森林脑炎病毒prM-E蛋白在昆虫细胞中的表达及免疫活性测定

目的为了表达森林脑炎病毒prME蛋白,为森林脑炎快速诊断试剂的研制奠定基础。方法经过RTPCR扩增、重组转移载体构建、细菌内转座和昆虫细胞转染,以杆状病毒昆虫细胞表达系统成功地表达了森林脑炎病毒MDJ01株prME蛋白。结果从感染细胞上清中电镜观察到重组蛋白形成的球型颗粒,说明重组病毒感染细胞后产生病毒样表达颗粒(viruslikeparticlesVLPs),并且分泌至细胞外。免疫印迹试验和间接免疫荧光试验表明,表达的重组蛋白能够与抗森林脑炎病毒抗体特异结合,具有良好的抗原性。ELISA和间接免疫荧光染色证实,重组prME蛋白可以作为抗原用于检测患者血清特异性抗体。结论在昆虫细胞中表达的prME具有良好的抗原性,本研究为森林脑炎快速特异诊断试剂研制奠定了基础。     

扎伊尔型、苏丹型埃博拉病毒TaqMan探针实时定量PCR核酸检测方法的建立

目的建立针对扎伊尔型(ZEBOV)及苏丹型埃博拉病毒(SEBOV)特异、灵敏和快速的Taq Man探针实时定量PCR核酸检测方法。方法选用世界卫生组织(WHO)参比实验室所使用的引物和探针序列,建立针对扎伊尔型及苏丹型埃博拉病毒的NP基因序列保守区的Taq Man探针实时定量PCR核酸检测方法,验证检测方法的灵敏性、特异性和稳定性,并与常规PCR检测方法进行比较。结果所建立的实时定量PCR方法可用于ZEBOV及SEBOV的特异性检测,较传统PCR方法反应快捷、灵敏,分别可达:ZEBOV 34拷贝/反应、SEBOV 24拷贝/反应;具有良好的特异性、稳定性和可重复性。结论建立了ZEBOV及SEBOV Taq Man探针实时定量PCR核酸检测方法,该方法可有望用于埃博拉病毒(EBOV)的实验室、临床及现场核酸检测。     

改良型富血小板纤维蛋白膜包裹颗粒软骨移植的长期组织学改变

文题释义：改良型富血小板纤维蛋白膜：是第二代富血小板浓缩制品富血小板纤维蛋白通过低速延时的方法得到的改良型富血小板纤维蛋白凝胶,再经过压制后得到的一种具有一定韧性的膜状物,可起到包裹作用,有利于细胞的增殖分化。 颗粒软骨移植：将自体软骨切成1.0-2.0 mm的颗粒状后移植于受区,但术后远期存在移植物吸收、变形等风险,目前国内外关于有效减少颗粒软骨移植后并发症等风险的报道仍然较少。背景：已有学者研究并制备了改良型富血小板纤维蛋白,并通过动物实验证实了改良型富血小板纤维蛋白可以促进自体软硬组织的再生与修复。目的：制备改良型富血小板纤维蛋白膜,观察改良型富血小板纤维蛋白膜及自体筋膜包裹颗粒软骨移植术后移植物的组织学改变。 方法：新西兰雄兔12只,均进行以下相同手术流程：制备改良型富血小板纤维蛋白膜,取兔左耳软骨组织及右后肢自体筋膜组织,制备成3种移植物：颗粒软骨;自体筋膜包裹颗粒软骨;改良型富血小板纤维蛋白膜包裹颗粒软骨。将移植物分别回植于兔背部皮下,术后4个月取出移植物,进行一般形态观察和组织病理学检测。 结果与结论：①自体筋膜和改良型富血小板纤维蛋白膜包裹颗粒软骨移植物厚度较颗粒软骨移植物厚,移植物外形较圆润,表面较平整;②改良型富血小板纤维蛋白膜包裹颗粒软骨移植物软骨细胞存活率和再生潜力明显优于另外2种移植物(P < 0.05);其他组织学参数各组之间无显著差异;③结果说明：改良型富血小板纤维蛋白膜包裹颗粒软骨移植能够提高颗粒软骨存活率和移植物塑形效果,减少移植后软骨再吸收。ORCID:0000-0002-4733-9912(杨银辉) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料;骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性;组织工程     

抗SARS冠状病毒中和活性单克隆抗体的筛选及其结合位点分析

目的 建立能分泌具有中和活性的抗SARS-CoV单克隆抗体（McAb）细胞株，制备有中和活性的抗SARS-CoV MeAb，用于SARS-CoV感染的早期特异诊断和进行SARS-CoV结构蛋白的功能研究。方法 用灭活纯化sARS-c0V（BJ01株）免疫BALB／c小鼠，通过细胞融合技术，建立能稳定分泌SAILS病毒MeAb的杂交瘤细胞系，然后用中和试验进一步筛选分泌具有中和活性的抗SARS-CoV MeAb细胞株。利用SARS-CoV的S和N蛋白的不同长度肽段通过EusA鉴定McAb的特异结合区域，分析S和N蛋白不同区域诱导产生抗体的能力和特性。结果 建立了12株能稳定分泌抗SARS-CoV McAb的杂交瘤细胞株，间接免疫荧光法检测抗体效价在1：320～1：20 480之间，其中6株具有较好的中和SARS-CoV的能力。具有中和活性的McAb中，3株是针对S蛋白的，2株是针对N蛋白的。其中抗S蛋白的中和抗体活性比抗N蛋白的中和抗体活性高，另外1株可能是针对SARS-CoV的其他结构蛋白的。进一步对6株抗S蛋白的McAb的特异抗原结合表位分析，发现其中3株结合位点在S蛋白第12～311氨基酸之间，2株在第310～535氨基酸之间，后者中和效价高于前者，另1株是针对S2蛋白的，SARS病毒的受体结合区正位于第310～535氨基酸这一区段。具有中和活性的McAb通过间接免疫荧光、ELISA、酶标免疫组化法和胶体金方法对SARS病毒进行检测，都显示出高度的特异性和良好亲和力。结论 成功制备了具中和活性的抗SARS-CoV单克隆抗体，并分别测定了McAb对S蛋白和N蛋白的特异抗原结合活性，初步确定了S蛋白的中和表位。为今后SARS病毒的特异诊断、结构蛋白的功能分析和重组疫苗的研制奠定了较好的基础。     

转化生长因子-β1,2在不同发育阶段皮肤组织中的定位及表达量的变化

目的:探讨转化生长因子-β_{1, 2}(TGF-β₁和TGF-β₂)与α-平滑肌肌动蛋白(α-ASMA)在胎儿和成人皮肤中的分布和表达变化规律。方法:20例被测标本中包括不同胎龄的胎儿皮肤15例和成人皮肤5例。用免疫组化方法和病理技术确定这3种蛋白在不同发育阶段皮肤中的定位和表达量。结果:在妊娠早期的胎儿皮肤中, TGF-β_{1, 2}和α-ASMA呈弱阳性表达, 随着胎儿生长发育, 这3种蛋白的阳性细胞率逐渐增大;在妊娠晚期胎儿和成人皮肤中这3种蛋白的表达量明显多于妊娠早期胎儿皮肤(P＜0.01)。TGF-β_{1, 2}的阳性信号主要存在于表皮细胞, 内皮细胞和部分成纤维细胞中, α-ASMA蛋白定位于肌成纤维细胞和汗腺上皮细胞内。结论:TGF-β₁和TGF-β₂可能在皮肤的发生、结构和功能的维持以及皮肤损伤后的修复中起重要作用。     

正常皮肤和瘢痕组织表皮干细胞定位与增殖分化特征的比较性研究

目的采研究少儿与成年人大面积重度烧伤后瘢痕组织表皮干细胞分布与表达β1整合素和角蛋白19,14,10(K19,K14,K10)的特征与规律。方法分别取4～12岁少儿及35～53岁成年人2组健康皮肤及大面积深度烧伤后瘢痕组织。采用免疫组织化学SP法检测表皮干细胞、短暂扩充细胞特异表达的β1整合素和K19以及分化表皮细胞表达的K14和K10。结果瘢痕组织表皮基底层表达β1整合素与K19的阳性细胞数较健康皮肤明显减少,阳性强度降低。瘢痕组织表皮中表达K14的阳性细胞仅位于表皮底部二三层,明显少于健康皮肤,而K10表达阳性细胞则较健康皮肤分布广泛。结论瘢痕组织表皮的增殖能力下降,细胞的分化行为紊乱,这可能是瘢痕组织表皮结构与功能改变、愈合能力下降的原因之一。     

人工晶状体植入术后虹膜和睫状体中肿瘤坏死因子αmRNA表达的实验研究

最新实验研究发现,人工晶状体植入术后房水内肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor,TNF)的含量将增高,且TNF在术后眼内炎性反应中发挥重要作用。为进一步探讨其机制,我们观察和研究了兔眼人工晶状体植入术后虹膜和睫状体组织中TNFα mRNA表达的规律,并探讨了其对术后眼内炎性反应的影响。     

缺血-再灌注诱导bcl2基因表达及其对肠道细胞凋亡的影响

目的：观察缺血再灌注肠道组织原癌基因ｂｃｌ２表达的特征、规律以及与肠道细胞凋亡发生的关系。方法：将１６只Ｗｉｓｔａｒ大鼠分成正常对照、肠系膜上动脉夹闭缺血４５分钟、肠系膜上动脉夹闭４５分钟与再灌注６小时和再灌注２４小时４组。用免疫组化法和末端脱氧核糖转移酶介导的生物素化脱氧尿嘧啶缺刻标记技术（ＴＵＮＥＬ技术）分别观察以上各组肠道组织细胞ｂｃｌ２基因表达与凋亡发生的关系。结果：肠系膜上动脉夹闭可以导致肠粘膜细胞凋亡发生增加与激活ｂｃｌ２基因表达。在正常肠道ｂｃｌ２表达为阴性,缺血可诱导ｂｃｌ２表达,并且在ｂｃｌ２表达增加的同时凋亡细胞逐渐减少。与再灌注６小时组相比,再灌注２４小时肠道组织ｂｃｌ２表达不仅强度明显增加,而且还有分布广泛与涉及多种组织的特点。结论：缺血再灌注激活ｂｃｌ２基因表达是体内最重要的抗凋亡机制之一。成纤维细胞生长因子减轻肠道凋亡现象可能与其激活和上调ｂｃｌ２基因表达有关     

西尼罗病毒NS1蛋白特异性单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备针对西尼罗病毒NS1蛋白的特异性单克隆抗体。方法:以原核表达的重组NS1蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠并通过常规杂交瘤技术将免疫后小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合。以真核表达的重组NS1蛋白为检测用抗原,建立间接ELISA检测方法筛选分泌NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。并利用Western blot和IFA试验对所获得的单克隆抗体进行鉴定。结果:共获得了2株稳定分泌NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为WN-1C10和WN-3D10,其亚类鉴定分别属于IgG2a和IgG1。这2株单克隆抗体均能与西尼罗病毒NS1蛋白和病毒抗原发生特异性反应,而与日本脑炎病毒无交叉反应。结论:本实验成功制备出针对西尼罗病毒NS1蛋白的特异性单克隆抗体,为我国建立西尼罗病毒与日本脑炎病毒的血清学鉴别诊断方法奠定了基础。     

肠缺血再灌注损伤后大鼠肝和肺组织bFGF和TGFβ基因表达的变化

目的观察大鼠肠缺血再灌注损伤后肝和肺的损伤程度与内源性ｂＦＧＦ和ＴＧＦβｍＲＮＡ表达量的变化规律，探讨两类生长因子在内脏损伤与修复中的作用．方法采用大鼠（ｎ＝１６）肠系膜上动脉夹闭模型，（缺血４５ｍｉｎ，再灌注６ｈ和２４ｈ）用原位杂交方法检测内源性ｂＦＧＦ和ＴＧＦβｍＲＮＡ表达水平．结果肠缺血４５ｍｉｎ再灌注６ｈ时，对肝、肺的损伤最严重，而此时内源性ｂＦＧＦ和ＴＧＦβｍＲＮＡ表达水平显著增高，达峰值；再灌注２４ｈ，肝，肺的损伤已基本恢复，内源性ｂＦＧＦ和ＴＧＦβｍＲＮＡ表达量也基本恢复至正常水平．结论内源性ｂＦＧＦ和ＴＧＦβｍＲＮＡ表达水平的变化与肝、肺的损伤程度呈正相关，表明这两类生长因子在内脏损伤后可能存在促进修复的作用．