γ干扰素对瘢痕疙瘩成纤维细胞转化生长因子β/Smad信号通路的作用

目的 了解γ干扰素(IFN-γ)对瘢痕疙瘩Fh(KFb)中TGF-β/Smad信号通路的作用,探讨IFN一γ治疗病理性搬痕的可能机制. 方法 切取3例患者的瘢痕组织,体外分离培养KFb,实验选用第3～5代细胞.(1)将KFb分为:对照组,加无血清DMEM培养;TGF-β_1组,用10 ng/mL的TGF-β_1单独作用;IFN-γ组,用100 ng/mL的IFN-γ单独作用;TGF-β_1+IFN-γ组,10 ng/mL的TGF-β_1与100 nS/mL的IFN-γ联合作用.采用实时荧光定量RT-PCR、蛋白质印迹法和免疫荧光细胞化学染色法,分别检测结缔组织生长因子(CTGF)的mRNA、蛋白表达,以及α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达与阳性细胞表达情况.(2)另取KFb,用10 ng/mL的IFN-γ作用,于作用前及作用后30 min和1、2、4、6、8 h通过实时荧光定量RT-PCR检测Smad 3和Smad 7的mRNA表达,于作用前及作用后1、2、4、6、8 h用蛋白质印迹法检测Smad 3和Smad 7的蛋白表达.(3)另取KFb,根据添加的IFN-γ终浓度不同分为1、10、100 ns/mL IFN-γ组,均作用4 h;设立未添加IFN-γ的KFb为对照组.同前检测各组Smad 3和Smad 7的mRNA及蛋白表达. 结果 (1)IFN-γ组KFb CTGF的mRNA和蛋白表达量为0.017±0.009与1.198±0.004,较对照组(0.024±0.013与1.229±0.011)显著减少(P<0.05);TGF-β1+IFN-γ组CTGF的mRNA和蛋白表达量为0.634±0.138与1.204±0.010,较TGF-β_1组(1.331±0.298与1.727±0.004)显著减少(P<0.01).IFN-γ组KFb中,α-SMA阳性细胞荧光强度(0.922±0.059)和α-SMA蛋白表达量(0.3051±0.0031)较对照组(1.055±0.005与0.4513±0.0094)显著减少(P<0.01);TGF-β1+IFN-γ组SMA阳性KFb荧光强度(1.129±0.004)和SMA蛋白表达量(0.6734±0.0098)较TGF-β_1组(1.270±0.005与1.38420.0024)显著减少(P<0.01).(2)10 ng/mL IFN-γ作用后第1个时相点,Smad 3的mRNA和蛋白表达量均出现一过性增高,随后降低,mRNA表达量于作用后4 h降至最低点,随后缓慢上升,至作用后8 h仍低于作用前(P<0.01);其蛋白表达量于作用后2~8 h显著低于作用前(P<0.01).而Smad 7的mRNA和蛋白表达量在INF-γ作用后逐渐增高,分别于作用后2、4 h达峰值随后降低,至作用后8 h仍高于作用前(P<0.05).(3)与对照组比较,1、10、100 ng/mL IFN-γ组Smad 3的mRNA及蛋白表达量显著减少(P<0.05或P<0.01),Smad 7的mRNA及蛋白表达量显著增加(P<0.05或P<0.01),且随IFN-γ浓度升高,减少或增高幅度愈为显著. 结论 IFN-γ呈时间和剂量依赖方式下调Smad 3、上调Smad 7,降低基础状态下或经TGF-β_1诱导后KFb的CTGF和α-SMA表达量,表现出对TGF-β/Smad 信号通路的显著拮抗作用,这可能是IFN-γ治疗病理性瘢痕的重要机制.     

热损伤角质形成细胞培养上清液对成纤维细胞生物学行为的影响

目的 了解KC热损伤后培养上清液对真皮Fb生物学行为的影响.方法 分离培养人真皮Fb,另建立KC(选用HaCaT细胞)热损伤模型.收集正常堵养及热损伤后12 h的KC培养上清液,用无血清DMEM以1:1体积比稀释,分别制成正常KC和热损伤KC 2种条件培养液.将Fb分别用无血清DMEM和2种条件培养液培养:(1)于培养12、24、36、48 h时,采用噻唑蓝法检测Fb增殖活性;(2)于培养12 h时,用流式细胞术检测Fb的凋亡情况(Fb预先致热损伤,并增设Fb伤后无处理对照);(3)培养24 h时,用免疫荧光法检测Fb胞质α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达情况,并用实时定量PCR法测定Fb α-SMA mRNA的表达.对实验结果进行单因素方差分析,用LSD-t检验行组间两两比较.结果 (1)Fb增殖活性:Fb经热损伤KC条件培养液培养12、24、36、48 h时,其吸光度值均高于同时相点用无血清DMEM培养的Fb(t值分别为1.89、2.35、2.02、1.94,P值均小于0.01);其中12、24、48 h时与用正常KC条件培养液培养的Fb比较,差异有统计学意义(12 h时t=1.83,P<0.01;24 h时t=2.91,P<0.05;48 h时t=1.83,P<0.05).(2)Fb凋亡检测:热损伤KC条件培养液培养的Fb与正常KC条件培养液培养以及伤后无处理的Fb比较,凋亡率均明显下降(t=3.31,P<0.05;t=1.47,P<0.01).(3)Fb胞质α-SMA表达:荧光显微镜下可见,用无血清DMEM或正常KC条件培养液培养的Fb中,α-SMA阳性表达(红色荧光)细胞较少;热损伤KC条件培养液培养的Fb中,α-SMA阳性表达细胞明显增多.(4)α-SMA mRNA表达:热损伤KC条件培养液培养的Fb α-SMA mRNA相对表达量为1.32±0.06,高于正常KC条件培养液培养的Fb(1.14±0.07,t=2.51,P<0.05)和无血清DMEM培养的Fb(1.00±0.09,t=1.77,P<0.05).结论 KC热损伤后12 h培养上清液可明显促进Fb增殖、抑制Fb凋亡、促进Fb向肌成纤维细胞转分化.     

γ-干扰素对成纤维细胞结缔组织生长因子mRNA水平的影响

目的:研究干扰素-γ(IFN-γ)对体外培养的成纤维细胞结缔组织生长因子(CTGF)mRNA表达的影响,探讨IFN-γ治疗病理性瘢痕的可能机制.方法:体外培养正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的成纤维细胞.采用转化生长因子β1(TGF-β1),IFN-γ及二者联合作用于成纤维细胞,用实时定量PCR方法检测成纤维细胞CTGF的mRNA水平.结果:对正常成纤维细胞、增生性瘢痕成纤维细胞和瘢痕疙瘩成纤维细胞,TGF-β1均可以上调其CTGF的mRNA水平(P<0.01),分别提高43倍、22倍和56倍;IFN-γ单独作用可以降低CTGF的mRNA水平,但实验组与对照组的差别无统计学意义;而与TGF-β1联合应用时,IFN-γ可显著拮抗TGF-β1对CTGF的上调作用(P<0.01),分别下调了66%,71.4%和52.4%.结论:IFN-γ可以拮抗TGF-β1对CTGF mRNA的上调作用,这可能是IFN-γ治疗病理性瘢痕的重要机制.     

胰岛素干预后脂肪干细胞旁分泌对人血管内皮细胞的作用

目的 了解胰岛素刺激后脂肪干细胞(ADSC)旁分泌因子的变化及其对人血管内皮细胞的作用.方法 (1)分离培养人ADSC,按照随机数字表法将细胞分为胰岛素刺激组(含终浓度1×10-7mol/L胰岛素的无血清DMEM培养液培养)和对照组(未加胰岛素的无血清DMEM培养液培养),每组6孔.3 d后收集ADSC培养上清液(ADSC-CM),ELISA法测定血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)表达量.(2)分离培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),将细胞按照随机数字表法分为4组,均采用内皮细胞专用培养液培养:胰岛素刺激ADSC-CM组,培养液中加入经胰岛素刺激后的ADSC-CM;无刺激ADSC-CM组,培养液中含无胰岛素刺激的ADSC-CM;胰岛素组,培养液中加入终浓度为1×10-7mol/L的胰岛素;空白对照组,培养液中不添加刺激因素.3 d后噻唑蓝法测定HUVEC增殖情况,数据用吸光度值表示.(3)另取HUVEC同上分为4组,培养12 h时,膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素双染色法测定细胞凋亡情况.(4)另取HUVEC同上分为4组后,体外细胞划痕法测定划痕后12、24、36、48 h时HUVEC迁移距离.对实验数据行t检验.结果 (1)胰岛素刺激组VEGF、HGF含量分别为(643±64)、(930±68)pg/mL,显著高于对照组的(287±47)、(577±84)pg/mL(t值分别为18.869、18.475,P值均小于0.05).(2)胰岛素刺激ADSC-CM组、无刺激ADSC-CM组吸光度值分别为0.847±0.042、0.798±0.022,均高于胰岛素组的0.665±0.028(t值分别为4.579、3.732,P值均小于0.01)及空白对照组的0.674±0.031(t值分别为3.761、4.073,P值均小于0.01);胰岛素刺激ADSC-CM组吸光度值较无刺激ADSC-CM组明显增高(t=2.576,P＜0.05).(3)胰岛素刺激ADSC-CM组、无刺激ADSC-CM组细胞凋亡率分别为(5.8±1.9)%、(9.0±2.0)%,均明显低于胰岛素组的(30.4±6.0)%(t值分别为12.891、10.417,P值均小于0.05)和空白对照组的(31.4±7.4)%(t值分别为11.474、9.783,P值均小于0.05);无刺激ADSC-CM组细胞凋亡率高于胰岛素刺激ADSC-CM组(t=8.548,P＜0.05).(4)划痕后36、48 h时,胰岛素刺激ADSC-CM组、无刺激ADSC-CM组HUVEC迁移距离明显长于胰岛素组与空白对照组,且胰岛素刺激ADSC-CM组细胞迁移距离大于无刺激ADSC-CM组(t值分别为4.076、4.573,P值均小于0.05).结论 胰岛素干预后ADSC旁分泌能更有效促进人血管内皮细胞增殖、迁移并抑制其凋亡,有利于组织血管化.

Abstract：

Objective To study the biological effects of the paracrine from ADSC after being stimulated by insulin on vascular endothelial cells. Methods(1) ADSC was isolated from human adipose tissue and cultured in vitro. The third generation cells were collected and divided into insulin group (1, cultured with serum-free DMEM containing 1 × 10-7 mol/L insulin) and control group (C, cultured with serum-free DMEM) according to the random number table, with 6 slots in each group. Three days later, ADSC culture medium (ADSC-CM) was collected for determination of levels of vascular endothelial growth factor (VEGF) and hepatocyte growth fator (HGF) by ELISA. (2) Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were cultured to the third generation, and they were cultured with special nutrient solution and divided into ADSC-CM with insulin stimulation group (AI) , ADSC-CM without insulin stimulation group (AC), insulin group(I, with same concentration as above), blank control group (BC) according to the random number table. Three days later, proliferation of HUVEC was determined with MTT method(with expression of absorbance value). Another two samples of HUVEC were respectively divided into 4 groups as above for determination of apoptosis rate with Annexin V/FITC double-staining 12 hours after culture, and H UVEC migration with scratch adhesion test at post scratch hour (PSH) 12, 24, 36, 48. Data were processed with t test.Results(1) Compared with those in C group [(287 ± 47) , (577 ± 84) pg/mL, respectively] , the secretion levels of VEGF and HGF in I group [(643 ±64) , (930 ±68) pg/mL, respectively] were significantly increased(with t value respectively 18. 869, 18. 475, P values all below 0.05). (2) The absorbance value of HUVEC in AI and AC groups was 0. 847 ± 0. 042, 0. 798 ± 0.022, respectively, which were higher than that in I and BC groups [0. 665 ± 0. 028(with t value respectively 4. 579, 3. 732) , 0. 674 ± 0.031(with t value respectively 3. 761, 4. 073) , P values all below 0. 01] , and that in AI group was higher than that in AC group(t =2.576, P ＜0.05). The apoptosis rates of HUVEC in AI and AC groups [(5.8±1.9)%,(9.0 ± 2.0)%, respectively] were obviously lower as compared with that in I and BC groups [(30.4 ±6. 0) %(with t value respectively 12. 891, 10.417),(31.4 ± 7.4) %(with t value respectively 11. 474,9. 783), P values all below 0. 05], and that in AC group was higher than that in AI group(t = 8. 548, P ＜0. 05). The distance of migration of HUVEC in AI and AC groups were greater than that in I and BC groups at PSH 36, 48, and that in AI group was greater as compared with that in AC group(with t value respectively 4.076, 4. 573, P values all below 0. 05). Conclusions Paracrine from ADSC after being stimulated by insulin can promote proliferation and migration of HUVEC, and suppress its apoptosis, and it is beneficial for tissue vascularization.     

人脐静脉血管内皮细胞体外培养的方法研究

目的建立人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)体外高效稳定培养的方法,为组织工程及相关医学基础研究提供稳定的细胞来源。方法取自愿捐赠足月妊娠分娩的新生儿脐带,用自制空针软管静脉注入0.1%Ⅱ型胶原酶,置于37℃培养箱中,消化收集,采用含5%FBS及1%内皮细胞生长因子(endothelial cell growth factor,ECGS)的内皮细胞专用培养基进行培养。将消化前后的脐带标本行HE染色,观察HUVECs脱壁情况;流式细胞仪检测原代细胞纯度;细胞培养期间于倒置相差显微镜下观察细胞形态;取第3代HUVECs行免疫细胞化学染色观察、MTT检测细胞增殖情况,并将细胞接种于细胞外基质胶Matrigel上培养24 h,观察细胞管腔形成情况。结果经Ⅱ型胶原酶消化后的脐带内HUVECs大量脱落,细胞消化完全。经Ⅱ型胶原酶37℃培养箱中消化15 min后,可获得纯度为99.56%的HUVECs;原代HUVECs培养后2～3 d生长最快,呈典型的铺路石或鹅卵石样排列,4～6 d融合成片。MTT法检测显示第3代HUVECs培养后3～4 d细胞生长最快,5 d左右融合;免疫细胞化学染色显示内皮细胞Ⅷ因子相关抗原表达阳性,培养24 h后在细胞外基质胶Matrigel上可见类似于毛细血管的完整闭合管腔形成。结论经自制空针软管静脉注入0.1%Ⅱ型胶原酶,使静脉充分充盈,内皮消化完全,采用含5%FBS和1%ECGS的内皮细胞专用培养基,可迅速获取大量高纯度、高存活率的HUVECs。     

成年大鼠许旺细胞快速扩增的改良方法

目的对三种来源不同的神经组织进行许旺细胞（SCs）培养，比较其纯度、增殖能力，以找到一个快速获取大量SCs的方法。方法取成年大鼠预变性坐骨神经、成年大鼠新鲜坐骨神经、新生大鼠坐骨神经，使用低浓度胰酶快速消化法结合差速贴壁法分别进行SCs培养，进行形态学观察、S-100免疫细胞化学鉴定，检测并比较各组SCs纯度及增殖能力。结果各组细胞生长状态良好，S-100染色阳性，SCs纯度分别为：成年预变性组98％，成年新鲜组92％，新生大鼠组93％。各组SCs生长曲线表明预变性组细胞较新鲜组及新生组SCs增殖旺盛。结论成年大鼠预变性坐骨神经制作取材方便、细胞量充足，纯度高、细胞增殖旺盛，可以被用作细胞生物学研究及组织工程等研究。     

胰岛素干预后脂肪来源干细胞分泌功能对HaCaT细胞生物学影响

目的 分离培养脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),探讨胰岛素刺激前后其分泌因子的变化及对人角质形成细胞株HaCaT细胞生物学影响.方法 从腹部外科手术患者自愿捐献皮下脂肪组织中分离、培养ADSCs,取第3代ADSCs调整密度为5×104个/mL,采用1×10-7mol/L胰岛素刺激作为A组,以未加胰岛素刺激作为B组,培养3 d后收集两组ADSCs培养上清液(conditioned medium of ADSCs,ADSC-CM),ELISA法测定其VEGF、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)含量.取人角质形成细胞株HaCaT细胞培养,将第4代细胞根据培养液不同分为4组.A1组:含A组ADSC-CM和2%FBS各0.5 mL:B1组:含B组ADSC-CM和2%FBS各0.5 mL;C1组:1 mL含终浓度为1×10-7mol/L胰岛素的2%FBS;D1组:仅含2%FBS 1 mL.培养3 d采用MTT法测定HaCaT细胞增殖情况:培养12 h Annexin V-FITC双染测定细胞凋亡情况;培养0、12、24、36、48 h采用体外细胞划痕法测定其迁移能力.结果 A组VEGF、HGF含量分别为(643.28±63.57)、(929.95±67.52)pg/mL,B组分别为(286.52±46.68)、(576.61±84.29)pg/mL,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).细胞增殖测定A1、B1组吸光度值分别为0.881±0.039、0.804±0.041,与C1组(0.663±0.027)及D1组(0.652±0.042)比较,差异有统计学意义(P＜0.01);A1组高于B1组(P＜0.05).A1、B1组凋亡率分别为5.23%±1.98%、8.82%±2.59%,均低于C1组(31.70%±8.85%)和D1组(29.60%±8.41%),差异有统计学意义(P＜0.05),但B1组凋亡率高于A1组(P＜0.05).A1、B1、C1和D1组36 h迁移距离分别为(0.184 6±0.019 2)、(0.159 8±0.029 4)、(0.059 2±0.017 6)及(0.058 2±0.012 3)mm,48 h分别为(0.231 8±0.174 0)、(0.205 1±0.012 1)、(0.079 2±0.008 1)及(0.078 4±0.0117)mm,两时间点A1组和B1组距离明显大于C1组和D1组(P＜0.01),A1组大于B1组(P＜0.05);其他时间点迁移距离差异无统计学意义(P＞0.05).结论 胰岛素干预后ADSCs能更有效促进HaCaT细胞增殖、迁移和抑制凋亡.     

人表皮干细胞改良培养及其组织工程皮肤的构建

目的：改良传统人表皮干细胞（hESCs）分离、培养方法,为组织工程皮肤构建提供产率更高、活力更好的种子细胞。方法：应用改良的酶消化法（改良法）及传统酶消化法（传统法）分离、培养hESCs,倒置显微镜观察细胞形态,MTT法绘制生长曲线、免疫组化法测定hESCs标志物角蛋白19（K19）和β1整合素的表达,并且进一步比较上述两种方法所获种子细胞构建的组织工程皮肤的形态学的特性。结果：台盼蓝染色显示改良法细胞消化分离数为92.25±15.61个,传统法细胞消化分离数为68.50±26.91个（P〈0.01）;改良法活细胞比率是（94±0.01）%,传统法活细胞比率是（75±0.04）%（P〈0.05）。在8天时改良法细胞MTT法OD值为1.300,传统法为0.779,改良法较传统法活力好,增殖快;细胞免疫组织化学染色显示表皮干细胞标志物角蛋白19（K19）和β1整合素均为阳性染色;HE染色结果显示采用改良法hESCs构建的组织工程皮肤表皮细胞复层层数为5～6层、基底细胞排列整齐,传统法hESCs构建的组织工程皮肤表皮细胞复层层数为3～4层、基底细胞排列散乱。结论：利用改良的酶消化法可获得数量更多、活力更好的人表皮干细胞,为以hESCs为种子细胞构建组织工程皮肤奠定基础。     

褪黑素在烫伤大鼠的抗氧化和抗炎作用

目的:研究早期应用褪黑素对于深Ⅱ度烫伤大鼠的抗氧化和抗炎的作用.方法:雄性sD大鼠30只,分为假烫组,烫伤组和烫伤 褪黑素治疗组(治疗组)每组10只动物.烫伤组和治疗组大鼠在背部造成30%体表总面积(TBSA)的深Ⅱ度烫伤,烫伤组和治疗组伤后平衡盐补液治疗.治疗组分别于伤后1 min,6 h,以10 mg/kg的剂量给予腹腔注射褪黑素溶液.各组于12 h采集血清标本检测丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)等反映自由基水平的指标;用ELISA方法检测TNF-α,IL-1β等炎症因子指标.于伤后12 h采集烫伤皮肤组织,用TUNEL和cagpase-3免疫组织化学检测残留毛囊细胞的凋亡情况.结果:与假烫组比较,烫伤组伤后12 h血清MDA显著升高,GSH明显下降;TNF-α,IL-1β含量显著增加(P<0.01).与烫伤组比较,治疗组12 h血清MDA含量降低了34%;GSH增加了37%;TNF-α下降了29%;IL-1β降低了35%(P<0.05).TUNEL显示烫伤组伤后12 h残留毛囊凋亡细胞率为(30.9±2.5)%,高于假烫组的(3.8±1.9)%,(P<0.01).而治疗组的毛囊凋亡细胞率降低为(20.2±2.4)%,低于烫伤组(P<0.05).caspase-3免疫组织化学显示了相似的凋亡趋势.结论:深Ⅱ度烫伤大鼠早期应用褪黑素,可以改善机体氧化应激水平、降低炎症反应进而具有保护毛囊细胞的作用.     

热损伤角质形成细胞培养上清对真皮成纤维细胞增殖与胶原mRNA表达的影响

目的 观察热损(创)伤后角质形成细胞(KC)培养上清对真皮成纤维细胞(Fb)增殖与胶原mRNA表达的影响.方法 建立KC热损伤模型,收集正常及热损伤12 h后培养上清配制不同浓度的细胞条件培养液;分离培养人正常Fb,实验组分别加入含不同浓度的细胞条件培养液,以单纯DMEM组为对照,采用噻唑蓝(MTT)比色法测定24 h后真皮成纤维细胞增殖;分别以流式细胞仪、实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)测定DMEM组、50%浓度条件培养液组相同时间Fb生长周期及Ⅰ型胶原mRNA表达.结果 细胞增殖测定:热损伤上清(10%、30%、50%、70%)条件培养液组A值(0.151±0.004、0.165±0.009、0.195±0.006、0.202±0.008)均高于正常上清(10%、30%、50%、70%)条件培养液组(0.144±0.004,0.159±0.002,0.180±0.005,0.181±0.006)及对照组(0.144±0.007),除10%浓度组外各实验组A值与对照组比较差异均有统计学意义(t值分别为:4.01、11.42、11.41;P＜0.05),热损伤上清与正常上清条件培养液组比较:50%、70%浓度组间差异有统计学意义(t值分别为:2.03、1.94;P＜0.05);热损伤上清条件培养液50%与70%浓度组间差异无统计学意义(t值为1.34;P＞0.05).细胞周期测定见50%浓度热损伤上清组可明显促进Fb通过G1/S及S/G2限制点,S期及G2/M期细胞与对照组比较增多,G0/G1期细胞与对照组比较明显减少(t值分别为:5.87、11.3、4.86;P＜0.05).Ⅰ型胶原mRNA表达测定中,50%浓度热损伤上清组与对照组比较表达明显上调,差异亦有统计学意义(t=1.72;P＜0.05).结论 热损(创)伤后KC上清液可促进Fb的增殖,同时可上调Ⅰ型胶原mRNA的表达.

Abstract：

Objective To observe the effects of heat injured keratinocyte (KC) supematant on proliferation activity and collagen mRNA expression of the normal fibroblast (Fb).Methods A model of heat injured KC in vitro was reproduced,the supernatants of heat injured KC were collected and used as conditioned medium,and DMEM was used as control medium.Normal Fb were treated with different concentrations of conditioned medium.After treatment for 24 h,the proliferation activity,cell cycle and collagen Ⅰ mRNA levels in treated Fb were measured by using methylthiazol tetrazolium ( MTT),flow cytometry (FCM) and real-time polymerase chain reaction (PCR) techniques.Results As compared with the control group,the absorbance (A) values of MTT in treated groups were significantly increased (t = 4.01,11.42,11.41 ;P ＜0.05),except in 10% group (t = 1.34,P ＞0.05).As compared with normal supernatant treated group (0.159 ± 0.002,0.180 ± 0.005,0.181 ± 0.006),the A values in 50% and 70% conditioned medium group (0.195 ± 0.006,0.202 ± 0.008 ) were significantly increased ( t = 2.03,1.94;P ＜0.05).The 50% conditioned medium increased the percentage of G1 to S and S to G2 phase transit.As compared with control group,the number of cells in S and G2/M phase was increased significantly (t =5.87,11.3;P＜0.05 ) and that in G0/G1 phase decreased significantly ( t = 4.86;P＜0.05 ).Real-time PCR revealed that the collagen Ⅰ mRNA level in 50% conditioned medium group was significantly up-regulated (t= 1.72;P＜0.05 ) as compared with control group.Conclusion Heat injured KC supernatant may promote the proliferation of dermal Fb,and up-regulate the mRNA expression of collagen.