siRNA干扰PDLIM1表达抑制胶质瘤细胞U87迁移与侵袭

目的 研究人PDZ和LIM域蛋白1(PDLIM1)特异性siRNA对人胶质母细胞瘤U87细胞系迁移、侵袭能力的影响,并对其相关机制进行初步探讨.方法 用小RNA干扰技术下调U87细胞PDLIM1,用荧光实时定量Real-time PCR技术验证siRNA干扰效率;采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力,采用Transwell实验检测细胞侵袭能力;用Western blot法检测细胞上皮间质转化(EMT)相关蛋白表达情况,并探讨相关机制.结果 经PD-LIM1-siRNA干扰后,胶质瘤U87细胞中PDLIM1在mRNA水平显著下调(P<0.001);与对照组相比,迁移和侵袭能力被显著抑制(P<0.001);PDLIM1基因表达下调后,U87细胞中EMT相关蛋白N-cadherin、β-catenin、Slug下调.结论 PDLIM1通过EMT相关转录因子Slug调节N-cadherin、β-catenin蛋白表达,是其调节胶质瘤U87细胞迁移及侵袭能力的可能机制之一.     

转录因子FOXC1促进胶质瘤细胞系U87的侵袭能力

目的：探讨转录因子FOXC1对人脑胶质瘤细胞系U87侵袭的促进作用。方法：qPCR、Western blot检测胶质瘤细胞系U87、U251及正常星型胶质细胞中FOXC1 mRNA和蛋白表达水平。将FOXC1-siRNA转染至U87细胞中,分别用qPCR、Western blot检测FOXC1-siRNA的转染效率。细胞划痕实验和Transwell实验检测U87细胞转染FOXC1-siRNA后对细胞侵袭能力的影响,利用 Western blot检测U87细胞上皮间质化相关通路蛋白（Snail1、β-catenin、Twist1）、标记蛋白（N-cadherin、Vimentin、E-cadherin）表达水平。结果：U87细胞下调FOXC1表达后侵袭能力明显减弱,上皮间质化相关通路蛋白（Snail1、β-catenin、Twist1）表达水平下降,上皮细胞标记蛋白表达水平E-cadherin表达水平升高、间质细胞标记蛋白N-cadherin、Vimentin表达水平降低。结论：转录因子FOXC1通过上皮间质化促进胶质瘤细胞的侵袭。     

DEPTOR蛋白对胶质瘤间叶细胞转化能力影响及机制的探讨

目的 探讨siRNA干扰降低DEPTOR蛋白表达对U87细胞侵袭能力的影响及其机制.方法采用Western blot方法 检测U87细胞中DEPTOR蛋白表达.应用siRNA干扰技术转染U87细胞株,并用Western blot法检测瞬时转染以后DEPTOR蛋白的表达.体外侵袭实验观察转染后侵袭能力的改变.DEPTOR蛋白降低后,用Western blot检测间叶细胞来源的T-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白和调节因子Snail、Twist1、Slug、Zeb1的表达.结果 转染DEPTOR质粒的U87细胞DEPTOR表达降低.DEPTOR表达降低的SiDEPTOR/U87细胞侵袭并穿透Matrigel膜基质的细胞数量为(42±0.789),明显比SCR/U87组(22±1.197)多,差异有统计学意义(P＜0.05);同时Western blot结果显示:T-cadherin降低,N-cadherin、Vimentin蛋白表达量升高,与间质转化相关的转录因子仅Twist1的表达升高,而转录因子Slug、Snail、Zeb1表达无明显改变.结论 应用siRNA干扰技术降低DEPTOR蛋白的表达使U87细胞侵袭转移能力增强,同时T-cadherin降低,N-cadherin、Vimentin蛋白和转录因子Twist1的表达量升高,提示DEPTOR蛋白表达降低可通过调节转录因子Twist1进一步影响U87细胞的侵袭.     

白藜芦醇对胶质瘤U87细胞上皮-间质转化的抑制作用

目的：探讨白藜芦醇（Res）对胶质瘤U87细胞上皮-间质转化（EMT）、迁移和侵袭能力的调控作用,阐明Res对胶质瘤细胞EMT的抑制作用。方法：将胶质瘤U87细胞分为对照组（不做处理）、EMT组（TGF-β1诱导EMT）和Res处理组（Res处理EMT）。应用Western blotting法检测各组细胞中间质标志物（N-钙黏蛋白、β-连环蛋白和波形蛋白）、诱导EMT的转录因子（Snail、Slug和Twist1）以及基质金属蛋白酶（MMP）-2和MMP-9的蛋白表达水平。划痕愈合实验检测细胞迁移能力,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力。结果：与对照组比较,EMT组胶质瘤U87细胞的间质标志物（N-钙黏蛋白、β-连环蛋白和波形蛋白）、诱导EMT的转录因子（Snail、Slug和Twist1）和MMP-2、MMP-9蛋白表达水平均明显升高（P<0.05）;与EMT组比较,Res处理组上述蛋白表达水平明显下调（P<0.05和P<0.01）;40 μmol·L^-1 Res处理组效果较20 μmol·L^-1 Res处理组更明显（P<0.05）。EMT组细胞迁移率和侵袭率明显高于对照组（P<0.01）,而Res处理组胶质瘤细胞迁移率和侵袭率明显低于EMT组（P<0.01）。结论：Res能抑制胶质瘤U87细胞EMT,降低细胞的迁移和侵袭能力。     

沉默ZEB1基因对胶质瘤U87细胞上皮-间质转化的影响

目的：探讨沉默锌指E盒结合同源框1（ZEB1）基因对胶质瘤U87细胞间质标志物表达和细胞迁移的作用,阐明ZEB1对胶质瘤细胞上皮-间质转化（EMT）的影响。方法：将构建的ZEB1短发夹RNA（shRNA）干扰质粒（shZEB1#1和shZEB1#2）和对照质粒（shCtrl）转染至胶质瘤U87细胞,Western blotting法检测干扰效果。将胶质瘤U87细胞分为对照组（转染shCtrl的胶质瘤U87细胞）、EMT组[转染shCtrl的胶质瘤U87细胞用转化生长因子β1（TGF-β1）诱导EMT]和ZEB1基因沉默组（转染shZEB1的胶质瘤U87细胞用TGF-β1诱导EMT）。Western blotting法检测各组细胞中间质标志物（N-钙黏蛋白和波形蛋白）及基质金属蛋白酶9（MMP-9）的蛋白表达水平,划痕愈合实验检测各组细胞的迁移率。结果： Western blotting法检测,转染shZEB1#1和shZEB1#2的胶质瘤U87细胞中ZEB1蛋白表达水平较转染shCtrl的细胞明显降低（P<0.05或P<0.01）,shZEB1#2对ZEB1表达的抑制效果更明显,表明ZEB1已稳定转染到U87细胞。与对照组比较,EMT组胶质瘤U87细胞中N-钙黏蛋白、波形蛋白和MMP-9蛋白表达水平均明显升高（P<0.05或P<0.01）;与EMT组比较,ZEB1基因沉默组N-钙黏蛋白、波形蛋白和MMP-9蛋白表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01）。EMT组细胞迁移率明显高于对照组（P<0.01）,而ZEB1基因沉默组细胞迁移率明显低于EMT组（P<0.01）。结论：沉默ZEB1基因表达可抑制胶质瘤U87细胞EMT,并降低细胞迁移能力,提示ZEB1可作为侵袭性胶质瘤治疗的重要靶标。     

上皮-间质转化胶质瘤细胞的干细胞样特性及白藜芦醇对其干细胞样特性的抑制作用

目的：探讨发生上皮-间质转化（EMT）的胶质瘤细胞的干细胞样特性,阐明白藜芦醇（Res）对其干细胞样特性的抑制作用。方法：采用TGF-β1诱导胶质瘤U87细胞发生EMT,倒置显微镜观察细胞的形态表现,Western blotting法检测细胞间质标志物N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）和诱导EMT的转录因子（Snail、Slug、Zeb1和Twist1）表达水平。确定胶质瘤细胞发生EMT后,实验分为对照组（U87细胞不做处理）、EMT组（TGF-β1诱导胶质瘤细胞发生EMT）和Res处理组（Res处理发生EMT的U87细胞）,检测各组胶质瘤U87细胞二代胶质球形成数和细胞中干细胞标志物（Bmi1和Sox2）表达水平。结果：经TGF-β1处理48 h的胶质瘤U87细胞表现出分散、拉长和类似成纤维细胞的外观。与对照组比较,不同浓度TGF-β1组胶质瘤细胞中N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、Zeb1和Twist1表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01）,表明胶质瘤U87细胞发生EMT改变。与对照组比较,EMT组胶质瘤U87细胞二代胶质球形成数明显增多（P<0.01）,胶质瘤细胞中干细胞标志物Bmi1和Sox2表达水平升高（P<0.05或P<0.01）。与EMT组比较,Res处理组胶质瘤U87细胞二代胶质球形成数明显减少（P<0.01）,胶质瘤细胞中干细胞标志物Bmi1和Sox2表达水平明显降低（P<0.01）。结论：发生EMT的胶质瘤U87细胞呈现干细胞样特性,Res能抑制其干细胞样特性。     

姜黄素通过抑制HDGF/β-catenin复合物降低胶质瘤细胞的侵袭性

目的探讨姜黄素对胶质瘤细胞的侵袭、迁徙能力的影响及相关机制。方法四甲基偶氮唑蓝实验筛选合适的姜黄素药物 浓度;Transwell小室、Boyden小室及划痕实验检测姜黄素对胶质瘤细胞侵袭、迁移能力的影响;蛋白免疫印迹实验和蛋白质免 疫共沉淀实验检测相关蛋白质表达水平变化及相关蛋白质之间相互作用。结果终浓度为20 μmol/L的姜黄素培养基培养48 h 作为实验组处理因素;姜黄素能明显降低胶质瘤细胞的侵袭、迁移能力（P<0.05）;机制分析显示,与空白对照组相比,姜黄素处 理组HDGF、N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug蛋白表达水平下降,E-cadherin蛋白表达水平升高;在姜黄素处理过的胶质瘤细胞 中干扰和过表达HDGF可分别协同抑制和逆转上皮细胞-间充质转化(EMT)信号;姜黄素可以明显降低HDGF与β-catenin的结 合量。结论姜黄素通过抑制HDGF/β-catenin复合物,降低了EMT信号,从而抑制了胶质瘤细胞侵袭、迁移能力。     

双氢青蒿素通过Wnt信号通路对胶质瘤细胞增殖侵袭的影响

目的:研究双氢青蒿素(dihydroartemisinine,DHA)对人胶质瘤U251细胞的增殖、侵袭的影响及其作用机制。方法:采用四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法观察DHA对胶质瘤活性的影响;细胞划痕实验检测细胞迁移力; Transwell小室法检测细胞侵袭力;免疫印迹试验(Western blot,WB)检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin及β-catenin、GSK-3β、Axin2、c-myc蛋白的表达水平。结果:DHA显著抑制胶质瘤U251细胞的增殖活性、迁移能力及侵袭能力且呈浓度依赖性; WB法显示DHA下调E-cadherin、β-catenin、c-myc蛋白的表达水平,上调N-cadherin、Vimentin、GSK3β、Axin2蛋白的表达水平且呈浓度依赖性。结论:DHA可以抑制人胶质瘤U251细胞增殖、迁移及侵袭,其机制可能与其抑制Wnt/β-catenin通路从而抑制EMT相关进程。     

雷公藤甲素通过Wnt/β-catenin通路抑制胶质瘤细胞增殖的机制研究

目的 探究雷公藤甲素（triptolide,TPL）对胶质瘤细胞系（U251细胞）增殖的影响,并探索其潜在分子机制。方法 取胶质瘤细胞分为空白对照组、TPL组及TPL+HLY78(Wnt活化剂)组。除空白对照组不做干预外,TPL组以100 nM TPL处理24 h,TPL+HLY78组以100 nM TPL处理24 h后,10μM HLY78处理30 min。分别采用CCK-8、细胞划痕、Transwell方法分别检测U251细胞增殖、迁移和侵袭能力;Western blot检测上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）相关蛋白E-钙粘蛋白（E-cadherin）、N-钙粘蛋白（N-cadherin）表达以及Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达;免疫荧光检测β-连环蛋白（β-catenin）的表达。结果 与空白对照组相比,TPL组细胞增殖、侵袭和迁移能力均显著降低（P<0.01）;E-cadherin蛋白表达显著升高（P<0.01）,N-cadherin蛋白表达显著降低（P<0.01）;细胞周期蛋白D1(Reco...     

siRNA沉默肿瘤坏死因子α诱导蛋白2表达对胶质瘤细胞侵袭及增殖的影响*

目的 探讨沉默肿瘤坏死因子α诱导蛋白2（TNFAIP2）表达对胶质瘤细胞侵袭及增殖的影响。方法 使用Lipofectamine 2000介导siRNA转染胶质瘤细胞U87和U251下调TNFAIP2 mRNA的表达;运用细胞划痕及Transwell实验检测沉默TNFAIP2表达对U87及U251细胞迁移、侵袭的影响;通过CCK-8实验检测沉默TNFAIP2表达对胶质瘤细胞U87及U251增殖的影响。结果 Lipofectamine 2000介导si-TNFAIP2转染U87及U251细胞可下调TNFAIP2 mRNA的表达;沉默TNFAIP2表达可降低胶质瘤细胞U87和U251迁移侵袭的能力;沉默TNFAIP2表达可抑制U87及U251细胞的增殖。结论 siRNA沉默TNFAIP2表达可抑制胶质瘤细胞的侵袭和增殖。     

沉默SLP-2 可抑制人宫颈癌细胞的迁移及侵袭能力

目的研究沉默SLP-2对人宫颈癌细胞迁移及侵袭能力的影响及其作用机制。方法用siRNA转染人宫颈腺癌Hela细胞 及宫颈鳞癌Siha细胞作为沉默组,同时设立空白对照组及阴性对照组,转染48 h后,用Western blot检测SLP-2蛋白的表达量, 用划痕实验、Transwell 实验检测沉默SLP-2 对Hela 和Siha 细胞迁移能力的影响,用基质胶Transwell 实验检测沉默SLP-2 对 Hela 和Siha 细胞侵袭能力的影响,用Western blot 检测沉默SLP-2 后Hela 和Siha 细胞上皮间质转化标志分子E-cadherin、β- catenin、vimentin及上皮间质转化上游转录因子Twist蛋白表达量的变化。结果与对照组相比,Western blot结果显示沉默组 SLP-2蛋白的表达量明显下降;划痕实验显示沉默组的划痕面积愈合率明显下降（P<0.01）;Transwell实验及基质胶Transwell实 验均显示沉默组穿过小室膜至下室的细胞数明显减少（P<0.01）;Western blot结果显示沉默组上皮细胞标志分子E-cadherin及 β-catenin表达升高,而间质细胞标志分子vimentin表达下降,表明Hela细胞和Siha细胞的上皮间质转化受到抑制;Western blot 结果显示沉默组Twist蛋白的表达量也明显下调。结论沉默SLP-2可抑制人宫颈癌细胞上皮间质转化（EMT）的发生,使宫颈 癌细胞的迁移及侵袭能力下降,其作用机制可能与下调Twist蛋白的表达有关。     

CD40基因特异性沉默对脑胶质瘤细胞株U87增殖和迁移的影响

目的探讨CD40基因特异性沉默对脑胶质瘤细胞增殖和迁移等恶性生物学行为的影响。方法构建特异性沉默CD40基因的重组表达载体（pSilencer3.1/shRNA-CD40）和随机对照载体（pSilencer3.1/shRNA-control）,转染脑胶质瘤细胞株U87。采用RT-PCR和流式细胞术分别在mRNA和蛋白水平的检测CD40基因沉默效率,进而采用细胞计数法和Transwell法观察下调CD40分子表达后的U87细胞在sCD40L作用下增殖能力和迁移能力的改变。结果成功构建了特异性沉默CD40基因的稳定细胞株U87/shRNA-CD40,可显著下调U87细胞CD40 mRNA和蛋白质表达水平（P〈0.05）。采用sCD40L激发CD40信号,结果显示,与野生型U87和对照组U87/shRNA-control相比,U87/shRNA-CD40细胞株增殖速率和迁移能力明显下降（均P〈0.01）。结论特异性沉默脑胶质瘤细胞CD40分子表达,可以有效削弱肿瘤微环境中CD40信号导致的脑胶质瘤细胞增殖和迁移能力,这为临床治疗脑胶质瘤提供了新的线索。     

沉默YAP1可抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力

目的探究沉默Yes 相关蛋白1（YAP1）对鼻咽癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。方法采用实时荧光定量PCR和 Western blot方法检测YAP1在鼻咽癌细胞系中的表达水平;在鼻咽癌细胞S26和S18中转染3条合成的小干扰RNA：si-NC, si- YAP1#1和si-YAP1#2,以转染阴性对照si-NC的细胞作为对照组,转染si-YAP1#1和si-YAP1#2的细胞作为实验组,实时荧光定 量PCR和Western blot检测转染后的干扰效率;通过细胞计数、平板克隆形成等方法评估转染si-YAP1#1和si-YAP1#2后的实验 组和转染si-NC的对照组对鼻咽癌细胞增殖能力的影响;用划痕和Transwell 方法分析各组细胞迁移与侵袭能力的变化; Western blot检测各组细胞中c-myc、上皮性钙黏蛋白（E-cadherin）、神经性钙黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）等与细 胞增殖和上皮间质转化相关蛋白的表达变化。结果YAP1在鼻咽癌细胞系中高表达;与阴性对照组相比,转染si-YAP1#1和si- YAP1#2的实验组细胞中YAP1的mRNA及蛋白水平均显著降低（P<0.05）;生长计数、平板克隆、划痕及Transwell等实验结果 均显示转染si-YAP1#1和si-YAP1#2的实验组细胞的生长和克隆能力、划痕愈合能力及侵袭能力较阴性对照组细胞明显下降 （P<0.01）;且相较阴性对照组,实验组细胞中c-myc、N-cadherin和Vimentin等蛋白的表达水平降低,E-cadherin的表达量增加。 结论YAP1在鼻咽癌细胞系中高表达,在鼻咽癌细胞中利用siRNA靶向敲低YAP1的表达后可以抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移 及侵袭能力,提示YAP1可以作为一个潜在的鼻咽癌临床治疗干预靶点。     

敲减长链非编码RNA ATB抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭

目的 采用shRNA ATB敲减胶质瘤U87细胞中ATB后,研究其对人胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响.方法 本研究采用实时定量PCR(qRT-PCR)方法检测ATB在人胶质瘤细胞系U87与正常人脑胶质细胞HEB中的表达情况.并在此基础上构建了ATB表达载体shRNA ATB 质粒,利用其转染人胶质瘤U87细胞株,获取低表达ATB的U87细胞.应用MTT法检测敲减ATB后对U87细胞增殖的影响;应用细胞克隆实验检测敲减ATB后对U87细胞克隆增殖能力的影响;应用Transwell实验检测敲减ATB后对U87细胞迁移和侵袭能力的影响.结果 qRT-PCR结果显示,与正常人脑胶质细胞HEB相比,人脑胶质瘤细胞系U87中ATB 表达明显上调(P<0.01);与shRNA对照组相比,转染了shRNA-ATB实验组能显著减少ATB 水平(P<0.01);细胞克隆实验显示shRNA-ATB实验组细胞克隆形成能力较shRNA对照组明显降低(P<0.01);MTT结果表明敲减细胞内ATB后细胞增殖的速率明显低于shRNA对照组(P<0.01).此外,Transwell实验进一步验证了敲减胶质瘤U87细胞中的ATB后,细胞迁移和侵袭能力明显受到抑制(P<0.01).结论 靶向敲减U87细胞中的ATB后能够抑制其增殖、迁移和侵袭,表明ATB基因可能是胶质瘤患者的潜在治疗靶点.     

siRNA介导的PD-L1 沉默可增强人CD8+T淋巴细胞的体外杀伤作用

目的设计并筛选多条可高效特异性降低肿瘤细胞表面沉默程序性死亡受体-配体1（PD-L1）表达的小干扰RNA（siRNA） 序列,并研究其增强人CD8+T淋巴细胞对人胶质瘤细胞（U87 MG）免疫杀伤作用。方法根据siRNA设计法则,并通过siDirect 软件在线设计针对PD-L1基因的几种不同的siRNA序列,并运用BLAST进行同源性分析,最终确定候选序列;通过RT-qPCR、 Western blot及流式细胞术实验,选出高效抑制PD-L1 mRNA及蛋白表达的siRNA序列;通过流式细胞术及CCK8检测PD-L1 siRNA沉默U87 MG细胞的PD-L1后,人CD8+T细胞对U87 MG的细胞凋亡及增殖的影响。结果设计了10条针对人PD-L1基 因具有不同核苷酸序列的siRNA。采用RT-qPCR、Western blot及流式细胞术在mRNA及蛋白水平上检测siRNA的沉默效率, 与对照组相比,siPD-L1-1、siPD-L1-2 、siPD-L1-3、siPD-L1-4、siPD-L1-5及siPD-L1-8均显著降低U87 MG 中PD-L1基因的表达 （P<0.05）,其中siPD-L1-3的沉默效率最高。与对照组相比,流式细胞术及CCK8结果显示,siPD-L1-3及siPD-L1-8均可显著增 强人CD8+T细胞对U87 MG细胞的杀伤作用,且该杀伤作用可显著抑制U87 MG细胞增殖（P<0.05）。结论本文设计并筛选了 能有效沉默PD-L1基因表达的siPD-L1-1、siPD-L1-2、siPD-L1-3、siPD-L1-4、siPD-L1-5及siPD-L1-8的6条序列,其中siPD-L1-3 和siPD-L1-8 可高效增强T 淋巴细胞对U87 MG细胞免疫杀伤作用,且siPD-L1-3 的作用最为显著。本文设计的PD-L1 siRNA分子可以用于设计和制备预防、治疗多种癌症的核酸药物。