昆明地区Rh阴性者RhD假基因(RhDψ)和杂交RhD-CE-D基因的检测和医学应用

目的 用PCR基因分型技术分析研究昆明地区常住人口Rh阴性血型的D基因多态性,建立和完善本地区Rh血型的PCR RhD基因检测方法 .方法 收集46例Rh阴性血型样本,首先采用外显子-SSP进行PCR扩增,筛选出5例D基因部分存在型,再采用内含子-SSP进行PCR扩增,扩增产物用于DNA测序.结果 在46例Rh阴性血型样本中,D基因完整缺失者29例(63%);D基因完整存在者12例(26.1%),存在全部外显子;D基因部分存在者5例(10.9%).DNA测序结果 显示,2例仅存在D基因的第10外显子的样本均为RhD-CE(3-9)-D杂合基因,1例存在D基因的第4、6外显子为RhD-CE(2-3,5,7-9)-D杂合基因,是新发现的变异等位基因.结论 (1)昆明地区常住人群存在高频率的RhD-CE(3-9)-D杂合基因.(2)在昆明人群发现一种新型D变异等位基因即RhD-CE(2-3,5,7-9)-D杂合基因.     

RhD变异型DⅥⅢ型的血清学及基因定型研究

目的：探讨血清学定型为RhD变异型DⅥⅢ型的分子基础。方法对2例RhD定型弱阳性、阴性反应的标本进行ABD（DⅥ-）血型卡检测、试管法检测IgM抗-D、Liss/Coombs卡检测IgG抗-D、直接抗人球蛋白试验、Rh分型卡检测Rh抗原分型、同时采用PCR-SSP进行RhD基因检测。结果2例标本IgM抗-D均阴性,3批IgG抗-D均4+,ABD（DⅥ-）血型卡D阴性,Rh分型为Ccee,RhD基因检测结果为D3-6外显子缺失,确认为DⅥⅢ型,基因结构为RhD-CE(3-6)-D。结论对于RhD弱阳性的标本可采用分子生物学的方法做基因定型。作为受血者和供血者在临床输血中和临床抗-D同种免疫的预防和监护中的策略是不同的。     

天津地区RhD阴性人群基因多态性分析

目的 研究天津地区正常RhD阴性人群的基因型.方法 应用PCR-SSP方法检测RhD阴性DNA,来判断RhD的基因分型结果,对于血清学和基因学检测结果不相符的标本,进行比较分析.结果 经间接抗人球蛋白试验检出的RhD阴性血液样本100例,通过PCR-SSP方法对其进行基因学检测,结果检出16例1227DEL型,9例RhD-CE(2-9)-D型,3例弱D15型,2例RhD阳性,其余70例基因学检测结果均为RhD阴性.结论 中国人群Rh血型基因具有多态性,PCR-SSP方法在鉴定Rh血型基因型中具有非常重要的临床意义.     

蚌埠地区124例RhD阴性献血者的RHCE表型及DEL型的分布与基因研究

目的研究蚌埠地区RhD阴性献血者的RHCE表型,DEL的表型、分布和RHD基因的外显子存在情况。方法通过使用抗-D（IgM）试剂筛查出RhD（IgM）阴性献血者;再使用3个厂家或不同批号的抗-D（IgG）试剂,经间接抗人球蛋白试验（IAT）确认RhD阴性样本;然后采用吸收放散试验筛选其中的DEL型,同时检测其表现型,并对15份DEL型样本采用PCR方法进行基因扩增和产物分析。结果124例RhD阴性献血者中ccee表型为77例（62．1％）,Ccee为38例（30．6％）,CCee为8例（3．3％）,ccEe为1例（0．1％）;DEL型共15例占RHD阴性样本的12．1％,其中ccee2例,Ccee11例,Ccee2例;并检测出15例DEL型样本的5、4、5、6、7、9、10共7个特异性外显子。结论蚌埠地区RhD阴性献血者中Rh表型存在多态性,eeee表型的比例达62．1％;DEL型的比例低于相关报道,DEL型具有全部RHD基因外显子。     

新乡地区Rh阴性无偿献血者Rh表型分布及RhD变异型基因型分析

目的 分析新乡地区Rh阴性无偿献血者Rh表型分布及RhD变异型基因型。方法 选择2018年1月至2019年12月于新乡市中心血站无偿献血的110 667名无偿献血者为研究对象。采用试管法ABO正反定型试验检测ABO血型，采用试管法Rh抗原分型试验检测Rh表型并初筛RhD阴性受试者，采用间接抗人球蛋白试验对初筛RhD阴性受试者进行RhD阴性确认，并检出RhD变异型受试者。采用聚合酶链式反应法扩增RhD变异型受试者RHD基因外显子E1～E10,将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察相应的外显子区域有无特异性条带出现。采用Sanger测序法对RhD变异型受试者的RHD基因外显子E1～E10的特异性扩增产物进行基因测序，应用SeqMan软件分析基因序列，根据单核苷酸多态性位点确定RhD变异型。结果 110 667名受试者中，初筛RhD阴性269例(0.24%)。269例初筛RhD阴性受试者中，Rh阴性256例(95.17%),RhD变异型13例(4.83%)。256例RhD阴性受试者中，ABO血型为A型78例(30.47%)、B型92例(35.94%)、O型64例(25.00%)、AB型22例(8...     

PCR-SSP RHD基因定型方法的初步应用

目的采用序列特异性引物PCR技术(PCR-SSP)进行RHD基因定型.方法采用新近报道的PCR-SSP RHD定型方法检测10例RhD阳性个体,包括2例哈萨克族人、2例蒙古族人、2例藏族人和4例维吾尔族人,以及11例RhD阴性个体(汉族10例、维吾尔族人1例),并通过测序和内含子检测分析1例汉族个体的RHD基因型.结果全部样品的PCR-SSP检测结果与血清学表型相符,1例汉族RhD阴性个体鉴定为D放散型,携带RHD1227A等位基因,1例个体的检测结果提示携带融合RHD基因.测序分析显示该融合基因的第1、2和第10外显子序列与正常RHD基因相应外显子相同,而缺失其余外显子,由于RHD基因和RHCE(e)基因的第2外显子序列相同,笔者采用PCR方法检测RHD基因第2内含子,结果为阴性,说明该个体携带的融合基因为RHD-CE(2-9)-D2等位基因.结论 PCR-SSP可用于中国人Rh血型D抗原基因定型.     

中国人群中RHAG基因序列的观察

目的探讨中国人群中不同Rh血型表型的RHAG基因序列。方法用血清学方法检测20例中国人群中不同Rh血型表型[包括了15例Rh(D)阳性样本和5例Rh(D)阴性样本,Rh(D)阳性样本中包含5例Rh Cc Ee抗原弱表达、5例弱D和5例正常Rh(D)阳性样本],依据RHAG基因序列的特异性,设计10对特异性引物扩增20例样本的RHAG基因第1~10外显子,确认条带符合后送公司纯化并测序。结果 20例不同Rh血型表型的样本在统一PCR条件下均扩出RHAG基因1~10外显子,扩增产物测序结果与标准序列对比一致。结论了解中国人群中RHAG基因的多态性需观察更多有意义的样本。     

河南省部分RhD(一)献血者RhD基因多态性分析

目的：探讨RhD(-)本省无关供血者中RhD的构成情况。方法：采用PCR－SSP法对80名常规血清学RhD(-)本省供血者RhD基因外显子2、3、4、5、6、7、9、10和内含子4及RhCE内含子4的特异性片段进行扩增。结果：80名RhD(-)供血者中RhD基因完全缺失53例，占66.2%；RhD基因部分缺失7例，占8.7%，其中大部分为3－9外显子缺失；RhD基因完整存在20例，占25％。结论：本省常规血清学RhD(-)无关供血者RhD基因存在高度多态性，提示本省人群RhD（－）特征有多种遗传机制，目前在白种人群中使用的DNA鉴定Rh血型的方法不适合我国人群，临床上应采用适合我国人群的检测方法。     

RhD阴性个体遗传多态性与抗-D同种免疫关系研究

目的：研究血清学RhD阴性个体的基因多态性与抗-D同种免疫的关系,探讨不同基因型个体的个性化输血策略。方法用盐水法及间接抗人球方法（IAT）确定RHD阴性个体,采用序列特异性引物（SSP-PCR）技术分析样本的RHD基因同时进行抗体筛选和抗体鉴定确定产生抗-D的样本。结果在有免疫史的336例入组者样品中,249例（74.1%）个体完全缺失RhD基因,l68例（20.2%）个体携带RHD1227A等位基因,19例（5.6%）携带RHD-CE（2-9）-D融合基因。抗体鉴定产生IgG抗-D的个体68例,63例（92.6%）完全缺失RhD基因,5例（7.4%）携带RHD-CE（2-9）-D融合基因,携带RHD1227A等位基因未检出产生抗-D的个体。结论血清学确定RhD阴性个体的RHD基因型具有丰富的多态性和不同的遗传学背景。真实RhD阴性和部分D个体有D抗原免疫时存在同种免疫风险,作为受血者应输用阴性血。基因型为RHD1227A患者不会产生抗-D,在输血时可输用阳性血。     

探讨RhD阴性表型中个体D基因多态性研究

目的:探讨RhD阴性表型中个体D基因的多态性.方法:随机抽取2014年11月至2015年10月采集的135例无亲缘关系的RhD阴性血液样本作为研究对象.采用抗人球蛋白试验(又称Coombs试验)来检测RhD阴性表型个体,并运用序列特异引物引导的PCR反应(简称PCR-SSP方法)对RhD阴性表型中个体基因结构特点进行分析与统计.结果:135例经Coombs试验检测为阴性表型个体中,检测结果显示为外显子完全缺失有75例,占比55.56%(75/135),外显子部分缺失29例,占比21.48%(29/135),外显子完整31例,占比22.96%(31/135);采用PCR-SSP法进行基因分型,RHD基因完整中RhD(1227A)占比16.30%(22/135),弱D15型占比0.74%(1/135),RHD阳性占比5.19%(7/135);检测RHD基因部分缺失中RHD-CE(2-9)-D占比5.93%(8/135),DVa(Has)占比0.741%(1/135),DVIⅢ占比0.74%(1/135).结论:我国RhD阴性人群的RhD基因基础结构呈现多态性特征,且不同地区的人群有着相同的Rh血型遗背景,今后可以尝试采用血清学与基因分型联合方法检测RhD阴性中的D抗原.     

中国人群真实RhD阴性个体和RhDel型RHD基因研究

为观察中国人群真实RhD阴性个体和RhD^el型RHD基因存在情况，采用常规盐水法和抗人球蛋白试验筛选RhD阴性捐血者，通过吸收放散试验性确定其中RhD^el和真实RhD阴性，并采用PCR技术检测RHD基因第4内含子，对吸收放散试验结果与基因检测结果不符的样本进一步采用序列特异性引物PCR(PCR-SSP)技术测定RHD基因第3，4，5，6，7，9和10个外显子，观察基因变异。筛选获得104名RhD阴性捐血者，吸收放散试验鉴定25名（24.0％）为RhD^el型，79名（76.0％）为真实RhD阴性；25例RhD^el全部检测到D基因exon4-intro4-exon5区域，79名真实RhD阴性个体中有5名（6.3％）个体（2名Ccdee，2名ccdEe）检测到D基因第4内含子；PCR-SSP结果显示5名个体中，4名存在全部被检测的D基因区域，1名个体（ccdEe）第5外显子检测阴性。结果表明抗人球蛋白试验确认的RhD阴性中国人存在高比率的RhD^el型，且均可检测出RHD基因第4内含子；若排除RhD^el，携带D基因的RhD阴性中国人的比率明显降低，且这些个体并非如经往报道的均为C抗原阳性。     

Rh弱D、Del的检测及意义

目的：探讨初筛为Rh（D）阴性样本中弱D，Del的检测及临床意义。方法：采用常规血清学方法初筛Rh（D）血型，用微柱凝胶抗人球蛋白试验检测弱D，用吸收放散试验检测Del，用PCR—SSP法检测样本RhD基因8个外显子结构。结果：常规血清学初筛Rh（D）阴性60例中经微柱凝胶抗人球蛋白试验确认勾弱D4例，占6．67％：56例Rh（D）阴性标本经吸收放散试验后确认13例为Del，占21．67%：对其中2例弱D和5例Del标本的D基因8个外显子检测都完整存在，排除了弱D、Det的10例Rh（D）阴性标本其基因检测有完全缺失和部分缺失两种可能。结论：为了临床输血安全，常规血清学检测Rh（D）阴性者，应当再用抗人球蛋白试验或吸收放散试验检测是否为弱D或Del。     

长沙地区汉族RhD阴性个体RHD基因多态性研究

目的:研究长沙地区人群Rh阴性个体RHD基因多态性的分布及血清学表型与RH基因型之间的关系。方法:应用PCR-SSP技术检测长沙地区108名Rh阴性献血者的RHD基因和RHCE基因。结果:108例Rh阴性个体中,ccee表型66例、Ccee32例、CCee 7例、CcEe2例、ccEe1例;108例Rh阴性个体中68例RHD基因外显子完全缺失、24例完整、16例部分缺失。吸收放散试验检测出21例RhD放散型。结论:长沙汉族Rh阴性人群的RHD基因结构呈现多态性,常规血清学鉴定的RhD阴性者中存在较高比例的RhD放散型(Del型),且有可能带有完整的RHD基因。携带D基因的吸收放散试验阴性个体中具有C抗原者比例较高,但亦有cc表型存在,有别于文献中认为全属RhC抗原表达者的报告。     

溶血性贫血对新生儿血型鉴定的干扰

目的研究Rh新生儿溶血病患儿抗D抗体对ABO、RhD血型定性的干扰。方法选取12例Rh新生儿溶血病患儿（直接抗球蛋白试验阳性）,采用常规血型血清学技术测定ABO、RhD血型。对RhD阴性者进行热放散后再进行RhD血型鉴定。抗体筛选阳性者进行抗体特异性鉴定。结果12例中RhD定型中5例阴性误定为阳性,采用热放散试验后血型皆正确判定,12例患儿血清中均含有抗D抗体。结论Rh阴性新生儿溶血病患儿抗-D抗体干扰RhD血型鉴定,对ABO血型鉴定没有干扰。     

表观RhD阴性孕妇产前检查的结果分析

目的:探讨不规则抗体检测(微柱凝胶法)对RhD血型不合所致新生儿溶血病(以下简称HDN)的防治与监测作用.方法:回顾性分析95例接受检测夫妇RhD血型不合的表观RhD阴性孕妇的产前/孕前血型抗体检测结果,采用微柱凝胶血型卡检测受检者ABO血型及Rh血型的D、C、E抗原,RhD初筛阴性者进一步采用间接抗人球蛋白试管法检测D抗原以排除或确认弱D型或部分D表型;用微柱凝胶Coombs卡对受检者进行不规则抗体筛检,初筛阳性者进一步用抗体鉴定细胞做抗体鉴定和抗体效价测定.结果:95例RhD初筛阴性标本经传统试管法的间接抗人球蛋白试验复检,均排除弱D或部分D表型,其中5例受检者产生了IgG抗-D,本组抗-D产生比例为5.5％.结论:不规则抗体检测应用于表观RhD阴性孕妇的产前检查,可为RhD血型不合的HDN的预测、评估提供实验依据.     

山东临沂地区RhD阴性无偿献血人群中RHD基因变异体的分析

目的 探讨临沂地区RhD阴性无偿献血人群RHD基因的变异体及其分子背景。方法 2011年采集24875人份全血,获得RhD初筛阴性标本111例,提取DNA后,采用序列特异性引物-多聚酶链反应(SSP PCR),进行以下三步实验：① 检测出缺失RHD基因的RhD阴性、DEL1227G＞A突变以及其他变异体;② 鉴定其他变异体的具体类型;③ 对有突变位点未检出型别的变异体进行测序。结果 临沂地区无偿献血人群中RhD阴性比例为0.45%,在111例RhD初筛阴性标本中,检测到1～10外显子全缺失76例,2～9外显子缺失9例,845G＞A突变3例,3～6外显子缺失3例,1227G＞A 突变18例,RHD(711DELC) 1例,Dva(Hus)1例。结论 临沂地区常规血清学筛查RhD阴性无偿献血人群中RHD基因存在多态性。     

RhD阴性孕妇妊娠RhD阳性胎儿与新生儿溶血病的相关性分析

目的探讨RhD阴性孕妇产前免疫性抗D抗体的检出率与产后新生儿溶血病(HDN)发病率的相关性。方法收集2007年1月至2010年12月137例RhD阴性孕妇产前血样及40例产后血样,分析产前抗D抗体的检出率、产后HDN发病率及其与母儿ABO血型配合性的关系。结果 16例(12.60%)RhD阴性孕妇多次妊娠者检测到抗D抗体,10例首次妊娠者均未检出;产前血清抗D抗体的检出率低于产后(P<0.05);RhD阴性孕妇妊娠RhD阳性胎儿且母儿ABO血型不配合时HDN的发病率高于母儿ABO血型配合者(P<0.05),属ABO血型系统者HDN的发病率高于属Rh血型系统者(P<0.05);抗D抗体的检出率与母儿ABO血型配合性无相关性(P>0.05)。结论产前RhD阴性孕妇抗D抗体的检出率与产后发生HDN的相关性尚不明确;ABO血型不配合对RhD阴性孕妇发生RhD-HDN有保护作用,但对产生抗D抗体的检出率无影响。     

Rh血型DEL表型RhD蛋白表达的研究

目的 探讨Del血型个体是否表达正常的RhD蛋白。方法采用逆转录-聚合酶链反应（Rt-PCR）技术和cDNA序列分析技术，检测不同Rh表型Del血型（CCD^elD^elee、CcD^eldee和CeD^elD^elee）个体的RhDmRNA，分析Del蛋白的表达。结果Del血型个体有复杂的RhD mRNA形式，检测到缺失第7至第9外显子（Del789）、缺失第7和第9外显子（Del79）、缺失第8和第9外显子（Del89）、缺失第9外显子（Del9）、缺失第8和第9外显子加第7内含子的170个碱基（Del89＋170）（917-1086，Genbank AB035194）、缺失第9外显子加第7内含子的170个碱基（Del9＋170）等共6种形式的RhD转录子。这些转录子均缺失第9外显子，其中转录子Del9与正常RhDmRNA最相似。结论Del血型不存在正常的RhD mRNA，不编码正常的RhD蛋白质。     

304例Rh阴性孕产妇的RhD同种免疫分析

目的 分析304例RhD阴性孕产妇RhD同种免疫发生情况,探讨RhD阴性孕产妇抗D抗体产生的影响因素,建立正确的围产期孕妇RhD新生儿溶血病监测方案。方法 采用标准血清学方法对孕产妇及其丈夫进行ABO及RhD抗原鉴定。对RhD抗原鉴定为阴性的样本,进一步采用间接抗人球蛋白法检测RhD抗原,以排除或确认弱D型或部分D表型。对所有RhD阴性孕产妇及其丈夫进行RhCcEe表型的血清学分型。采用抗人球蛋白法对所有RhD阴性孕产妇标本进行不规则抗体初筛,对初筛阳性者进一步用鉴定细胞做抗体鉴定及抗体效价测定并采用PCR SSP方法确定是否为Del型。结果 3975例孕产妇标本中,304例为RhD阴性,其中29例产生抗D抗体,夫妇ABO血型相合24例（82.76%）,不合5例（17.24%）。本组调查中Rh阴性孕产妇抗D抗体产生的比例为9.54%（29/304）。经分子生物学方法鉴定,29例产生抗D的Rh阴性孕产妇均排除Del表型。 结论 RhD阴性孕产妇RhD同种免疫的发生受多种因素影响,Del型孕产妇产生抗D概率较低。应及时、定期监测RhD阴性围产期孕妇的抗D水平。对已产生抗D抗体的孕妇,密切监测其抗D水平,为临床治疗方案提供依据。     

45例有生育史Rh阴性妇女抗-D抗体调查和RHD基因分析

目的 研究45例多次妊娠Rh阴性妇女产后半年免疫状况和RHD基因背景。方法 常规血清学方法检测Rh(D)抗原,抗人球蛋白试验（IAT）对Rh(D)抗原确认和IgG抗-D筛查,热吸收放散确认D放散型（DEL）;先后采用商品化试剂盒、序列特异性引物PCR(sequence-specific primer-polymerase chain reaction,SSP-PCR)技术以及DNA序列分析技术,分析样本的RHD基因。结果 45例样本抗人球蛋白试验检测出IgG抗-D阳性5例占总数的11.1%,占真实Rh(D)阴性的16.1%。DEL检出14例(31.1%),抗-D抗体全部为阴性。D基因分析结果显示以DEL(1227A)等位基因为主,同时呈现多态性。结论 真实Rh(D)阴性妇女多次生育存在较高的同种免疫风险易导致新生儿溶血病,必须做好围产期胎－母免疫预防保护,但DEL型妇女或可免除防护。