皮肤扩张后表皮干细胞异位现象初步研究

目的 了解皮肤软组织扩张术后表皮干细胞(ESC)的分化和分布情况,初步探讨扩张皮肤组织的相关生长机制. 方法 取15例行Ⅱ期头、颈部皮肤扩张术患者扩张后(平均注水期45d)皮肤标本及正常皮肤标本,按取材部位分为:(1)头部近扩张器中心组:取与扩张器中轴线垂直距离为3cm处的扩张后头皮;(2)头部扩张器侧壁组:取与扩张器中轴线垂直距离为5～7 cm的扩张后头皮;(3)颈部扩张皮肤组;(4)未扩张头皮对照组;(5)未扩张颈部皮肤对照组.各组皮肤标本行HE染色观察组织结构,行免疫组织化学染色观察细胞角蛋白19(CK19)阳性细胞的分化及分布特征. 结果 与2个末扩张对照组比较,HE染色可见各扩张组表皮层凹凸不平且相对增厚,皱褶明显,细胞层次增多;细胞呈密集分布,以靠近基底层最为显著,但排列欠整齐,极性过度不明显.免疫组织化学染色显示,各扩张组基底层CK19阳性细胞的连续性基本存在,基底层个别部位阳性细胞明显增多,呈复层排列;基底层之外亦有少量成团或散在分布的CK19阳性细胞.2个未扩张对照组未见上述现象. 结论 J 皮肤软组织扩张后,ESC 在修复过程中增殖和分化加强,并出现异化分布.     

CK15、CD29阳性细胞在不同类型皮肤的分布

目的 研究皮肤干细胞相对特异性标记物CK15、CD29阳性细胞在人体不同类型皮肤的分布特点及干细胞的分布规律,探讨其临床意义.方法 收集人体正常的头皮、包皮及躯体、脚掌的皮肤标本各6例,依次设为A、B、C、D四组.分别行石蜡切片后做HE染色和CK15、CD29免疫组化染色观察,统计CK15、CD29染色阳性细胞的PU值并行统计学处理.结果 CK15、CD29阳性细胞的含量:头皮的毛囊隆突部和包皮的表皮基底层含量最多,躯体皮肤的表皮基底层其次,脚掌的表皮基底层几乎没有;D组与A、B、C组比较,其差异有统计学意义(P<0.01).CK15、CD29阳性细胞的分布特点:在头皮主要位于毛囊隆突部,在包皮和脚掌皮肤主要位于表皮基底层,在躯体皮肤主要位于表皮基底层钉突部.结论 CK15、CD29标记的皮肤干细胞在不同类型皮肤的分布和数量均明显不同.此分布特点可能为临床上治疗创面愈合提供实验依据.     

应用改良扩张器构建大鼠皮肤软组织扩张模型

目的应用改良设计的短注射导管枕形扩张器构建大鼠皮肤软组织扩张模型，并探讨其产生的扩张应力对大鼠皮肤细胞增殖分化的影响，验证扩张模型的扩张效果，为研究扩张皮肤新生机制提供一个稳定的动物模型。方法SD大鼠随机分为A、B两组（每组各30只），A组大鼠采用改良设计的扩张器，B组大鼠采用上海威宁公司生产的普通扩张器；选择SD大鼠近颈部切口，以注射壶外置的方式埋置扩张器，制作皮肤软组织扩张模型。分别采集A组在不同扩张时间点（1、2、3、4、5周）的扩张中心区域皮肤和正常皮肤组织作为标本；利用HE染色方法观察扩张后皮肤结构的变化；根据增殖细胞表达增殖细胞核抗原，采用免疫组织化学染色方法观察扩张皮肤中细胞增殖的情况。结果A组应用自行改良设计的扩张器，选择大鼠近颈部切口构建的皮肤软组织扩张模型，术后外置的注射壶不易被大鼠咬掉，且术后注水及护理更简单，模型稳定性显著高于B组。HE染色结果表明，扩张后皮肤的表皮层明显增厚，真皮层变薄；免疫组织化学染色结果显示，增殖细胞呈点状分布，主要集中于表皮基底层和毛囊鞘。结论自行改良设计的短注射导管枕形扩张器，是构建大鼠皮肤软组织扩张模型的良好实验材料；扩张应力对大鼠的皮肤结构和增殖产生了影响。     

角蛋白在头皮中的分布及其在干细胞研究中的意义

目的：研究不同类型角蛋白（Cytokeratin，CK）在头皮及毛囊结构中表达分布情况。方法：将头皮病理切片和游离培养的毛囊使用不同类型角蛋白抗体进行免疫组化染色，检测角蛋白的分布情况。结果：CK15主要分布在毛囊隆突部，部分毛囊外根鞘最外层也有一定的表达；CK19主要分布在汗腺、毛囊外根鞘最外层和皮肤的基底层；CK16在表皮层和毛囊外根鞘均有阳性表达；CK10主要分布在头皮表皮的基底上层和皮脂腺腺泡的最外层。结论：不同类型角蛋白在头皮和毛囊结构中具有明显差异性，CK19和CK15阳性表达细胞可能具有干细胞特性。     

成人正常皮肤和瘢痕组织表皮干细胞定位与表达特征的比较研究

目的采用免疫组织化学染色方法研究成人正常皮肤和瘢痕组织表皮干细胞定位与表达β1整合素和角蛋白19,14,10(K19,K14,K10)的特征与规律,探讨两种组织表皮干细胞表达特征的差异与烧伤后瘢痕愈合的关系.方法分别取成年人健康皮肤6例和大面积深度烧伤后瘢痕组织6例.采用免疫组织化学Elivision两步法检测表皮干细胞、短暂扩充细胞特异表达的β1整合素和K19以及分化表皮细胞表达的K14和K10.结果瘢痕组织表皮基底层表达β1整合素与K19的阳性细胞数较健康皮肤明显减少,阳性强度降低.瘢痕组织表皮中表达K14的阳性细胞仅位于表皮底部2～3层,明显少于健康皮肤,而K10表达阳性细胞则较健康皮肤分布广泛.结论瘢痕组织表皮基底层干细胞和短暂扩充细胞明显少于健康皮肤,且瘢痕组织表皮干细胞的分化过程与健康皮肤不同,处于有丝分裂后分化阶段的细胞比例降低,而终末分化细胞的比例明显增高.提示瘢痕组织表皮的修复能力下降,细胞的分化行为紊乱,这可能是瘢痕组织表皮结构与功能改变、愈合能力下降的原因之一.     

不同发育阶段人皮肤β1整和素及细胞角蛋白K19表达特征及其与创面修复结局关系的研究

严重烧创伤等所致皮肤损伤后的愈合能力随着人年龄的增大而逐渐降低,其原因涉及多方面,其中表皮细胞增殖分化潜能的改变可能是其重要原因之一.由于皮肤中β1整和素及细胞角蛋白K19仅在具有增殖与分化潜能的表皮干细胞和短暂扩充细胞上表达,本研究利用β1整和素和细胞角蛋白K19单抗,观察人胚胎期、幼儿期、成人期皮肤中表皮干细胞和短暂扩充细胞分布、数量的差异,并探讨这种差异特征与创面表皮再生能力随年龄降低的关系.分别取23～24周龄胎儿、4～10周岁幼儿、35～51岁三组全层皮肤.取材后即刻10％甲醛固定,常规石蜡包埋,切片5μm待用.采用免疫组织化学SP法,β1整和素和细胞角蛋白K19单抗分别购自Neo Markers和Maxim Biotech公司.β1整合素细胞膜染成棕黄色为阳性细胞,角蛋白细胞浆染成棕黄色为阳性细胞,同时设不加一抗的阴性对照.结果显示在胎儿期皮肤表皮基底层细胞β1整和素及角蛋白K19染色均为阳性,毛囊隆突部细胞β1整和素及角蛋白K19表达也均为阳性.幼儿期表皮基底层细胞中有部分细胞表达β1整和素及角蛋白K19,阳性细胞并非散在均匀分布,而是数个阳性细胞相对集中呈片状分布,β1整和素与角蛋白K19的表达规律相似.成年人表皮基底层中表达β1整和素及角蛋白K19的细胞也呈片状分布,阳性细胞率较幼儿组低,且染色强度较弱.本实验结果提示,胎儿期表皮基底层均为表皮干细胞和短暂扩充细胞,毛囊隆突部也含有大量的表皮干细胞和短暂扩充细胞,而幼儿期表皮基底层中仅有部分细胞为干细胞和短暂扩充细胞,成人期干细胞及短暂扩充细胞所占的比例则进一步降低.这可能与胎儿期皮肤的损伤在结构上能够完全修复,包括皮肤附件如毛囊、汗腺等也能完全再生,以及临床中幼儿皮肤损伤后再上皮化能力较成人强的现象有关.     

超薄表皮片移植细胞异位的初步研究

目的：了解超薄表皮片移植中干细胞的分化和分布的状况，初步探讨创面修复过程中细胞异位现象的存在。方法：超薄表皮片用中性蛋白酶分离自人环切术的包皮，反复冲洗使表皮干细胞脱落。分别用HE染色、免疫组化和DAPI标记后移植于8只裸鼠。第4天和第7天活杀取材，常规HE和石蜡与冰冻切片染色。用光学显微镜和荧光显微镜观察皮片的形态学改变，用免疫组化的方法评估表达角蛋白19和14细胞的分化和分布。结果：染色显示未移植皮片有正常的层次结构，但移植的皮片细胞层次有松弛紊乱的迹象，免疫组化显示CK14和CK19阳性细胞有异位现象；冰冻切片荧光显微镜下在基底层之外亦见有孤立成团同时双染的CK19阳性细胞。这些现象在移植后的第4天最为显著。结论：表皮细胞在超薄表皮片移植中显示出CK14和CK19阳性细胞有异位现象，这种特异性细胞的异位可能参与了创面修复以及之后表皮重塑。     

皮肤扩张过程中p63和细胞角蛋白的表达特征及意义

目的:初步观察皮肤扩张术对表皮细胞增殖分化的影响并探讨其机制。方法:用iWstar大鼠制作扩张动物模型,将72个扩张器埋于36只wistar鼠背部浅筋膜下,利用表皮干细胞特异表达p63和角蛋白19及短暂扩充细胞表达角蛋白14的特点,采用免疫组织化学Powervision M二步法检测扩张过程中表皮干细胞和短暂扩充细胞的分布与数量差异。结果:扩张皮肤表皮层增厚,表皮干细胞和短暂扩充细胞的数量明显增多,在棘层和颗粒层可见表皮干细胞和短暂扩充细胞的阳性表达。结论:皮肤扩张术能诱导表皮干细胞增殖分化,表皮干细胞在扩张过程中对机械应力和创伤修复的响应机制可能是其主要的生物学基础。     

正常皮肤和瘢痕组织表皮干细胞定位与增殖分化特征的比较性研究

目的采用特殊染色法研究少儿与成年人大面积重度烧伤后瘢痕组织表皮干细胞分布与表达β1整合素和角蛋白19、14、10(K19,K14,K10)的特征与规律,在此基础上确定表皮干细胞及短暂扩充细胞分布、数量的差异以及这些改变与瘢痕愈合关系.方法分别取4～12岁少儿及35～53岁成年人2组健康皮肤及大面积深度烧伤后瘢痕组织.采用免疫组织化学SP法检测表皮干细胞、短暂扩充细胞特异表达的β1整合素和K19以及分化表皮细胞表达的K14和K10.结果瘢痕组织表皮基底层表达β1整合素与K19的阳性细胞数较健康皮肤明显减少,阳性强度降低.瘢痕组织表皮中表达K14的阳性细胞仅位于表皮底部2～3层,明显少于健康皮肤,而K10表达阳性细胞则较健康皮肤分布广泛.结论瘢痕组织表皮基底层具有增殖能力的表皮干细胞和短暂扩充细胞明显少于健康皮肤,且瘢痕组织表皮干细胞的分化过程与健康皮肤不同,处于有丝分裂后分化阶段的细胞比例降低,而终末分化细胞的比例明显增高.提示瘢痕组织表皮的增殖能力下降,细胞的分化行为紊乱,这可能是瘢痕组织表皮结构与功能改变、愈合能力下降的原因之一.     

正常皮肤和瘢痕组织表达β1整和素与系列角蛋白特征的比较性研究

目的采用特殊染色法研究幼儿与成人大面积重度烧伤后瘢痕组织表皮细胞表达β1整和素和角蛋白19、14以及10的特征与规律,并在此基础上确定表皮干细胞及短暂扩充细胞分布、数量的差异以及这些改变与瘢痕愈合关系.方法分别取幼儿及成人健康皮肤与大面积深度烧伤后瘢痕组织.采用免疫组化方法检测表皮干细胞、短暂扩充细胞特异表达β1整和素和角蛋白19(K19)以及分化表皮细胞表达的角蛋白14与10(K14、K10).结果瘢痕组织表皮基底层表达β1整和素与K19的阳性细胞数较健康皮肤明显减少,阳性强度降低.瘢痕组织表皮中表达K14的阳性细胞仅位于表皮底部2～3层,明显少于健康皮肤,而K10表达阳性细胞则较健康皮肤分布广泛.结论实验结果提示,瘢痕组织表皮基底层具有增殖能力的表皮干细胞和短暂扩充细胞明显少于健康皮肤,且瘢痕组织表皮干细胞的分化过程与健康皮肤不同,处于有丝分裂后细胞阶段的细胞比例降低,而终末分化细胞的比例明显增高.提示瘢痕组织表皮的增殖能力下降,细胞的分化行为紊乱,这可能是瘢痕组织表皮结构与功能改变、愈合能力下降的原因之一.     

CK19表达及其在结肠癌淋巴结微转移诊断中的应用

目的：研究用免疫组化方法检测CK19及其在结肠癌淋巴结微转移诊断中的应用与临床病理意义。方法：取材于50例结肠癌病人肿瘤组织及癌周淋巴结255枚，同时进行HE染色组织学检查和抗角蛋白19抗体的免疫组化检测。结果：50例结肠癌组织中CK19表达均为阳性。255枚淋巴结用HE染色检查阳性者56枚(22．0％)，皆同时表达CK19阳性；另20枚淋巴结HE染色阴性，而CK19表达阳性。50例中有12例淋巴结中发现微转移，其中6例常规组织学检查属淋巴结转移阴性而免疫组化染色诊断表现为转移阳性。占常规病理检查淋巴结转移阴性者的21．4％(6／28)。随着肿瘤分期增加,淋巴结CK19表达阳性率亦增加。CK19表达阳性者预后较阴性者为差。结论：CK19免疫组化法是检测结肠癌淋巴结微转移的敏感而便捷的方法，而检测结肠癌微转移有助于判断肿瘤进展程度与预后。特别对在筛选组织学检查淋巴结阴性但存在微转移的病人有实用价值。     

波形蛋白、细胞角蛋白5,18,19在人胚胎前列腺发育不同阶段的表达及意义

目的 探讨波形蛋白（Vimentin），细胞角蛋白（Cytokeratin）5、18、19（CK5、18、19）在人胚胎前列腺发育不同阶段组织及细胞中的定位表达变化及其在前列腺胚胎发育中的意义。方法 应用免疫组织化学方法研究Vimentin、CK5、CK18、CK19在不同胎龄前列腺组织中的表达变化。结果 胚胎前列腺上皮细胞中波形蛋白随胎龄增大其表达呈由弱到强，又由强减弱的变化趋势；CK5和CK18的表达起初分布无规律，但是随胎龄增大，CK5和CK18逐渐分别定位表达于基底细胞层和管腔上皮细胞层；CK19则在基底细胞层和管腔上皮细胞层中均有表达，且强度较一致，基本不随胎龄增大而变化。结论 胚胎前列腺上皮细胞Vimentin的表达，可能有助于上皮细胞的游走迁移，以形成早期原始腺体。CK5、CK18以及CK19阳性细胞在原始腺体中的动态分布与胚胎前列腺上皮细胞的分化状态有关。     

CK19mRNA测定在乳腺癌腋淋巴结微转移诊断中的应用

研究敏感的方法检测乳腺癌腋窝淋巴结微转移。方法:对15例乳腺癌者的61个腋淋巴结和5个正常对照淋巴结同时进行HE染色组织学检查和CKl9逆转录-聚合酶链式反应(CK19RT-PCR)检测。结果:15例乳腺癌组织均有CK19mRNA表达,而5个正常淋巴结中均末见表达。61个腋窝淋巴结中7个组织学检查证实转移,其CK19mRNA亦表达阳性。组织学检测无转移的54个淋巴结中有12个CK19RT-PCR表达阳性,42个阴性;提示该12个淋巴结存在微转移只能用CK19RT-PCR方法检测出。经统计学分析,CK19RT-PCR与组织学检查二者有显著差异(X~2检验,P<0.01)。结论:CK19表达于恶性乳腺细胞,正常淋巴细胞无表达,CK19能作为组织特异基因进行RT-PCR扩增以检测乳腺癌腋淋巴结微转移。CK19 RT-PCR方法比组织学方法更敏感,特别对在筛选组织学检查淋巴结阴性而具有高度复发危险性的病人将有实用价值。     

人表皮干细胞改良培养及其组织工程皮肤的构建

目的：改良传统人表皮干细胞（hESCs）分离、培养方法,为组织工程皮肤构建提供产率更高、活力更好的种子细胞。方法：应用改良的酶消化法（改良法）及传统酶消化法（传统法）分离、培养hESCs,倒置显微镜观察细胞形态,MTT法绘制生长曲线、免疫组化法测定hESCs标志物角蛋白19（K19）和β1整合素的表达,并且进一步比较上述两种方法所获种子细胞构建的组织工程皮肤的形态学的特性。结果：台盼蓝染色显示改良法细胞消化分离数为92.25±15.61个,传统法细胞消化分离数为68.50±26.91个（P〈0.01）;改良法活细胞比率是（94±0.01）%,传统法活细胞比率是（75±0.04）%（P〈0.05）。在8天时改良法细胞MTT法OD值为1.300,传统法为0.779,改良法较传统法活力好,增殖快;细胞免疫组织化学染色显示表皮干细胞标志物角蛋白19（K19）和β1整合素均为阳性染色;HE染色结果显示采用改良法hESCs构建的组织工程皮肤表皮细胞复层层数为5～6层、基底细胞排列整齐,传统法hESCs构建的组织工程皮肤表皮细胞复层层数为3～4层、基底细胞排列散乱。结论：利用改良的酶消化法可获得数量更多、活力更好的人表皮干细胞,为以hESCs为种子细胞构建组织工程皮肤奠定基础。     

Experimental study on the effect of hypoxia on the expression of VEGF and TGF-beta1 of rat mandibular osteoblasts

OBJECTIVE: To observe the effects of cobalt chloride (CoCl2)-simulated hypoxia on VEGF and TGF-beta1 expression and to provide theoretical basis for deciphering the molecular mechanism of clinical distraction osteogenesis. METHODS: The mandibular osteoblasts were obtained from newborn Wistar rats within 24 hours and cultured and purified through modified enzymatic digestion. The morphological and histological changes of cells were evaluated by the HE staining, the histochemical staining for ALP, the collagen I immunohistochemistry staining and the calcified nodules staining, and the growth curves were drawn. The best cells of the 3rd-passage rats were treated with CoCl2, and then immunofluorescence was used to detect the expressions of VEGF and TGF-beta1 at 0, 3, 6, 9, 12 and 24 hours after culture. RESULTS: The HE staining demonstrated that the cellular forms were diverse, triangular, polygonal, circular and scaly and so on. The prominence varied in length and extended outwards. The nucleus was clearly discernible. The cytoplasma was rich and pink, with the nucleus royal purple. Sometimes 2 cell nuclei were seen. At the crowded place, cellular form was not clear, the dividing line was indistinct, and just the great-circle nuclear cells could be seen. The ALP immunohistochemistry staining demonstrated that the cell butcher nature appeared black pellets, the cell nucleus outline was unclear, and at the cell compact district, massive masculine cells could be seen clearly. The collagen I immunohistochemistry staining demonstrated that masculine cells were seen evenly, cytoplasma appeared yellowish brown especially around the nucleus. However, yellowish brown pellets were not seen in negative cells. The osteoblast calcium tubercle staining demonstrated that the cells gathered in the opaque region with the shape of tubercle after 15 days of culture. After alizarin red staining, the reddish orange pigmentation appeared. At various time points, weak VEGF fluorescence was seen in the cells in the control group under the laser confocal microscope. As the hypoxia time prolonged, VEGF fluorescence of cells in the experimental group intensified, and reached the peak 9 hours after operation, and then dropped to the normal level. At various time points, TGF-beta1 fluorescence was found in both groups under the laser confocal microscope, and fluorescence intensity in the control group was slightly stronger than that in the VEGF control group. In the experimental group, TGF-beta1 expression had short-term increase 3 hours after hypoxia, and reduced gradually with the prolonging of hypoxia time. CONCLUSION: The method of culturing osteoblast from Wistar rats mandibular is practicable. The cells can be used for further studies. Moderate hypoxia can affect bone synthesis and turnover in distraction osteogenesis and up-regulate the expressions of VEGF and TGF-beta1.     

黄褐斑病损的组织学特征及角蛋白10的表达

目的：研究黄褐斑皮肤的组织学改变及角蛋白10（CK10）的表达情况。方法：取黄褐斑患者睑袋术后外眦多余皮肤,行石蜡切片的HE染色、Fontana-Masson染色和CK10的免疫组化染色,观察此处皮肤的病理学改变和CK10的分布情况。结果：黄褐斑皮损处表皮变薄,基底层细胞周围可见明显色素颗粒,基底上层、毛囊上段、真皮层也有色素颗粒分布,真皮胶原紊乱、断裂,皮肤附属器数量较少。CK10主要分布在表皮的基底上层和皮脂腺细胞的胞浆和腺泡的外层。结论：黄褐斑病损皮肤各层黑色素含量增多,皮肤组织结构多有老化表现。CK10在基底上层表达增强,其表达增强可能与表皮细胞过度分化、皮肤老化有关。