应用单克隆抗体—免疫磁珠分离系统分离纯化再生障碍性贫血骨髓CD34^＋细胞

目的 分离、纯化再生障碍性贫血(简称AA)患者骨髓CD34^ 细胞，探讨其发病机制。方法 对42例AA患者，以常规方法进行骨髓液采集和有核细胞分离，用单克隆抗体—免疫磁珠分离系统(MACS)分离、纯化骨髓CD34^ 细胞，用碱性磷酸酶—抗碱性磷酸酶(APAAP)法作CD34^ 细胞的纯度检测。结果 骨髓CD34^ 细胞纯度达95％—99％，AA患者骨髓CD34^ 细胞多呈单个、散在分布，着色较淡；而对照组骨髓CD34^ 细胞多呈均匀或丛簇状分布，着色较深。结论 应用MACS分离从骨髓CD34^ 细胞，特异性强、纯度高，是研究从骨髓CD34^ 细胞功能、形态的最直接、客观、准确的方法。     

应用免疫磁珠法富集慢性髓性白血病骨髓CD34^＋细胞

利用免疫磁珠法 (MACS)富集慢性髓性白血病骨髓单个核细胞 (MNC)中的CD34 细胞 ,用流式细胞术检测富集前后CD34 细胞纯度。结果表明 ,富集前CD34 细胞纯度为 2 .3 %± 0 .4% ( x±SD ,下同 ) ,富集后纯度为 90 .68%± 3 .0 2 % ,仍保持细胞活力。该法简便、快速、富集纯度高 ,为分离纯化CML骨髓中的CD34 细胞提供了有效方法。     

DNA末端原位标记技术研究慢性再生障碍性贫血骨髓CD_(34)~+细胞凋亡

目的　观察慢性再生障碍性贫血 (CAA)患者骨髓CD3 4+ 细胞凋亡状况 ,探讨CAA可能的发病机制。方法　采用单克隆抗体 -免疫磁珠分离系统 (MACS)分离纯化 39例CAA患者的骨髓CD3 4+ 细胞 ,用DNA末端原位标 (TUNEL)技术分析骨髓CD3 4+ 细胞原位凋亡状况。结果　CAA患者骨髓细胞的凋亡率为 (39.2 4± 12 .70 ) % ,健康对照组为 (8.5 0± 2 .30 ) % ,组间比较差异有显著性 (P <0 .0 1)。凋亡细胞可见核染色质皱缩、凝聚 ,但未见到核碎裂现象及典型的凋亡小体。结论　CAA患者骨髓CD3 4+ 细胞的过度凋亡是其质或 /和量缺陷的原因之一     

小鼠CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的分离纯化及鉴定

目的:调节性T细胞(Treg)是近年来免疫学研究的热点.文中研究获取高纯度Treg的方法及其表型的鉴定.方法:流式细胞术(FACS)分析正常小鼠脾脏中CD4+、CD4+CD25+、CD4+CD25-3个细胞亚群的表型;采用二步磁性细胞分选法(MACS)纯化小鼠脾细胞中CD+CD25+Treg,并对分离后的细胞表型进行鉴定.结果:①依CD25表达水平不同将小鼠天然CD4+T细胞划分为3群,转录因子Foxp3、细胞毒T淋巴细胞相关分子-4( CTLA-4/CD152)、糖皮质激素诱导肿瘤坏死因子受体(GITR )、CD69在CD4+CD25+细胞亚群呈显著性高表达(P<0.01),CD4+CD25+T细胞主要存在于CD45RB低表达细胞亚群,CD28的表达在CD4+CD25+细胞亚群明显下降(P<0.05).②使用二步MACS法从正常小鼠脾脏中分离CD4+CD25+T淋巴细胞的得率为1%～1.2%,纯度为87.29%～92.04%.FACS分析结果显示,Foxp3优先表达于CD4+CD25+T细胞亚群,表达率为(66.60±1.03) %,而在CD4+和CD4+CD25-T细胞亚群呈低水平表达,分别为( 23.97±2.00)%和(16.78±3.24%).CTLA-4在CD4+CD25+T细胞亚群表达率为(77.37±1.67) %,明显高于在CD4+ 和CD4+CD25-T细胞亚群的表达[(21.97±2.39)%和(18.04±3.16)%].纯化的CD4+CD25+T细胞亚群表现为CD127的低表达.结论:MACS阴性加阳性二步分选法避免激惹CD4分子,可获得高纯度且具有天然CD4+CD25+ Treg细胞表型及功能特征的细胞.     

免疫磁珠分离法分选提纯骨髓造血干细胞CD117

目的：探讨用免疫磁珠分离法（magnetic activated cell sorting,MACS）从小鼠股骨、胫骨分离纯化骨髓造血干细胞CD117的方法。方法：收集小鼠骨髓细胞,台盼蓝染色观察其活力,用免疫磁珠分离法分选CD117细胞,流式细胞仪检测荧光标记CD117表达阳性率。结果;未分选前CD117细胞纯度为（41.56±18.77）%,MACS分选CD117细胞纯度（88.68±4.74）%,纯化前后有明显差异（P〈0.05）。结论：MACS阳性选择法分选系统能有效分选骨髓造血干细胞CD117。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及表型和功能特点

目的 建立体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的方法，探讨其表型和功能特点。方法 用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSCs，传代扩增，测定生长曲线，通过形态学观察，细胞化学及免疫细胞化学法分析大鼠骨髓MSCs的表型和功能特点。结果 MSCs属骨髓中单个核细胞，密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓MSCs，在含10％小牛血清的L-DMEM中，1、3、5代细胞生长曲线基本相同，增殖快，每传代一次细胞约增加2．2倍。细胞呈均一的成纤维细胞样，表达CD44、CD54、纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)、Ⅰ型胶原(collagenⅠ)。加入地塞米松(Dex 10^-8mol／L)、β-甘油磷酸钠(β-GP 10mmol／L)、抗坏血酸(AA50μg／ml)可诱导MSCs分化为成骨细胞，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性增高，形成矿化结节。结论 所分离、培养的细胞具有间充质干细胞的表型和功能特点，建立了体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓MSCs的方法。     

DNA末端原位标记技术研究慢性再生障碍性贫血骨髓CD34^＋细胞凋亡

目的观察慢性再生障碍性贫血(CAA)患者骨髓CD34+细胞凋亡状况,探讨CAA可能的发病机制.方法采用单克隆抗体-免疫磁珠分离系统(MACS)分离纯化39例CAA患者的骨髓CD34+细胞,用DNA末端原位标(TUNEL)技术分析骨髓CD34+细胞原位凋亡状况.结果CAA患者骨髓细胞的凋亡率为(39.24±12.70)%,健康对照组为(8.50±2.30)%,组间比较差异有显著性(P＜0.01).凋亡细胞可见核染色质皱缩、凝聚,但未见到核碎裂现象及典型的凋亡小体.结论CAA患者骨髓CD34+细胞的过度凋亡是其质或/和量缺陷的原因之一.     

免疫磁珠分选系统在急性髓系白血病干细胞分离中的应用

目的：采用免疫磁珠分选系统（MACS）分离人白血病骨髓CD34^＋、CD38^-干细胞群。方法：收集人白血病骨髓，Percoll密度梯度离心分离单个核细胞，CD34、38磁性标记，MACS分离纯化CD34＋、CD38^-干细胞群，流式细胞仪检测其纯度和分选前后CD34^＋、CD38^-百分比，计算回收率。结果：分选后的CD34^＋、CD38细胞纯^-度达72．6±3．2％，回收率85．8±1．2％。结论：免疫磁珠分选系统是一种有效的白血病干细胞分离提纯方法，所得细胞纯度比较高。     

中西医结合治疗对慢性再生障碍性贫血患者骨髓CD_(34)~+细胞凋亡的影响

目的　探讨中西医结合治疗慢性再生障碍性贫血 (CAA)的临床疗效及作用机理。方法将 79例CAA患者随机分为治疗组 (40例 )和对照组 (39例 )。对照组单用西药治疗 ,治疗组用补肾活血通络方加西药治疗。并分别于治疗前后采用免疫磁珠分离系统 (MACS)分离纯化骨髓CD3 4 + 细胞 ;用DNA末端原位标记 (TUNEL)技术分析骨髓CD3 4 + 细胞原位凋亡状况。结果　治疗组与对照组的基本治愈率、缓解率、总有效率分别为 37.50 %、2 5 .0 0 %、87.50 %和 2 0 .51 %、1 7.95 %、61 .54 %。 2组疗效比较有非常显著性差异 (P <0 .0 1 )。治疗前 2组骨髓CD3 4+ 细胞的凋亡率较健康组明显增高 (P <0 .0 1 ) ,治疗后治疗组骨髓CD3 4+ 细胞的凋亡率较治疗前明显降低 (P <0 .0 1 ) ,与对照组比较有非常显著性差异(P <0 .0 1 )。结论　中西医结合治疗CAA疗效高、毒副作用小。其作用机制可能是通过阻抑CAA患者造血细胞的过度凋亡 ,使骨髓造血功能重建     

愈障汤对慢性再生障碍性贫血患者骨髓CD_(34)~+细胞bcl-2表达的影响

目的　探讨愈障汤治疗慢性再生障碍性盆血 (CAA)的作用机制。方法　对愈障汤治疗的 39例CAA患者分别于治疗前后采用磁式细胞分选器 (MACS)分离纯化骨髓CD3 4+ 细胞 ;采用SABC亲和细胞法和CMIAS系列多功能真彩图像分析仪检测骨髓CD3 4+ 细胞bcl 2的表达 ,并与 2 6例健康对照组比较。结果　CAA患者骨髓CD3 4+ 细胞bcl 2蛋白表达的阳性率和OD值治疗前均较健康组减低 (P <0 .0 1) ,治疗后显著升高 (P <0 .0 1) ,bcl 2蛋白表达与临床疗效呈正相关。结论　愈障汤治疗CAA的作用机制可能是通过上调凋亡抑制基因bcl 2的表达 ,从而阻抑了骨髓CD3 4+ 细胞的过度凋亡。     

Liposome-mediated Functional Expression of Multiple Drug Resistance Gene in Human Bone Marrow CD34＋ Cells

Myelosuppressionisanimportantdose limitingfactorformostofchemotherapeuticagentsinclinicalpractice.OverexpressionofP glycoprotein (P gp)encodedbyMDR1geneisaccompaniedbyfunctionaldrugresistance.TheexpressionofP gpisconsistent lylowinnormalbonemarrowcells,an…     

CD133 在骨髓增生异常综合征患者中的表达及临床意义

摘要：目的探讨骨髓增生异常综合征（MDS）患者骨髓中CD133的表达及其临床意义。方法应用流式细胞仪采用直接
免疫荧光标记法,分别测定31例难治性贫血伴幼稚细胞增多（RAEB）、10例难治性血细胞减少伴多系发育异常（RCMD）
以及11例再生障碍性贫血患者骨髓中CD133+细胞和CD34+/CD38-细胞比例,对比分析CD133及CD34/CD38在不同亚型
MDS中的表达及临床意义。结果在RAEB型MDS患者骨髓有核细胞中,CD133阳性细胞平均占6.75%,RCMD患者平
均占1.41%,而再生障碍性贫血对照组占2.70%,RAEB组显著高于其他两组（P<0.05）;再障对照组与RCMD组之间无显
著性差异（P>0.05）;CD34+/CD38-细胞比例在3组中均小于1%,统计学上无显著性差异（P>0.05）。结论CD133在MDS
的进展类型RAEB患者骨髓细胞中高表达,CD133有助于RAEB分型诊断;而CD34+/CD38-标记在MDS分型诊断中并无
价值。     

再生障碍性贫血和难治性贫血的临床观察

目的：探讨慢性再生障碍性贫血(CAA)和骨髓增生异常综合征—难治性贫血(MDS—RA)之间的差异和鉴别．方法：对61例CAA和21例MDS—RA患者的临床资料进行回顾性比较观察。结果：在MDS—RA组患者中骨髓幼稚前体细胞异常定位和网硬蛋白阳性率高于CAA组，骨髓碱性磷酸酶积分、CD16^ 和CD19^ 细胞数低于CAA组．结论：CAA和MDS—RA的鉴别诊断需结合临床表现和骨髓涂片、病理活检等综合考虑。     

多发性硬化患者造血干/祖细胞及其亚群富集纯化的研究

目的：获得高纯度造血干／祖细胞(HSC／HPC)及其亚群,用于多发性硬化(MS)造血干细胞移植治疗和生物学特性的研究．方法：用免疫磁珠法(MiniMACS)从MS患者骨髓中富集CD34^ 细胞后再用荧光激活细胞分选(fluorescent acti—vated cell sorter,FACS)纯化CD34^ ／CD38^ 和CD34^ ／CD38^-细胞亚群．结果：MiniMACS分选的CD34^ 细胞群纯度达91％,FACS分选的CD34^ ／CD38^-和CD34^ ／CD38^ 两细胞亚群纯度可达98％以上．结论：MiniMACS和FACS两者结合可迅速大量纯化HSC／HPC及其重要细胞亚群,可用于临床MS造血干细胞移植、基因治疗和研究HSC／HPC及其亚群生物学特征．     

再生障碍性贫血造血细胞Fas抗原表达与T淋巴细胞功能的研究

目的 研究造血细胞凋亡与T淋巴细胞免疫在再生障碍性贫血(再障，Aplastic anemia，AA)发病机制中的作用及两者相关性。方法 采用流式细胞仪测定40例AA患者和15例非血液、免疫系统疾病对照者骨髓单个核细胞(BMMNC)的总CD34^ 、CD34^ Fas^ 、CD34^ Fas^-、CD3^ 、CD8^ 、CD3^ 、CD3^ CD25^ 标记值。结果 (1)与对照组比较，AA组总CD34^ 细胞％明显减少而其Fas表达率(以占总CD34^ 细胞％为计)明显增高。(2)AA组CD34^ 细胞％数与其Fas抗原表达率无明显负相关。(3)AA组T细胞％明显增多，且以CD8^ 细胞和CD3^ CD25^ 细胞增多为主。(4)AA组CD34^ 细胞％数与其T细胞活化状态无显著负相关。(5)AA组CD34^ 细胞Fas表达率与其T细胞活化状态无显著正相关。结论 AA骨髓存在着造血细胞数量减少和T淋巴细胞亚群数量、功能的异常，造血细胞数量减少还可能与Fas以外途径诱导的凋亡过度有关。骨髓造血细胞凋亡过度可能有活化T淋巴细胞免疫以外的途径诱导Fas途径或活化T淋巴细胞可以通过Fas之外的途径诱导造血细胞凋亡。     

Immunophenotype of myeloid cells in myelodysplastic syndromes and its clinical implications.

OBJECTIVE: To explore the immunophenotype of myeloid cells in myelodysplastic syndyomes (MDS) and its clinical implications. METHODS: A panel of monoclonal antibody was used to detect CD13+, CD33+, CD15+ and CD14+ antigens on the membrane surfaces of myeloid cells in the bone marrow from 51 MDS, 21 aplastic anemia (AA), 21 paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) patients. 10 acute myeloblastic leukemia (AML) patients and 15 normal subjects by immunoenzymatic assay. The morphology and chromosome karyotype of bone marrow cells of MDS patients were also examined. RESULTS: CD14+, CD13+ and CD33+ cells in the bone marrow were more in MDS patients than in normal controls, AA patients and PNH patients. CD15+ cells in the bone marrow were less in MDS patients than in normal controls. CONCLUSIONS: The percentages of CD14+, CD13+ and CD33+ positive cells in the bone marrow of MDS patients were related to the percentage of myeloblasts, the chromosomal aberrations and the response to treatment. It indicated that there is immunophenotypic misexpression of myeloid cells in MDS patients. Immunophenotype analysis of myeloid cells might be useful for the diagnosis and treatment of MDS patients.     

腺病毒介导CTLA4Ig基因修饰对骨髓基质细胞功能的影响

目的　通过腺病毒介导CTLA4Ig基因修饰骨髓基质细胞 (bonemarrowstromalcells,BMSCs) ,探讨基因修饰对BM SCs主要功能的影响。方法　以CTLA4Ig 重组腺病毒转染BMSCs,通过测定粘附于BMSCs层的3 H TdR标记CD34+ 细胞的cpm值 ,观察基因修饰对其粘附力影响 ;通过观察骨髓基质细胞支持CD34+ 扩增的细胞总数及集落形成细胞数 (colonyformingcell,CFC)的变化 ,评价基因修饰对BMSCs支持CD34+ 细胞扩增能力的影响。结果　转染组与对照组BMSCs对CD34+ 细胞的粘附力及支持CD34+ 细胞扩增的能力均无显著差异 (P >0 .0 5 )。结论　适当条件下 ,腺病毒介导CTLA4Ig基因修饰BMSCs不影响其对CD34+ 细胞的粘附力及支持CD34+ 细胞扩增的能力     

rhBMP-2对再生障碍性贫血小鼠骨髓造血恢复的促进作用

探究了人重组骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)对再障小鼠的治疗作用。采用5-FU联合白消安建立小鼠再障模型,通过干预rhBMP-2进行治疗。考察了各实验组小鼠白细胞数、骨髓单核细胞数、体重、存活率、脾系数、粒系-巨系细胞集落(CFU-GM)数以及骨髓单核细胞中CD34⁺细胞比例,进行股骨、脾脏HE切片分析。结果表明,相较于再障对照组,rhBMP-2治疗组小鼠的白细胞数、存活率、CFU-GM集落数及骨髓单核细胞数显著提高,并且骨髓单核细胞中的CD34⁺细胞含量也提高,显著改善脾脏功能和缓解骨髓抑制,证实rhBMP-2能够促进再障小鼠造血损伤的修复。