结核分枝杆菌动物建模试验中ABSL-3实验室内生物安全评估

目的通过在动物生物安全三级(ABSL-3)实验室内对结核分枝杆菌(MTB)动物建模过程采样监测,为实验室生物安全评估提供依据。方法在经中国合格评定国家认可委员会(CNAS)认可并由卫生部批准的,可从事MTB等高致病性病原微生物实验动物研究工作的ABSL-3实验室内实施MTB动物建模,在实验过程中进行空气和物体表面采样。用快速分子诊断和常规病原学方法对样本进行特异性检测分析。结果生物安全三级(BSL-3)实验室使用后的清场工作可以大大减少实验室环境的细菌量,BSL-3实验室在日常使用中也会存在少量的环境微生物,由于负压强度和使用频率的差异,核心区的环境洁净度明显高于准备间。70%乙醇喷洒消毒及擦拭可以使准备间物体表面的细菌量检出率从59.26%下降到9.38%;核心区物体表面的环境细菌检出率从6.59%下降到1.52%,核心区MTB检出率从10.99%下降到0。在ABSL-3实验室和生物安全柜双重负压环境下,可避免空气中MTB气溶胶污染。结论 ABSL-3实验室的负压环境和正确的防护及消毒措施对实验室操作人员的生物安全有重要的防护作用。     

HIV合并嗜血分枝杆菌感染1例

目的探讨艾滋病合并嗜血分枝杆菌感染的临床特征,该病原体感染患者临床实验室检查项目以及诊断和治疗。方法嗜血分枝杆菌为非结核分枝杆菌(nontuberculous Mycobacteria,NTM)中的一种慢性生长菌。本文对一例罕见的HIV合并嗜血分枝杆菌感染病例进行分析。结果一例艾滋病女性患者,表现为长期低热、干咳气促、消瘦和皮下结节,两肺广泛炎症。标本血培养鉴定为NTM感染。后因准备开展药敏试验尝试菌株中性罗氏培养基传代培养,转种多次,始终无法生长。后经血培养,分离株全基因组测序证实为嗜血分枝杆菌。后续临床采取针对该病原体药物治疗方案,随访病人病情稳定。结论嗜血分枝杆菌为较罕见菌种,且无法在普通中性罗氏培养基和液体培养基中生长,诊断需要依据血培养以及全基因组测序,需要临床诊疗中进行关注。     

微量液体培养基最低抑菌浓度法与罗氏比例法在结核分枝杆菌药敏试验中的价值比较

目的比较微量液体培养基最低抑菌浓度(MIC)法与罗氏比例法在结核分枝杆菌药敏试验中的临床价值。方法以100株结核分枝杆菌菌株(由辽宁省结核实验室提供)为研究样本,分别采用罗氏比例法与微量液体培养基MIC法检测结核分枝杆菌的药物敏感性。结果微量液体培养基MIC法与罗氏比例法检测结核分枝杆菌对乙胺丁醇、二卡那霉素、利福平、异烟肼、氧氟沙星、卷曲霉素药物的敏感性比较,差异无统计学意义(P 0.05)。结论微量液体培养基MIC法应用于结核分枝杆菌药敏试验中与罗氏比例法有着良好的一致性,且检测速度快,经济适用性好,能够为临床指导结核病用药提供帮助。     

应用MPT64检测建立结核分枝杆菌药敏新方法的初步探索

目的初步探索应用MPT64检测建立一种结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）药敏新方法的可行性,确定药敏方法的实验条件和实验程序。方法通过检测MTB标准株和临床株的MPT64分泌,验证MPT64检测用于药敏结果指示的有效性;对不同方式制备的菌悬液进行MPT64检测,确定药敏方法的接种程序。结果指示有效性试验中,MTB标准株和60株MTB临床株的菌悬液MPT64检测均阳性;药敏接种程序确定试验中,直接挑取菌落方式配制的各种浓度MTB菌悬液（分别为1、0.1、0.01和0.001 mg/ml）MPT64检测均阳性,而生理盐水洗涤方式配制的各种浓度MTB菌悬液（分别为1、0.1、0.01和0.001mg/ml）MPT64检测均阴性。结论 MPT64检测能有效指示MTB的生长;洗涤方式制备菌悬液可避免MTB原代菌株产生的MPT64被带入培养基中,从而能够更真实地反映无药和含药培养基中MTB的生长情况。     

显微镜观察药物敏感性试验在结核性淋巴结炎中的应用评价

摘要：目的：探讨显微镜观察药物敏感性试验（MODS）用于结核性淋巴结炎的诊断价值及直接进行结核分枝杆菌（MTB）耐药性检测的可能性。 方法：对94例细针针吸细胞学（FNAC）诊断为结核性淋巴结炎患者,用MODS法、抗酸染色和改良罗氏培养基培养（以下简称罗氏法）对穿刺吸出物进行MTB检测;抗酸染色阳性标本同时用MODS法和绝对浓度法检测药敏,对两法检测结果不符的菌株进行最低抑菌浓度（MIC）测定。 结果：MODS法、罗氏法和抗酸染色法检测结核性淋巴结炎的阳性率分别为51.1%、39.4%和22.3%,MODS法阳性率均显著高于罗氏法和抗酸染色法（χ² =7.69与25.04,P均＜0.01）。MODS法和罗氏法检测结果的符合率为86.2%。MODS检测时间中位数为13 d,明显短于罗氏培养法的29 d。MODS检测21株MTB对利福平、异烟肼、乙胺丁醇和链霉素药敏结果与罗氏药敏结果符合率分别为95.0%、85.7%、85.7%、100%。7个MODS药敏结果与罗氏药敏检测结果不符,经MIC检测5个药敏结果支持MODS法结果。 结论：MODS技术对结核性淋巴结炎诊断和MTB药敏试验检测有较高的敏感性和准确性,在结核病防控中有较好的应用价值。     

痰标本中结核分枝杆菌培养及药敏检测结果分析

目的 探讨结核分枝杆菌在变色液体培养基中快速培养及药敏试验可靠性.方法 分别采用新型变色液体培养基和改良罗氏培养基对198例痰标本进行分枝杆菌培养及药敏试验,对比分析试验结果.结果 变色液体培养基及改良罗氏培养基检出阳性率分别是37.9%和37.4%.变色液体培养基试验结果平均时间为28 d,耐药率分别为链霉素8.00%、异烟肿5.33%、利福平4.00%和乙胺丁醇4.00%;改良罗氏培养基试验结果平均时间为62天,耐药率分别为链霉素8.11%、异烟肿5.41%、利福平4.05%和乙胺丁醇4.05%;两者结果差异无统计学意义(P＞0.05).多重耐药结果分别为5.33%和5.41%.结论 变色液体培养基是一种适合在基层实验室推广应用的结核分枝杆菌辅助诊断方法,具有快速、简单、灵敏度高的优点.     

致导管相关性血流感染的长孢洛德酵母菌及生物学特性分析

分析临床1例脑梗死患者体温达38.4 ℃时外周静脉血及导管血检出的长孢洛德酵母菌的生物学特性,观察科玛嘉念珠菌显色平板的菌落形态和醋酸钠培养基上子囊孢子的产生情况,利用Vitek 2 compact、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）、测序分析分别进行鉴定,并进行药敏试验研究,以提高实验室对...     

医院环境中分枝杆菌污染检测方法研究

目的筛选医院呼吸科环境中分枝杆菌污染检测的适宜方法,为防控分枝杆菌医院感染提供参考依据。方法采用平板沉降法和微生物采样方法对江苏省某医院呼吸科环境空气和物体表面以及医疗器械进行采样监测与细菌分离鉴定。结果用平板沉降法和采样器以及气溶胶法共计采集空气样本52份,通过细菌分离培养法均未检出分枝杆菌。用棉拭子涂抹法采集气空调滤网、物体表面和支气管镜等样本共计16份,细菌分离培养也未检出分枝杆菌。气溶胶法采集的空气样本和空调滤网样本,采用线性探针基因杂交技术检测,分枝杆菌基因检出率达50.0%。结论采用常规微生物采样和细菌培养检测方法,在医院呼吸科空气、物体表面和支气管镜等样本中均未检出分枝杆菌,用线性探针基因杂交技术在空气和空调滤网上检出分枝杆菌基因。     

结核分枝杆菌快速微量直视培养药敏试验方法的研究

目的建立一种经济、适用、快速的微量结核分枝杆菌（MTB）直视培养药敏方法。方法研制电脑控制无级连续超倍放大、微量培养和图像采集组成的MTB快速培养药敏及鉴定系统;用该系统进行MTB标准菌株H37Rv及临床分离菌株药敏试验;以改良罗氏法（L—J法）为对照,确定药敏试验药物最适浓度。结果本法药敏试验的药物：硫酸链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、硫酸阿米卡星、硫酸卷曲霉素、盐酸左氧氟沙星及对氨基水杨酸异烟肼应用浓度分别为：1、0．1、1、5、5、10、4、1μg／ml;检出时间H37Rv为3d;临床分离菌165株平均5．6d。每实验孔仅需培养基100μl。结论快速法显著缩短了MTB药敏试验时间,节省试剂,操作简便,适合基层单位应用。     

结核分枝杆菌对氧氟沙星的耐受程度与gyrA基因突变的相关性分析

目的以氧氟沙星为例,探讨阈值的划分对实验室早期检测出耐氧氟沙星结核分枝杆菌的影响。结合DNA序列分析探讨gyrA基因点突变与结核分枝杆菌对氧氟沙星耐受程度的相关性。方法 （1）在含氧氟沙星改良罗氏培养基上检测101株结核分枝杆菌临床分离株对氧氟沙星的敏感性。（2）测序以检测耐氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因点突变的特征。结果 （1）52株耐氧氟沙星5.0μg/ml的临床分离株中,17株能在含氧氟沙星10.0μg/ml的改良罗氏培养基上生长（约占32.69%）,49株对氧氟沙星5.0μg/ml敏感的临床分离株中,有2株能在含氧氟沙星2.0μg/ml的改良罗氏培养基上生长（约占4.08%）。（2）基因扩增产物测序发现;耐氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因点突变主要发生第90、91和94位点上,有10株在不同的gyrA基因位点上发生了碱基缺失或插入的变异,101株被检测的结核分枝杆菌临床分离株中,发生在第95位点的碱基突变率为100%。结论 （1）判定耐药结核分枝杆菌上、下限的阈值对耐药结核菌的早期检出具有重要的作用。（2）发生在耐氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因上的点突变是多变的,但与结核分枝杆菌对氧氟沙星的耐受程度没有明显的相关性。     

深圳市医疗卫生机构实验室生物安全现况调查

目的了解深圳市医疗卫生机构实验室生物安全现状,为实验室生物安全建设提供参考。方法采用问卷调查方式,对该区25家各类医疗卫生机构实验室生物安全情况进行了调查。结果该区13所公立医院和1所疾病预防控制中心拥有生物实验室25间,均为BSL-2实验室;11所民营医院共有BSL-2生物实验室3间,其他均没有BSL-2实验室。实验室工作人员不同职称人员比例适当,配置合理;实验室使用频率均较高。BSL-2实验室软硬件建设较好,非BSL-2实验室相对较差。结论深圳市医疗卫生机构生物安全实验室的生物安全情况总体较好,但民营医疗机构需完善和加强生物安全建设与管理。     

通过增加痰液量和超声裂菌提高结核分枝杆菌荧光定量PCR检出率

目的通过增加痰液量和超声破碎法提取痰液中的结核菌DNA,提高结核分枝杆菌实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)的检出率。方法选择206例肺结核患者,以103例非结核患者作为对照组;肺结核患者同时进行结核菌涂片,并在美国BD公司的MAGIT960仪器上进行液体快速培养结核菌。另收集至少5 mL的痰液,加入2~3倍体积的4%氢氧化钠液化后,取1 mL按照采用常规方法抽提痰液中的结核菌DNA,剩余部分采用改进的超声破碎法提取结核菌DNA;两者同时进行实时荧光定量PCR检测。结果采用增量超声法,对于涂片阳性、培养阳性的结核患者,阳性检出率由87.5%(可信区间为81.4%~93.6%)提升至95.5%(可信区间为91.7%~99.4%)(P0.05)。对于涂片阴性、培养阳性的患者,阳性检出率由57.4%(可信区间为47.5%~67.4%)提高至83%(可信区间为75.4%~90.6%)(P0.01)。增量超声法比常规方法,定量值平均提高14倍以上。结论通过增加痰液量和超声破碎法提取痰液中的结核菌DNA,可提高实时荧光定量PCR结核分枝杆菌的检出率,值得进一步推广应用。     

Toll样受体2在分枝杆菌诱导巨噬细胞凋亡中的作用

目的建立分枝杆菌感染巨噬细胞的模型,探讨Toll样受体2(TLR2)在分枝杆菌诱导巨噬细胞凋亡中的作用。方法使用豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)诱导U937细胞分化使之具有吞噬能力,分别用胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、结核分枝杆菌(MTB)、脓肿分枝杆菌(M.abscessus)感染已分化的U937细胞,于感染后0、4、8、24、48和72h提取细胞,用流式细胞仪检测u937细胞凋亡率及细胞膜TLR2的表达,Western blot检测U937细胞感染后72 h时细胞内总TLR2的含量,并观察阻断TLR2后U937细胞感染分枝杆菌后的凋亡变化。结果 M.intracellulare M.abscessus感染U937细胞后的细胞凋亡率随时间的推移逐渐升高,4h后凋亡率已显著高于正常对照组,而MTB感染后的细胞凋亡率也有升高但与正常对照组差异无统计学意义;3种分枝杆菌感染U937细胞后的细胞凋亡率差异有统计学意义(P<0.05),由高到低的排列依次为M.abscessus、M.intracellulare和MTB。U937细胞的TLR2表达量在分枝杆菌感染后4 h内迅速升高,8 h后TLR2的含量稳定下来,不同分枝杆菌感染U937细胞后TLR2的表达并不相同(P<0.05),由高到低的排列依次为MTB、M.intracellulare和M.abscessus。阻断U937细胞的TLR2可以明显降低感染分枝杆菌后细胞的凋亡率。结论 TLR2并不直接引起巨噬细胞的凋亡,但TLR2在分枝杆菌诱导巨噬细胞凋亡中有重要作用。     

Preferential infection and depletion of Mycobacterium tuberculosis-specific CD4 T cells after HIV-1 infection

HIV-1 infection results in the progressive loss of CD4 T cells. In this study, we address how different pathogen-specific CD4 T cells are affected by HIV infection and the cellular parameters involved. We found striking differences in the depletion rates between CD4 T cells to two common opportunistic pathogens, cytomegalovirus (CMV) and Mycobacterium tuberculosis (MTB). CMV-specific CD4 T cells persisted after HIV infection, whereas MTB-specific CD4 T cells were depleted rapidly. CMV-specific CD4 T cells expressed a mature phenotype and produced very little IL-2, but large amounts of MIP-1β. In contrast, MTB-specific CD4 T cells were less mature, and most produced IL-2 but not MIP-1β. Staphylococcal enterotoxin B-stimulated IL-2-producing cells were more susceptible to HIV infection in vitro than MIP-1β-producing cells. Moreover, IL-2 production was associated with expression of CD25, and neutralization of IL-2 completely abrogated productive HIV infection in vitro. HIV DNA was found to be most abundant in IL-2-producing cells, and least abundant in MIP-1β-producing MTB-specific CD4 T cells from HIV-infected subjects with active tuberculosis. These data support the hypothesis that differences in function affect the susceptibility of pathogen-specific CD4 T cells to HIV infection and depletion in vivo, providing a potential mechanism to explain the rapid loss of MTB-specific CD4 T cells after HIV infection.     

Evaluation of the BACTEC MGIT 960 in comparison with BACTEC 460 TB for detection and recovery of mycobacteria from clinical specimens

The BACTEC MGIT system (M960), a fully automated, non radiometric instrument, designed for rapid detection of acid fast bacilli (AFB) from clinical specimens, was compared with the radiometric BACTEC 460 system (B460) and L?wenstein-Jensen (L-J) solid medium. A total of 1,093 respiratory and extrapulmonary specimens were decontaminated by the NALC-NaOH standard method, and randomly inoculated into the media. A total of 122 mycobacteria were recovered, including 47 Mycobacterium tuberculosis complex (MTB) isolates and 75 nontuberculous mycobacteria (NTM) isolates. Overall recovery rates were 59% for M960 system (p < 0.0001), 58.2% for L-J. medium (p < 0.0001) and 82% for Bactec 460 system, whereas rates for MTB alone were 91.5, 76.6 (p = 0.007), and 95.7%, respectively. The combination of M960 or B460 systems with L-J medium showed the same recovery rates for MTB strains (97.9%), whereas NTM rates were 68% (p < 0.0001) and 93.3%, respectively. Mean time to detection of smear-positive MTB, smear-negative MTB, and NTM were 12.2, 13.4, and 23.3 days, respectively, with the M960, 11.7, 21.3, and 24.8 days with the B460 and 20.4, 28.7, and 28.4 days with L-J medium. The M960 system showed a contamination rate of 9.8%, while B460 and L-J medium showed contamination rates of 4.3 and 3.8% respectively. In conclusion, the M960 system appeared to be accurate and rapid for the recovery of MTB, but reduced recovery of NTM and a high number of contaminated cultures deserve further study in order to assess if this system can represent a valuable alternative to the radiometric system.     

FQ-PCR检测肠黏膜结核杆菌DNA对肠结核的诊断价值

目的建立一种实时定量检测结核分枝杆菌（MTB）插入序列IS6110 DNA的方法,探讨其在肠结核（ITB）诊断中的价值。方法采用FQ-PCR技术对36例内镜活检ITB标本（30例石蜡、6例新鲜组织）、36例Crohn’s disease标本（16例石蜡手术标本,15例石蜡内镜活检标本,5例新鲜内镜活检组织）及34例阴性对照标本进行IS6110 DNA的实时定量检测,并比较上述标本抗酸染色结果。结果13例ITB抗酸染色阳性,CD无1例阳性,抗酸染色对ITB诊断的敏感性36.11%。MTBIS6110DNA检测结果：23例ITB（63.89%）阳性,6例CD（16.67%）阳性,另有1例阳性为升结肠腺癌癌旁正常组织。MTBIS6110 DNA在ITB与CD中的阳性率差异有统计学意义（P〈0.05）。FQ-PCR对ITB诊断的敏感性为63.89%,特异性83.33%。FQ-PCR敏感性显著高于抗酸染色（P〈0.05）。MTBIS6110 DNA阳性的ITB标本其定量结果范围为2.44×10^-4-2.26×10^1拷贝/细胞。结论FQ-PCR检测MTBIS6110 DNA是一种快速有效的ITB诊断方法,其定量范围广,检测灵敏度高。对活检组织少、病理改变不典型、抗酸染色阴性组织的诊断和鉴别诊断尤有意义。     

血培养联合PCR对HIV感染者和AIDS患者分枝杆菌血症诊断的分析

目的评价应用BACTEC Myco/F Lytic（MFL）培养基血培养联合聚合酶链反应（PCR）对人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者和获得性免疫缺陷综合征（AIDS）患者合并分枝杆菌（MB）感染诊断的效果。方法用MFL配合BACTEC 9120血培养仪对55例可疑合并MB感染的HIV/AIDS患者血标本进行培养,联合抗酸染色和PCR对阳性标本进行菌种鉴定。结果 55例患者血培养分析显示,MFL血培养的总报阳率为32.7%（18/55）,其中7例（12.7%）报阳标本经证实为MB生长,8例（14.5%）报阳标本中未检出任何微生物,暂定为假报警,3例（5.4%）检出污染菌。其中MB的平均培养周期为746.79 h,约31.1 d。7例MB培养阳性标本经PCR鉴定,5例（71.4%）为结核分枝杆菌（TB）,2例（28.6%）为鸟分枝杆菌复合体（MAC）。结论 MFL血培养能协助临床诊断MB血症,该法操作简单、安全性高,但培养周期较长,且存在假报警及某些需氧菌污染的情况,故宜联合其他检测手段对MB血症进行检测。     

手工判读MGIT法检测分枝杆菌的效果评价

目的 应用手工荧光判读仪对MGIT液体培养基进行快速检测分枝杆菌的效果评价.方法 收集2011年3月至2011年4月杭州市红十字会医院临床诊断为结核病的患者临床标本230份,其中涂片法抗酸染色阳性标本57份,阴性标本173份.分别对同份标本做L-J固体和MGIT液体培养法分离培养效果比较,结果统计学分析采用x2检验...     

结核分枝杆菌rdESAT-6抗原在耻垢分枝杆菌中的制备及其血清学诊断研究

目的构建结核分枝杆菌(MTB)融合基因2×esat-6原核表达载体,利用耻垢分枝杆菌诱导表达、纯化早期分泌抗原ESAT-6重组二聚体(rdESAT-6),Western blot分析其抗原性,并评估其在结核病患者中的血清学诊断价值。方法以DNA疫苗HG856A2为模板扩增2×esat-6基因,构建pMF41-2×esat-6原核表达载体,电转化耻垢分枝杆菌,诱导表达rdESAT-6蛋白,Western blot分析其抗原性。收集126例确诊的结核病患者和42名健康体检者的血清,用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和结核斑点金免疫渗滤试验(TB-DOT)检测血清结核抗体,评估rdESAT-6在结核血清学诊断中的价值。结果成功构建了pMF41-2×esat-6重组质粒,以包涵体形式表达了rdESAT-6蛋白,纯化的蛋白纯度在95%以上,可与小鼠抗ESAT-6血清发生特异性反应。126例结核病患者血清检测结果表明,rdESAT-6蛋白在MTB阳性组和阴性组患者血清学诊断的敏感性分别为79.75%(63/79)、61.70%(29/47),好于TB-DOT的62.03%(49/79)、44.68%(21/47)(P0.05)。2种方法对42名健康体检者血清诊断特异性均为95.24%(40/42)。结论 MTB的融合蛋白rdESAT-6用于结核病血清学检测具有较好的敏感性和特异性,可作为结核病血清学诊断的优选抗原。