益气化瘀方影响椎间盘软骨细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原的作用分析

目的分析益气化瘀方及其拆方于椎间盘的软骨细胞,其凋亡状态下的Ⅰ型与Ⅱ型胶原所具有的调控表达作用。方法通过对椎间盘（大鼠）软骨细胞进行培养（酶消化法）,再运用Fas抗体对其进行诱导凋亡,以益气化瘀方（还包括其拆方：化瘀方和益气方）相应的药理血清来进行干预,再以SP法（免疫组化）对大鼠椎间盘的软骨细胞于不同状态之下对这两型胶原的表达情况做相关检测与分析。结果凋亡模型组显示胶原表达（I型）较正常的对照组明显,显示II型胶原仅呈轻度表达,两组差异呈显著性（P〈0.01）;所用益气化瘀方（还包括其拆方：化瘀方和益气方）,同凋亡模型组相较,不仅均能够明显的上调其胶原的表达（II型）,而且能够下调其胶原的表达（I型）,再将3种中药组与诱导凋亡组相较,差异呈显著性（P〈0.01）。结论予以益气化瘀方（还包括其拆方：化瘀方和益气方）能够调控发生在凋亡状态下大鼠椎间盘自身软骨细胞胶原的表达（I型与Ⅱ型）。     

补气活血方及其拆方对大鼠椎间盘髓核细胞Sox9、TGF-β1的作用

目的：研究补气活血方及其拆方药理血清对大鼠诱导凋亡椎间盘髓核细胞Sox9、TGF-β1表达的影响。方法：用细胞免疫化学和积分光密度分析等方法比较分析补气活血方及其拆方补气方、活血方药理血清对诱导凋亡大鼠椎间盘髓核细胞Sox9、TGF-β1表达的影响。结果：补气活血方、补气方、活血方组相比,Sox9表达升高,TGF-β1表达降低,均有统计学意义（P〈0.01）;补气活血方组与补气方、活血方组比较,TGF-β1表达明显降低,有统计学意义（P〈0.05）。结论：补气活血方及其拆方可以调控大鼠椎间盘髓核细胞内TGF-β1、Sox9表达,其延缓椎间盘退变的机制可能与调控细胞的凋亡相关因子有关。     

清热化瘀方对缺血再灌注大鼠脑组织的保护效应及机制

目的 基于miR-503-5p/Bcl-2通路介导的细胞凋亡机制,探究清热化瘀方对脑缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)大鼠脑组织损伤的保护效应并探讨其作用机制。方法 SD大鼠分为正常组、假手术组、模型组、清热化瘀方组。线栓法建立脑I/R大鼠模型,采用清热化瘀方剂灌胃治疗。采用RT-qPCR、Western blot法分别检测缺血脑组织中miR-503-5p及Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9 mRNA和蛋白表达。TUNEL染色检测大鼠脑组织细胞凋亡情况。结果 大鼠I/R可降低脑组织中Bcl-2表达,升高miR-503-5p、Bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9表达及脑组织凋亡率。清热化瘀方治疗后可升高脑组织中Bcl-2表达,降低miR-503-5p、Bax、caspase-3、caspase-8、caspase-9表达及脑组织凋亡率。结论 清热化瘀方可抑制脑I/R大鼠脑组织细胞凋亡,其机制可能与抑制miR-503-5p、Bax及caspase家族表达、上调Bcl-2表达有关。     

胰岛素样生长因子-1对大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经细胞凋亡及bcl-2、Bax蛋白表达的影响

目的 :研究胰岛素样生长因子 - 1 ( IGF- 1 )对大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经细胞凋亡及 bcl- 2、Bax蛋白表达的影响 ,探讨 IGF- 1对脑缺血再灌注损伤的保护作用机制。方法 :制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。将 30只 Wistar雄性大鼠随机分为假手术组、缺血组及 IGF- 1治疗组。于缺血 1 0 min后经尾静脉给予 IGF- 1 1 0 μg,应用 TTC染色观察梗死灶体积 ,应用免疫组化染色和 TUNEL法检测 bcl- 2、Bax蛋白表达及神经凋亡细胞。结果 :与缺血组比较 ,IGF- 1治疗组梗死体积明显减少 ( P<0 .0 1 ) ,凋亡细胞数明显减少 ( P<0 .0 1 ) ,bcl- 2蛋白表达明显升高 ( P<0 .0 1 ) ,Bax蛋白表达明显降低 ( P<0 .0 1 )。结论 :IGF- 1通过增加 bcl- 2蛋白表达 ,减少 Bax蛋白表达 ,减少神经细胞凋亡 ,对脑缺血再灌注损伤起保护作用。     

益气化瘀补肾方及其拆方调控大鼠颈椎间盘基因表达谱的研究

目的：建立大鼠颈椎间盘退变模型，观察益气化瘀补肾方及其拆方调控退变大鼠颈椎间盘模型基因表达谱的变化。方法：建立动静力失衡性大鼠颈椎间盘退变模型，从对照组和实验组大鼠颈椎间盘中抽提mRNA，经反转录获得大鼠椎间盘cDNA探针；cDNA探针与大鼠基因表达谱芯片杂交，由激光扫描仪得到表达谱图片，然后进行图像分析、标准化处理、ratio值分析、聚类分析。最后得出这些基因在对照组和实验组间的表达差异。结果：聚类分析结果：（1）1号（益气化瘀组）、2号（益气补肾组）、3号（化瘀补肾组）芯片为一类；（2）4号（模型组）和5号（益气化瘀补肾组）芯片为一类。4号芯片与其他芯片的差异最大，2号和3号结果最接近。3例以上差异表达的基因共有96条，其中77条是已知基因。已知基因中：48条表达上调（ratio〉1．0）；29条表达下调（ratio〈0．5）。其中25条基因在模型组与中药组间表达存在差异。结论：退变大鼠颈椎间盘基因的表达发生了改变，益气化瘀补肾方及其拆方可调控相关基因的表达，如上调细胞内信号传导类基因P13K、PTK、ERK3、PH1B1等的表达。     

益气化瘀方对体外培养的大鼠颈椎间盘软骨细胞超微结构的影响

研究益气化瘀方 (主药 :黄芪、丹参、川芎等 )对体外培养的大鼠颈椎间盘软骨细胞超微结构的影响。 8～ 10周龄SD大鼠 70只 ,随机均分为生理盐水对照组 ,芬必得组 ,中药低、中、高剂量组 ,每组 14只。定时、定量胃饲相应药物 ,4天后分别处死大鼠取血清 ,相同条件下制备益气化瘀方含药血清和对照血清 ,取体外培养的大鼠颈椎间盘软骨细胞进行研究 ,采用透射电镜及流式细胞仪检测软骨细胞超微结构及细胞凋亡率。结果显示 ,中药组能促进细胞DNA合成(S期 ) ,与对照组相比 ,差异有非常显著的意义 (P <0 0 1)。表明益气化瘀方具有促进大鼠颈椎间盘软骨细胞生长、增殖及促进细胞DNA合成的作用。     

益气化瘀补肾方对退变椎间盘细胞蛋白聚糖和Ⅹ型胶原mRNA表达的影响

目的:观察益气化瘀补肾方血清对脊髓型颈椎病患者退变椎间盘细胞蛋白聚糖和Ⅹ型胶原mRNA表达的影响.方法:取6例确诊为脊髓型颈椎病的住院患者行颈椎减压融合手术摘除的退变椎间盘组织块,采用组织块法培养原代细胞;SD大鼠10只,灌胃制备大鼠益气化瘀补肾方含药血清.取传代第1代的退变椎间盘细胞,分为益气化瘀补肾方含药血清高浓度组(20%)、中浓度组(10%)、低浓度组(5%)及相应体积比浓度氯化钠溶液血清对照组.MTT法检测不同浓度的益气化瘀补肾方血清对椎间盘细胞增殖的影响,实时荧光定量聚合酶链反应检测不同给药时间点各组椎间盘细胞蛋白聚糖和Ⅹ型胶原mRNA的表达.结果:第1代退变椎间盘细胞传代第6天时细胞增殖达到顶峰,8d后开始下降,故选择细胞传代第6天为给药干预时间点.与对照血清比较,不同浓度的益气化瘀补肾方血清可促进退变椎间盘细胞的增殖(P＜0.01),提高退变椎间盘细胞蛋白聚糖mRNA的表达(P＜0.01),并下调Ⅹ型胶原mRNA的表达(P＜0.01),且以中浓度的作用最为明显(P＜0.05).结论:益气化瘀补肾方通过调节退变椎间盘的胶原及蛋白多糖的表达而产生有效防治脊髓型颈椎病椎间盘退变的作用.     

山楂叶总黄酮对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡及bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表达影响

目的:研究山楂叶总黄酮(Hawthorn leaves favonoids,HLF)对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡及bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表达的影响。方法:通过夹闭冠状动脉后松夹的方法复制心肌缺血再灌注损伤大鼠模型,取80只模型大鼠随机分为5组:心肌缺血再灌注模型组、山楂叶总黄酮(50、100、200 mg/kg)治疗组和复方丹参片(260 mg/kg)治疗组,并另取16只同龄大鼠作为假手术组;每天灌胃给药1次,疗程4周。治疗完成后,通过原位细胞凋亡检测(TUNEL)的方法观察心肌细胞凋亡状况并计算凋亡指数,并通过TTC染色计算各组大鼠心肌梗死面积;通过免疫组织化学(IHC)方法检测心肌组织中bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表达并进行半定量分析。结果:与心肌缺血再灌注模型对照组比较,山楂叶总黄酮(100、200 mg/kg)治疗组大鼠心肌细胞凋亡状况明显好转、凋亡指数显著降低,心肌组织梗死面积显著降低,心肌组织中bcl-2表达上调、Bax表达下调,bcl-2/Bax比值显著升高,caspase-3表达显著下调,上述差异具有统计学意义(P0.05,P0.01)。结论:山楂叶总黄酮具有抑制心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡的作用,其作用机制可能与山楂叶总黄酮能够有效上调bcl-2/Bax比值、下调caspase-3表达有关。     

大鼠椎间盘髓核细胞体外凋亡模型的建立

【摘要】 目的 建立大鼠椎间盘髓核细胞体外凋亡模型。方法 为了充分模拟退变椎间盘内营养缺乏的微环境，本实验分别采用含1%，3%，5%，8%，10%胎牛血清的DMEM培养基培养椎间盘髓核细胞，筛选最佳促凋亡浓度，分别检测髓核细胞凋亡率、凋亡相关蛋白Bax、bcl-2、caspase-3酶的表达、细胞增殖曲线及免疫荧光分析。 结果 流式细胞仪测得髓核细胞凋亡率随着FBS浓度降低而升高，3% FBS为最有效诱导凋亡浓度；Western blot 示Bax、caspase-3酶表达在3% FBS组明显高于10% FBS组，同时bcl-2表达下降；CCK-8检测结果显示含3% FBS的培养基内，随着凋亡率的增长，髓核细胞增殖的速率越来越慢；免疫荧光分析3% FBS组FAS表达量明显比10% FBS组增高。结论 3% FBS能诱导髓核细胞发生凋亡，最终会导致细胞功能丧失，caspase家族参与并执行了这一过程。     

胰岛素样生长因子1对重症急性胰腺炎大鼠肺损伤细胞凋亡的影响

目的:探讨细胞凋亡和bax,bcl-2基因表达在重症急性胰腺炎(SAP)肺损伤发病机制中的作用以及胰岛素样生长因子1(IGF-1)对SAP肺损伤细胞凋亡的影响.方法:将Wistar大鼠72只随机分为对照组、SAP组和IGF-1组,每组24只.大鼠SAP模型采用50 g/L的牛磺胆酸钠自胆胰管注入建立,三组在建模后6,12,24 h各取8只测定血清淀粉酶、肺损伤病理评分;光镜和电镜下观察肺组织病理变化,细胞凋亡原位检测法测定肺组织内细胞凋亡,RT-PCR法测定肺组织baxmRNA,bcl-2 mRNA的表达.结果:SAP组血清淀粉酶、肺损伤病理评分、细胞凋亡指数、bax mRNA和bcl-2 mRNA表达较对照组升高,透射电镜下肺组织内细胞凋亡明显增多;经IGF-1 干预后,血清淀粉酶、肺组织内细胞凋亡指数及肺损伤病理评分较SAP组下降,bax mRNA表达下降,bcl-2 mRNA表达增强,透射电镜下见肺组织内细胞凋亡明显减少.结论:肺组织细胞凋亡及bax,bc1-2基因表达参与了SAP肺损伤发病机制,IGF-1可通过抑制肺组织细胞凋亡减轻肺损伤,其机制可能部分是通过调节凋亡相关基因bax,bcl-2的表达来实现的.     

益气化瘀方对腰神经压迫模型大鼠背根节神经细胞凋亡和caspase-3表达的影响

目的：观察益气化瘀方对腰神经根压迫损伤大鼠背根节神经细胞凋亡及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）的影响。方法：雄性SD大鼠40只随机分为假手术组、模型组、弥可保组和益气化瘀方组,每组10只。造模各组用自制胶块压迫于大鼠右侧L;神经根背根节处,假手术组仅切开皮肤和椎旁肌。造模后假手术组和模型组大鼠给予生理盐水灌胃,益气化瘀方组大鼠给予益气化瘀方煎剂灌胃,弥可保组大鼠肌肉注射弥可保。于造模10d后取右侧受压神经根,采用原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法检测神经细胞的凋亡情况;分光光度法结合考马斯亮蓝法检测受压迫神经根caspase-3活性;实时荧光定量聚合酶链式反应法检测神经根组织caspase-3mRNA表达变化。结果：腰神经根受压迫后背根节的神经细胞凋亡明显增加,模型组大鼠神经细胞的凋亡指数高于假手术组（P〈0．01）;益气化瘀方和弥可保可减少背根节神经细胞的凋亡,两组大鼠神经细胞的凋亡指数低于模型组（P〈0．05）。模型组大鼠神经根组织caspase-3活性和mRNA表达明显增高,与假手术组比较差异有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）;益气化瘀方和弥可保可降低造模后大鼠神经根组织caspase-3活性及其mRNA表达,二者与模型组比较差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论：腰神经根压迫可导致受压神经根组织caspsae-3的过表达和神经细胞凋亡的增加。益气化瘀方可抑制神经根组织caspase-3的过表达,减轻背根节神经细胞的凋亡。     

益气化瘀中药对糖尿病皮肤溃疡大鼠缺氧诱导因子-1α和血管内皮细胞生长因子的影响

目的:探讨益气化瘀中药对糖尿病皮肤溃疡气虚血瘀证大鼠缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)和血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的影响。方法:72只清洁级雄性SD大鼠,除8只作正常对照组外,其他大鼠在背部全层皮肤缺损开放性创面的基础上加造气虚血瘀证糖尿病模型后,随机分为模型组、贝复济组、益气化瘀组、益气组和化瘀组。应用免疫组织化学、图像分析等技术,观察各组大鼠创面肉芽组织中HIF-1α和VEGF水平的变化。结果:模型组HIF-1α水平高于正常对照组(P<0.01),VEGF浓度明显低于正常对照组(P<0.01)。各用药组HIF-1α表达水平明显低于模型组(P<0.01),VEGF表达水平明显高于模型组(P<0.01)。益气化瘀组HIF-1α表达水平明显低于贝复济组、益气组和化瘀组(P<0.05或P<0.01),VEGF表达水平明显高于贝复济组(P<0.01)。益气组与化瘀组HIF-1α和VEGF的表达水平相似,它们与贝复济组之间无明显差异。结论:益气化瘀中药能明显促进糖尿病皮肤溃疡气虚血瘀证大鼠的创面愈合,其机制与下调HIF-1α水平、上调VEGF的表达水平和改善局部缺血缺氧状态有关。     

益气化瘀方对大鼠腰神经根受压后神经肌肉终板再生修复的作用

目的 探讨大鼠L3神经根受压后，在神经再生修复过程中．益气化瘀方对神经肌肉接头部神经元的作用。方法 48只大鼠随机分为10、20、30、60d对照组和益气化瘀方组。制作大鼠L2神经根受压模型，益气化瘀方组给予益气化瘀方灌胃，对照组给予等量生理盐水。造模后l0、20、30、60d取大鼠比目鱼肌．采用多克隆蛋白基因产物9．5作为神经元标记，应用免疫组织化学法结合激光共聚焦扫描显微技术．观察神经肌肉接头部末梢神经再生修复的过程。α环蛇毒素荧光结合剂显示运动终板，NIH图像分析技术测定末梢神经与运动终板的重叠面积。结果 肌肉失神经支配后，益气化瘀方组的末梢神经在神经肌肉接头部的聚集、出芽及延伸均显著地早于对照组。在神经再生修复期间．益气化瘀方组的末梢神经与运动终板的重叠速度、范围及神经肌肉接头的再构筑，亦显著地优于对照组。结论 益气化瘀方能促进神经元的增生，增强其再生能力．加快神经肌肉接头的重建．显著地缩短神经再生修复的进程。     

益气化瘀补肾方对退变椎间盘细胞蛋白聚糖和Ⅹ型胶原mRNA表达的影响

目的：观察益气化瘀补肾方血清对脊髓型颈椎病患者退变椎间盘细胞蛋白聚糖和Ⅹ型胶原mRNA表达的影响。方法：取6例确诊为脊髓型颈椎病的住院患者行颈椎减压融合手术摘除的退变椎间盘组织块,采用组织块法培养原代细胞;SD大鼠10只,灌胃制备大鼠益气化瘀补肾方含药血清。取传代第1代的退变椎间盘细胞,分为益气化瘀补肾方含药血清高浓度组（20%）、中浓度组（10%）、低浓度组（5%）及相应体积比浓度氯化钠溶液血清对照组。MTT法检测不同浓度的益气化瘀补肾方血清对椎间盘细胞增殖的影响,实时荧光定量聚合酶链反应检测不同给药时间点各组椎间盘细胞蛋白聚糖和Ⅹ型胶原mRNA的表达。结果：第1代退变椎间盘细胞传代第6天时细胞增殖达到顶峰,8d后开始下降,故选择细胞传代第6天为给药干预时间点。与对照血清比较,不同浓度的益气化瘀补肾方血清可促进退变椎间盘细胞的增殖（P〈0.01）,提高退变椎间盘细胞蛋白聚糖mRNA的表达（P〈0.01）,并下调Ⅹ型胶原mRNA的表达（P〈0.01）,且以中浓度的作用最为明显（P〈0.05）。结论：益气化瘀补肾方通过调节退变椎间盘的胶原及蛋白多糖的表达而产生有效防治脊髓型颈椎病椎间盘退变的作用。     

益气化瘀中药对糖尿病皮肤溃疡大鼠转化生长因子β1的影响

目的:探讨益气化瘀中药及其拆方(益气方和化瘀方)促进糖尿病溃疡创面愈合的分子机制。方法:将60只大鼠随机分为益气化瘀组、益气组、化瘀组、贝复济组、模型组和正常对照组。通过腹腔注射链脲佐菌素和外科方法建立糖尿病大鼠全层皮肤缺损模型,给予不同中药煎剂口服及贝复济外用对照,运用免疫组织化学、图像分析和Western blotting的技术手段分别检测各组治疗后创面新生肉芽组织中转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的表达水平。结果:糖尿病溃疡模型组TGF-β1表达水平低于正常对照组(P<0.01);各治疗组TGF-β1表达水平高于糖尿病溃疡模型组(P<0.01);益气化瘀组TGF-β1表达水平高于拆方组和贝复济组(P<0.05)。结论:TGF-β1表达水平下降可能是糖尿病创面难以愈合的机制之一,益气化瘀中药可能是通过提高创面TGF-β1的表达水平,促进创面愈合。     

益气化瘀方对大鼠腰神经根损伤后花生凝集素结合分子和施万细胞的作用

目的:研究大鼠Is神经根损伤后,益气化瘀方对神经肌肉接头部花生凝集素结合分子(peanut agglutinin-binding molecules,PNA-BMs)和施万细胞(Schwann's cell,Sc)的作用.方法:大鼠L5神经根损伤后,给与益气化瘀方治疗.于用药后第10、20、30、60天,采用免疫组织化学和激光共聚焦扫描显微镜技术,观察PNA-BMs及作为Sc标记的S-100在大鼠比目鱼肌中的分布.使用NIH图像分析技术,定量测定PNA-BMs与S-l00的重叠面积.结果:被PNA识别的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在Sc延伸过程中起着重要的导向作用.益气化瘀方对Sc在神经肌肉接头部的聚集、出芽、延伸,以及与PNA-BMs的重叠面积均明显优于对照组.结论:益气化瘀方能明显促进ECM和Sc的生长,从而加速神经再生修复进程.     

益气化瘀方对腰神经根损伤大鼠神经细胞黏附分子的作用

目的:探讨益气化瘀方对大鼠神经再生修复过程中神经肌肉接头部神经细胞黏附分子(neuralcelladhesionmolecule,NCAM)的作用。方法:大鼠L5神经根损伤后,予以益气化瘀方分别治疗10、20和30d。采用免疫组织化学和激光共聚焦扫描显微镜技术,观察大鼠比目鱼肌神经肌肉接头部NCAM的分布变化。采用α金环蛇毒萤光结合剂显示乙酰胆碱受体(acetylcholinereceptor,AChR),NIH图像分析系统定量测定NCAM与AChR的重叠面积。结果:益气化瘀方组NCAM在神经肌肉接头部的聚集、出芽、延伸以及与AChR的重叠面积均明显优于模型组。结论:NCAM的表达与AChR的神经支配情况密切相关。益气化瘀方可促进神经的再生修复。