(OECs),探讨简单实用可获得高纯度人胚嗅球OECs的体外培养方法.方法 以差速贴壁法为基础结合阿糖胞苷法、无血清饥饿法和问断神经营养因子3(NT3)法纯化培养人胚嗅球OECs.观察不同纯化方法下OECs生长变化,采用免疫细胞化学染色进行纯度鉴定.结果 体外培养的人胚嗅球OECs为双极、三极细胞.细胞突起细长,并可形成细胞突起网络.差速贴壁法培养3～6 d时纯度约为88%,以后成纤维细胞增殖,OECs纯度迅速下降.无血清饥饿法培养3～6 d时OECs纯度约为90%,但细胞状态差.间断NT3法培养3～9 d时OECs纯度约为95%,且细胞状态良好.经统计学处理,第6 d后差速贴壁 间断应用NT2法优于其他方法,细胞纯度的差异有统计学意义(P<0.05).结论 差速贴壁结合同断NT3法可获得高纯度状态良好的OECs,是一种简单实用的OECs纯化培养方法 .     

SD大鼠脑皮层星形胶质细胞的原代培养及纯化方法改良

目的:探讨大鼠大脑皮层星形胶质细胞的培养方法,以获得纯度高的细胞进一步对其进行体外实验研究。方法:在Mc-Carthy方法基础上改用出生后1d的SD大鼠的大脑皮层,结合机械分离和胰酶消化后制备单细胞悬液接种,差速贴壁1h,培养14d以后上摇床以去除混杂细胞,细胞融合后传代,每次传代前都经历胰酶冲洗和差速贴壁,传3代后利用GFAP-FITC免疫荧光法对所获细胞进行鉴定。结果:经过原代传代及纯化,大脑皮层星形胶质细胞体外培养成功,并有较高的纯度。GFAP-FITC免疫荧光染色阳性。结论:经过合理取材、改良纯化方法后,可以更为简便得到纯度很高的星形胶质细胞。     

成年大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞的分离、培养、鉴定与纯化

目的:探讨嗅黏膜中嗅鞘细胞的培养方法.方法:取成年大鼠嗅黏膜,采用差速贴壁法获得较高纯度的嗅鞘细胞,并采用免疫荧光法进行鉴定与形态学观察.结果:通过差速贴壁法纯化,可获得纯度约为80%的嗅鞘细胞,并通过GFAP免疫荧光及P75和hoechst双重免疫荧光鉴定;相差显微镜下细胞形态以梭形、双极及三极细胞为主,有少量的多极细胞.结论:从成年大鼠嗅黏膜中成功分离培养出嗅鞘细胞,为从人鼻腔嗅黏膜中培养嗅鞘细胞提供重要的依据.     

OECs无血清上清液体外诱导UB-MSCs向神经细胞分化

目的:观察大鼠嗅鞘细胞无血清上清液诱导脐血间充质干细胞向神经细胞分化的作用。方法:采用差速贴壁联合阿糖胞苷抑制法获得较高纯度的嗅鞘细胞,在最佳状态细胞无血清培养后取上清液。收集正常足月剖腹产胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,采用差速贴壁法纯化间充质干细胞,传第三代后用上述收集的嗅鞘细胞无血清上清液诱导,观察诱导分化过程,免疫组化鉴定分化结果。结果:用差速贴壁和阿糖胞苷抑制法可获得纯度高达95%的嗅鞘细胞,使用无血清嗅鞘细胞上清液培养脐血间充质干细胞后,发现能诱导脐血间充质干细胞向神经细胞形态分化,胞体呈椭圆形,伸出长突起。诱导7天后相差显微镜下可观察到神经干细胞、神经元和胶质细胞形态的细胞,与NSE、GFAP细胞免疫组化结果一致。结论:大鼠嗅鞘细胞无血清上清液有明显诱导脐血间充质干细胞分化为神经细胞的作用。     

嗅内衬细胞的培养

目的 :探索一种简单的培养纯化嗅内衬细胞的方法。方法 :取新生 2 0 d的大鼠嗅球表层 ,以阿糖胞苷和牛垂体提取液分别作用 ,应用差速贴壁分选方法纯化培养细胞 ,以P75NGFR抗体鉴定。结果 :取得了较高纯度的嗅内衬细胞。结论 :应用阿糖胞苷和牛垂体提取液 ,联合差速贴壁分选法是有效可行的获取高纯度嗅内衬细胞的方法。     

新生大鼠嗅鞘细胞的原代培养及形态学观察

目的探讨新生大鼠嗅鞘细胞的原代培养及纯化方法，并对其形态学特征进行观察。方法分离培养新生大鼠嗅球中的嗅鞘细胞，联合应用差速贴壁法和阿糖胞苷抑制法进行纯化，NGFRp^75免疫组化染色鉴定细胞。结果可获得较高纯度的嗅鞘细胞，其形态主要为双极、多极和无突起的“油煎蛋”形，细胞突起细长并交织成网状。结论该方法步骤简便，可重复性好，具有较高的实用价值。     

嗅鞘细胞移植治疗大鼠脑出血的实验研究

目的：嗅鞘细胞移植入大鼠脑出血模型后,观察偏瘫大鼠功能恢复以及移植细胞后30 d内的形态学变化。方法：差速贴壁法培养出高纯度的嗅鞘细胞,制作38只大鼠脑出血模型,分三组：第1组10只为空白组,第2组10只为HBSS移植组,第3组18只为嗅鞘细胞移植组;三组大鼠分别在术后3 d、7 d、14 d和30 d用forelimb placing方法进行评分,判断嗅鞘细胞移植治疗大鼠脑出血模型的作用。结果：hoechst示踪及电镜观察结果,均证实嗅鞘细胞能在大鼠体内存活;对三组大鼠进行评分,嗅鞘细胞移植组的功能恢复明显优于其他两组。结论：从成年大鼠嗅黏膜用差速贴壁法能成功培养出嗅鞘细胞,并用于细胞移植,移植细胞能存活;嗅鞘细胞移植能改善大鼠脑出血后偏瘫肢体的功能。     

嗅鞘细胞移植后脊髓挫伤大鼠几种神经营养因子的表达变化

目的探讨嗅鞘细胞移植脊髓挫伤大鼠后,在其神经损伤及修复过程中三种神经营养因子（脑源性神经营养因子、神经生长因子、睫状神经营养因子）的表达变化及意义。方法体外分离培养大鼠嗅球嗅鞘细胞。40只健康SD大鼠,雌雄不拘,在移植前一星期使用NYU-撞击机,利用10g-25mm的致伤力,制作T10脊髓挫伤模型。40只脊髓挫伤大鼠随机分为OECs移植组和对照组（注射无血清培养液组）,又根据取材时间不同分为术后1天、7天、14天、21天组。动物处死前进行BBB评分评估后肢运动功能的变化。取手术部位头端和尾端0.5cm脊髓,采用免疫组织细胞化学染色检测技术检测三种神经营养因子（BDNF、CNTF、NGF）在各组脊髓中的表达变化。结果行为学评分随着损伤时间的推移呈小幅度增加,但后肢无运动功能恢复;免疫组织化学检测显示,嗅鞘细胞移植能部分改善大鼠脊髓灰质神经细胞的凋亡程度,延缓白质神经纤维的减少,促进髓鞘的修复与再生。与对照组比较,嗅鞘细胞移植治疗后脊髓组织中三种神经营养因子表达明显增加（P〈0.05）。结论嗅鞘移植能够部分改善脊髓损伤后脊髓组织的病理形态,促进脊髓组织中多种神经营养因子的表达。     

嗅鞘细胞移植促进脑损伤大鼠神经功能恢复及其作用机制研究

目的 观察嗅鞘细胞移植对脑损伤大鼠神经功能恢复及神经元存活的影响并探讨其作用机制.方法 对经培养纯化的嗅鞘细胞作NGFRp75免疫细胞化学染色鉴定并制备移植用细胞悬液,部分细胞预作荧光标记用于移植后观察存活情况;24只SD大鼠平均分成3组:假手术无损伤组(A组),大鼠脑皮质运动区损伤组(B组),相同脑损伤后嗅鞘细胞移植组(C组);术后当天及第3,7,14天分别对各组动物进行神经功能缺损严重程度(NSS)评分;术后第14天取损伤部位组织作神经元核心抗原免疫组化(NeuN)检测并计数阳性细胞数量;数据采用SPSS17.0软件进行统计学分析.结果 (1)培养的嗅鞘细胞呈NGFRp75阳性,阳性率90%;(2)移植14d后核荧光标记的嗅鞘细胞在宿主体内存活良好;(3)术后第14天B组NSS评分为[(2.00±0.53)分],C组为[(1.25±0.46)分],明显优于B组(P<0.05);(4)NeuN阳性细胞计数B组为[(39.2±7.1)分],C组为[(45.8±6.0)分],明显优于B组(P<0.05).结论 嗅鞘细胞移植可明显促进脑损伤大鼠神经功能恢复,其机制可能与嗅鞘细胞促进宿主神经元存活有关.     

嗅鞘细胞培养上清胶质源性神经生长因子含量的测定

目的观察嗅鞘细胞培养上清胶质源性神经生长因子(GDNF)的含量随培养时间的变化关系，为选择嗅鞘细胞移植的最佳时间提供理论依据。方法采用差速贴壁纯化培养方法培养嗅球及嗅粘膜嗅鞘细胞，培养21天，3天留取标本一次，采用ELISA法对上清GDNF进行测定。结果GDNF的含量随培养时间的延长逐渐升高，但绝对含量很低。结论培养的嗅鞘细胞能分泌GDNF，细胞移植在14天以后为宜。     

内毒素对原代大鼠肝星状细胞表达结缔组织生长因子影响机制的研究

目的研究内毒素（LPS）与其刺激的Kupffer细胞（KCs）培养上清（KCCM）及NF—κB通路抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）对大鼠原代肝星状细胞（HSCs）表达结缔组织生长因子（CTGF）的影响,探讨LPS刺激HSCs表达CTGF的机制。方法分离培养原代大鼠HSCs、KCs。培养72h的KCs经1mg／LLPS刺激48h后收集上清标记为KCCM1。未经LPS刺激的上清标记为KCCM0。将培养72h的HSCs随机分为空白对照组、KC—CM0组、LPS组、KCCM1组、PDTC组、（PDTC＋LPS）组、（PDTC＋KCCM1）组。各组HSCs经相应的处理48h后,Westernblot检测各组HSCs表达CTGF水平,ELISA检测培养上清中I型胶原含量。结果各组HSCs中CTGF蛋白表达水平为：空白对照组（1．95-±0．67）、KCCM0组（2．15±1．10）、LPS组（4．56±4．16）、KCCM1组（5．21±3．23）、PDTC组（0．06±0．02）、（PDTC＋LPS）组（0．10±0．08）、（PDTC＋KCCM1）组（2．77±4．08）。LPS与KCCM1作用于HSCs后CTGF表达增加（P〈0．05）;PDTC几乎可以完全阻断正常及LPS刺激的HSCs表达CTGF（P〈0．01）,但只能降低KCCM1组CTGF的表达（P〈0．05）：KCCM1组HSCs上清中I型胶原的含量增加（P〈0．05）。结论LPS可直接通过HSCs内的NF—κB通路使其表达CTGF水平上调,LPS刺激的KCs还可能通过其他途经使HSCs表达CTGF水平上调。     

羟乙基淀粉130／0．4对颈髓损伤患者凝血功能的影响

目的评价6％羟乙基淀粉130／0．4对颈髓损伤嗅鞘细胞移植患者凝血功能的影响。方法择期行嗅鞘细胞移植颈髓损伤患者40例,年龄18～49岁,体重49～88kg,ASIAⅡ或Ⅲ级,随机分为羟乙基淀粉130／0．4组（实验组）和复方氯化钠组（对照组）,每组20例。麻醉诱导气管插管后吸入安氟醚维持麻醉。两组分别于气管插管后以10～15ml·kg^-1·h^-1的速率经上肢静脉输注6％羟乙基淀粉130／0．4、复方氯化钠25ml／kg。分别于输注前、输注完毕30min、4h时肘静脉抽血样,测定血红蛋白浓度（Hb）、血小板计数（Plt）、凝血酶原时间（PT）、激活部分凝血酶原时间（APTT）、纤维蛋白原浓度（Fib）。结果两组输注完30min、4h时Hb与Plt较输注前明显降低（P〈0．01）;两组输注前后PT、APTT、Fib差异无统计学意义（P〉0.05）。结论术中输注6％羟乙基淀粉130／0．4对颈髓损伤嗅鞘细胞移植患者凝血功能无明显影响。     

转hLIF基因逆转录病毒载体饲养层细胞的建立及其对脐血CD34＋造血干/祖细胞的扩增作用

目的建立转人白血病抑制因子（hLIF）基因逆转录病毒载体的饲养层细胞,并观察其对CD34＋造血干/祖细胞（HSPC）的扩增作用。方法建立转hLIF基因逆转录病毒载体的饲养层细胞,并用RT-PCR法和ELISA法鉴定目的基因的表达;采用免疫磁珠法分离脐带血CD34＋HSPC,流式细胞术检测其纯度;将CD34＋HSPC与饲养层细胞共培养,流式细胞术检测各组增殖效果。结果建立的转基因饲养层细胞均有绿色荧光,RT-PCR法和ELISA法证实均有目的基因表达,免疫磁珠法分离的CD34＋HSPC纯度可达（95.6±2.58）%,与饲养层细胞共培养后CD34＋HSPC可扩增8.74倍,表面黏附分子CXCR4和CD54表达量仍较高。结论建立的转hLIF基因饲养层细胞对CD34＋HSPC有一定的扩增作用,且延缓其分化。     

酶联合消化法分离犬心房肌成纤维细胞及其生物学特性的研究

目的探讨适用于犬心房肌成纤维细胞(CAF)体外分离培养及鉴定的技术方法。方法无菌手术取犬左心耳,应用木瓜蛋白酶、Ⅰ型胶原酶联合消化法分离心房肌成纤维细胞并进行体外培养。在倒置显微镜下观察原代心房肌成纤维细胞生长特点;苏木精-伊红(HE)染色观察细胞形态,并对细胞进行纤维连接蛋白、波形蛋白、盘状结构域受体2蛋白免疫荧光染色;通过绘制生长曲线法、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2-四唑单钠盐(WST-8)法观察细胞的增殖情况;流式细胞仪分析比较各代细胞DNA周期特点;观察不同培养体系对第3代(P3)CAF生长的影响。结果酶联合消化法分离培养的细胞1 d后,可见细胞贴壁呈长椭圆形生长,3 d后生长迅速呈长梭形,7 d后细胞排列成单层,连接紧密;HE染色显示细胞长梭形呈螺旋状排列;免疫荧光检测纤连蛋白、波形蛋白、盘状结构域受体2表达阳性;P1、P2、P3细胞生长曲线近似"S"形,WST-8法显示P1、P2、P3细胞生长于第3天至第5天光密度值变化较明显,增殖迅速;P1、P2、P3G0/G1的百分率分别为(56.83±1.72)%、(68.10±1.33)%、(68.23±1.33)%,各代之间G0/G1的百分率比较差异无统计学意义(P>0.05);P1、P2、P3(S+G2)/M的百分率分别为(43.17±1.72)%、(31.90±1.33)%、(31.77±1.33)%,各代之间(S+G2)/M的百分率比较差异无统计学意义(P>0.05);杜尔伯克改良伊格尔/F12培养基培养的P3细胞增殖力明显高于RPMI-1640培养基培养的细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。结论酶联合消化法可以高效快速分离和稳定培养CAF,为研究犬心房纤维化提供了充足的种子细胞。     

嗅鞘细胞对活化的星形胶质细胞的作用

目的:研究体外培养的大鼠嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cell,OEC)对活化的星形胶质细胞(astrocytes,AST)的作用.方法:体外培养嗅鞘细胞和星形胶质细胞.星形胶质细胞经纯化传代,细胞融合后利用划伤法得到活化的星形胶质细胞,将嗅鞘细胞与活化的星形胶质细胞共培养24 h后,观察星形胶质细胞增殖能力的改变,以及其表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)的变化.结果:活化的星形胶质细胞与嗅鞘细胞共培养后,MTT实验表明其增殖能力增强;免疫荧光染色、RT-PCR和蛋白质印迹法测定结果表明共培养后活化的星形胶质细胞表达的GFAP和CSPG降低.结论:嗅鞘细胞作用于活化后的星形胶质细胞以后,能够促进星形胶质细胞的分裂增殖,同时能够减少星形胶质细胞胶质化,降低抑制性细胞因子的表达.     

CIK与树突细胞联合对肾癌细胞的杀伤研究

目的研究细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）和树突状细胞（Dc）共同培养后CIK细胞的增殖活性、表型变化及对肾癌细胞株769一P的杀伤作用。方法采集健康人的外周血单个核细胞（PBMC）,置37℃、5％C02培养箱2h,收集非粘附细胞诱导分化成CIK,粘附细胞诱导为DC,在培养7d后DC与CIK按1：40的比例混合培养,分别在3d、6d收集细胞同时以单纯CIK细胞为对照,运用LDH释放法检测对769一P细胞的杀伤活性。结果Dc—CIK共同培养后增殖速度明显快于单纯的CIK细胞,培养第10天时单纯CIK的CD3CD8、CD;cD未双阳性率分别为（50．4±1．8）％、（20．1±5．2）％,共培养3dDC—CIK的CD;CD8＋、CD36＋未的阳性率分别为（67．2±5．2）％、（37．9±4．1）％,6dDC-CIK的CD3＋CD8、CD3CD56的阳性率分别为（75．2±3．1）％、（48．3±2．9）％,表达差异具有统计学意义（P〈0．05）。在1：5—1：40靶效比范围内DC—CIK对肾癌细胞的杀伤活性高于单纯CIK细胞,且随效靶比增强杀伤活性增强（P〈0．05）。结论DC—CIK的增殖活性和细胞毒活性均高于单纯CIK细胞。