C型乙型肝炎病毒基因SOEing法引入228位点突变

目的为获取乙型肝炎病毒(HBV)基因分型芯片病毒靶序列,对C型HBV第228位碱基进行点突变。方法通过不同基因型HBV全基因组的序列比对分析,显示基因型A,C,D,G在228位上的碱基为G,而基因型B,E,F,H为A,所以检测该位点的碱基类型可以实现HBV基因型的初步分型。结果将C型乙肝病毒第228位上的单位碱基由G突变为A,经测序后证明突变成功。结论重叠区扩增基因拼接法(SOEing)是一种简便引入点突变的方法,可以应用此法制备HBV基因分型芯片检测基因片段序列。     

基因分型同耐药位点突变在乙型肝炎的相关性探讨

目的分析探讨基因分型同耐药位点突变在乙型肝炎的相关性。方法选取我院2010年2月-2014年2月收治的慢性乙型肝炎患者350例,采取聚合酶链反应-反向点杂交方法检测患者耐药位点和基因分型,收集患者性别、年龄、血清乙型肝炎病毒(HBV)DNA载量、ALT指标、核苷酸类似物用药时间以及HBe Ag指标等临床资料进行统计学分析。结果 350例患者标本均成功扩增阳性条带,肝炎病毒基因分型如下:B型261例,C型80例,D型9例;应用核苷酸类似物的310例患者中265例均为完全野生型,其余45例耐药突变点主要以204,204/180位点为主,未用核苷酸类似物的40例患者未见耐药点突变现象。耐药突变和患者年龄、性别、HBV DNA载量、ALT指标、HBe Ag等无明显相关性(P0.05),与患者应用核苷酸类似物有关,且时间越长,突变概率越大(P0.05)。结论 HBV基因分型主要以B型为主,PCR-反向点杂交方法可有效的对突变位点和基因分型进行检测,突变位点与核苷酸类似物有关,对临床上患者用药具有重要的指导意义。     

河北省石家庄地区HBV基因分型及耐药突变分析

目的 探讨石家庄地区经各种核苷(酸)类似物治疗的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)基因型、基因耐药突变位点分布和基因耐药情况。 方法 选择CHB患者1 157例,收集患者的基本资料,采用基因测序技术检测患者基因分型和基因耐药突变位点,对检测结果进行统计分析。 结果 石家庄地区CHB患者的基因分型以C型为主,少量为B型。石家庄地区CHB患者中HBV基因分型B型和C型分布比例差异无统计学意义(P＞0.05);不同年龄间HBV基因分型B型和C型分布比例差异有统计学意义（P＜0.05）,41~60岁患者HBV基因分型C型占比最高。未发生基因突变172例,单基因位点突变393例,2个基因位点突变361例,3个基因位点突变174例,4个基因位点突变42例,5个基因位点突变10例,6个基因位点突变3例,7个基因位点突变1例,9个基因位点突变1例;基因型分布特点随突变位点数的增多HBV基因分型B型和C型比例差异无统计学意义(P＞0.05)。发生突变的985例患者共检出1 889个突变位点,检测的14个基因位点中,M204I/V/S、L180M、A181V/T/S突变率为14个基因位点发生突变的前3位,不同基因位点中HBV基因分型B型和C型比例差异无统计学意义(P＞0.05) 。发生突变的985例患者对拉米夫定(lamivudine,LAM),替比夫定(telbivudine,LDT),阿德福韦酯(adefovir,ADV)及恩替卡韦(entecavir,ETV)4种核苷(酸)类似物耐药模式共检出11种,其中对单一药物发生耐药有3种模式,对2种药物发生耐药的有4种模式,对3种药物发生耐药有3种模式,还有一种是对4种药物均发生耐药。不同耐药模式患者HBV基因分型B型和C型比例差异无统计学意义(P＞0.05)。 结论 石家庄地区CHB患者感染的基因分型以C型为主,且发生的基因耐药突变以多重耐药为主。     

乙醛脱氢酶2基因G1510A多态位点等位基因的克隆及应用

目的 克隆乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因G1510A多态位点(rs671位点)的野生型和突变型等位基因,为该位点的基因分型提供参照品.方法 分别以经测序证实的rs671位点野生型纯合子和突变型纯合子样品为模板,PCR扩增跨越该位点的DNA片断,采用胶回收试剂盒纯化PCR产物,T-A克隆构建重组质粒,PCR和测序验证重组质粒是否构建成功,PCR-RFLP法检验其应用效果.结果 PCR和测序均证实目的基因被成功克隆,将重组质粒用于PCR-RFLP法基因分型之中,能正确区分样品的基因型.结论 成功构建了rs671位点的野生型和突变型等位基因重组质粒,可用作该位点基因分型的参照品.     

HBV X-HCV C融合基因重组腺病毒的构建及鉴定与表达

目的:应用重叠区扩增基因拼接法(gene SOEing)获得HBV X-HCV C融合基因,构建HBV X-HCV C融合基因重组腺病毒。方法:应用gene SOEing法扩增HBV X-HCV C融合基因并将其克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,获得重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-XC,经PmeⅠ酶切线性化后电转化BJ/AdEasy菌,构建重组腺病毒质粒pAd-XC;鉴定正确的pAd-XC经Pac I酶切线性化后脂质体法转染293细胞进行包装,扩增,利用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)监测病毒滴度和感染效率,Western-blot法检测目的蛋白的表达。结果:测序结果显示,pAdTrack-CMV-XC构建成功;PCR及Pac I酶切鉴定结果表明pAd-XC构建成功;经Pac I酶切线性化的pAd-XC转染293细胞后24 h即可观察到GFP的表达;回收的病毒可重复感染293细胞,Western-blot法检测到目的蛋白的表达,证实有感染能力且可表达目的蛋白的病毒颗粒包装成功。结论:HBV X-HCV C融合基因重组腺病毒构建成功,为进一步研究HBV X蛋白和HCV C蛋白的生物学功能奠定了基础。     

APOBEC3F基因多态性与HBV感染易感性关系的探讨

目的探讨载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽3F（APOBEC3F）基因多态性与慢性乙型肝炎易感性的关系。方法提取179例HBV感染者及224例健康者外周血基因组DNA,采用PCR技术,扩增包含APOBEC3F第4外显子的片段,应用DNA测序技术对各组多态位点进行分型,计算各组等位基因频率。结果测序结果显示,APOBEC3F第四外显子-498位点、-532位点、-552位点在检测人群中不存在多态性,第-536位点基因发生T-C突变,两组差异有统计学意义（χ2=45.906,OR=0.260,95%C（I 0.173,0.391）,P=0.000）。结论 APOBEC3F基因第4外显子-536位点T-C突变可能与HBV感染易感性有关。     

1012例乙肝病毒患者HBV P区基因位点变异分析

目的研究人群中乙肝病毒（HBV）P区位点突变发生的频率和持点。方法通过高保真PCR扩增1012例乙肝病毒患者HBV的P区基因片段,采朋双脱氧末端终止法进行洲序,分析HBV P区169、173、180、181、184、194、202、204、233、236和250共11个位点的变异情况。结果HBVP区204和180位点突变频率较高;其次是181和236位点;其余位点突变频率很低。在男性患者中,204位点和180位点突变率相对较高;女性患者中存在同样的情况：30岁以下患者与31至60岁患者相比较,181位点变异率差异较大（P〈0．01）：其余无显著差异（P〉0．05）,结论HBV P区位点突变主要集中在180、181、204和236位点。不同性别的患者中,HBV P区基因突变率尚不具有统计意义上的显著差异。不同年龄段的患者中,HBV P区181位点的突变率具有极显著差异。通过测序技术检测P区位点的突变,可以全面反映P区位点的变异情况,为临床用药和抗病毒新药研发提供重要依据。     

乙型肝炎病毒基因分型与基因变异的临床相关性分析

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)基因分型与基因变异的关系.方法 采用基因测序法检测102例HBV感染者血清标本,用特异的引物对待检标本HBV P区进行全序列测定,对测序结果分析有无突变产生和基因分型.结果 102例HBV感染者标本中基因型分布比例:B基因型12例,阳性率为11.8％;C基因型89例,阳性率为87.3％;D基因型1例,阳性率为0.9％.P区基因序列突变结果显示,102例标本中发生突变的有84例,其中YIDD 50例,占59.5％;YVDD 24例,占28.6％;181V 9例,占10.7％;202G 1例,占1.2％.HBV B、C两基因型间HBV基因变异类型差异无统计学意义.结论 ①天津地区流行的HBV基因型主要是B型和C型,其中C型为优势基因型.②本地区HBV p区基因序列突变与基因分型无明显关系.     

桂林地区乙肝患者HBV基因型分布及S基因变异研究

目的研究桂林地区HBV基因型分布、S基因突变类型以及基因型与乙肝患者血清标志物、DNA载量和S基因突变位点的相关性。方法用巢式PCR方法扩增乙肝患者HBV的S基因,经测序后与标准序列比对,构建系统树进行基因分型,分析S基因的突变位点并通过对相关氨基酸的分析判断血清型,采用t检验和χ2检验统计分析相关性。结果 84例乙肝患者HBV基因型有B型(59.5%)、C型(40.5%)。B基因型中的血清型有adw1型(84%)、ayw1型(4%)、adrq+型(10%)。C基因型中有adrq+型(88.2%),adw1型(8.8%)。S基因突变位点主要为T126I和T143M/S,突变率分别达34.1%和40.0%。基因型与患者年龄及DNA载量具相关性(P<0.05),与乙肝患者血清标志物及S基因突变位点无相关性(P>0.05)。结论桂林地区HBV基因型主要为B型,其次为C型。血清型主要为adw1型和adrq+型。S基因变异点集中,有形成优势变异株的趋势。     

乙型肝炎病毒基因耐药变异的研究现状

抗病毒治疗是慢性乙型肝炎（慢乙肝）最根本的治疗方法。核苷（酸）类似物（NA）是目前慢乙肝抗病毒治疗的主要药物,由于服用方便、抑制病毒作用明显以及不良反应少而被广泛使用。NA药物的作用靶点在于抑制乙肝病毒聚合酶以病毒前基因组RNA为模板逆转录生成病毒DNA,所以不能直接清除已有的病毒共价闭合环状DNA脱氧核糖核酸（cccDNA）,需要长期治疗才能得到持久的应答疗效。然而,随着用药时间的延长,乙型肝炎病毒（HBV）产生耐药的风险也大大增加。YMDD变异所导致的耐拉米夫定现象已受到广泛的关注。随着研究的深入,目前人们发现HBV耐NA相关的基因变异新位点28个,涉及现在临床上应用的所有NA药物。为了便于开展HBV基因耐药突变与NA药物临床应用研究,目前首先需要建立适合于临床使用的全面检测HBV基因耐药突变位点的技术方法,从而有效指导临床用药。本文将就HBV基因耐药突变与NA药物的关系以及基因耐药突变位点检测方法的新进展做一综述。     

应用PCR快速制备乙型、丁型肝炎病毒诊断基因芯片探针

目的应用PCR技术扩增乙型、丁型肝炎病毒保守区域基因片段,并进行克隆、测序分析,制备联合诊断乙型、丁型肝炎病毒基因芯片探针。方法利用Oligo6.4软件分别针对乙型、丁型肝炎病毒基因保守区域设计PCR引物,纯化PCR扩增产物,扩增后的产物克隆至pMD18-T载体并进行快速鉴定,提取阳性克隆质粒进行测序分析及鉴定。结果获得多个乙型、丁型肝炎特异性基因片段。序列分析表明,所扩增的片段均属于乙型、丁型肝炎病毒特异基因。结论利用PCR扩增产物制备基因芯片探针是一种快速、简便的实用方法。     

应用PCR快速制备乙型、丁型肝炎病毒诊断基因芯片探针

目的 应用PCR技术扩增乙型、丁型肝炎病毒保守区域基因片段，并进行克隆、测序分析，制备联合诊断乙型、丁型肝炎病毒基因芯片探针。方法 利用Olig06．4软件分别针对乙型、丁型肝炎病毒基因保守区域设计PCR引物，纯化PCR扩增产物，扩增后的产物克隆至pMDl8-T载体并进行快速鉴定，提取阳性克隆质粒进行测序分析及鉴定。结果 获得多个乙型、丁型肝炎特异性基因片段。序列分析表明，所扩增的片段均属于乙型、丁型肝炎病毒特异基因。结论 利用PCR扩增产物制备基因芯片探针是一种快速、简便的实用方法。     

利用重叠PCR实现乙肝表面抗原CTL表位的替换

目的 以磷酸酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白(glypican-3,GPC3)的CTL表位EYILSLEEL替换HBsAg中内源性CTL表位LLD,构建用于预防和治疗乙肝的DNA疫苗.方法 以重组表面抗原基因pcHBsAg质粒为模板,应用重延伸PCR扩增出含EYILSLEEL表位的HBsAg基因HBsAg/GPC3,将其插入pBSSK+载体中,构建出pBSSK/GPC3载体.利用DNA重组技术将其定向插入真核表达载体pcDNA3.1+中,将真核表达载体经PCR、酶切和测序鉴定,构建表达CTL表位EYILSLEEL的DNA疫苗.结果 酶切和测序的结果显示序列无错配,获得了完整表达EYILSLEEL表位的真核质粒pcDNA3-HBsAg/GPC3.结论 成功将EYILSLEEL表位替换HBsAg的内源性CTL表位,构建了pcDNA3-HBsAg/GPC3真核表达质粒.     

In vitro Recombination and Identification of Mutated Fragment Corresponding to Regulation Region of mtrR Gene of Neisseria Gonorrhoeae

A site-directed mutant DNA fragment was synthesized and transfected into clinical Neisseria Gonorrhoeae(NG) stains to construct the transformants that contained the corresponding mutagenesis of regulation region of mtrR gene.According to the technique of gene splicing by overlap extension(SOEing),a DNA segment with specific mutagenesis was constructed by two-step polymerase chain reaction(PCR).The mutation fragments EF could be used for the next experiment in which the mutation NG strains were induced.By comparing the recombinant EF fragments to the corresponding DNA fragments of clinical NG strains,2 of these were not compatible completely.The results of sequencing revealed that there was a 9 bp deletion between the 45 to 54 inverted repeat sequence localized within the mtrR promoter.It can be confirmed that the fragments EF are the specifically designed mutant fragments.     

几种水稻田土壤微生物总DNA提取方法的比较

目的：使人们在提取土壤总DNA时,可以根据不同的要求选用不同的方法。方法：选用了5种现在较常用的土壤微生物总DNA提取方法从水稻田土壤中提取总DNA,并对5种方法提取的DNA的质量和数量进行比较评价。结果：5种方法都可以从土壤中提取到长度大于48kb的DNA片段,但不同方法提取的DNA的产量存在明显差异。土壤总DNA都不需要纯化就可以用于PCR扩增,使用细菌16SrDNA基因的引物可以扩增得到相应的片段。结论：Bourrain法和Martin-Laurent法可以较快地提取出DNA,Martin-Laurent法提取的DNA的量最多,Tiedje法和Janssen法提取的DNA片段最大,Janssen法提取的DNA纯度最高,Reddy法提取的DNA的完整性和PCR扩增效果最好。     

大鼠4S多环芳香烃结合蛋白对细胞色素P450IAl基因体外转录的激活作用

作者以Hela细胞液体系,研究大鼠细胞色素P450IA-1(P 450 C)基因在4S多环芳香烃(PAH)结合蛋白存在下的体外转录作用。用含大鼠细胞色素P 450 IA1的-880至外显子的第1000碱基对((bp)的质粒pA9[长约1.94千碱基对(kb)],经内切酶切割成不同大小的片段为模板。以插有腺病毒-2大部晚期启动子(Ad-2)的质粒PHML-1作为阳性对照。所得结果显示Hela细胞体系能按模板准确地转录出预期的产物。加入4S PAH-结合蛋白使pA9模板的转录增加2～3倍,而对PHML-1的转录无增强作用,说明4S PAH-结合蛋白是专一加强细胞色素P450IA1基因转录的正调节因素。推测4S PAH-结合蛋白也可能诱导大鼠体内细胞色素P 450 IA1基因的表达。     

Relationship between heterogeneity of HBV preS/S gene and intrauterine transmission

Objective: To study the relationship of the mutation of HBV preS/S gene in HBsAg carrying pregnant women and intrauterine transmission. Methods: Polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify HBV preS/S gene from sera of 8 HBsAg carrying pregnant women, 4 women's neonates infected with HBV, and the other's neonates non-infected with. The PCR products were cloned and 5 clones were chosen from every woman for DNA sequencing. Results: Heterogeneity of HBV preS/S gene in HBsAg carrying pregnant women having intrauterine transmission was much higher than that from having not intrauterine transmission, and the divergence rate of nucleotide sequences also higher strikingly. Conclusion: High heterogeneity of HBV preS/S gene of HBsAg positive pregnant women may be relative to high rate of intrauterine transmis-     

宫内感染乙型肝炎病毒的新生儿及其母亲HBV基因结构分析

目的：探讨HBV基因变惜民宫内感染的关系。方法：扩增2对发生宫内感染的新生儿及母亲血清中2．5kb HBV DNA，克隆、测序并分析其基因结构。同时用免疫染色法检测孕妇胎盘组织HBsAg。结果：母婴HBV DNA序列中，前S1、前S2和S区都发生突变并且导致相应编码蛋白的氨基酸组成发生改变，其中以前S2区突变率为最高（P＜0．01）；而前C、C区基因只有少数核苷酸发生沉默突变、孕妇胎盘组织各层细胞中均有HBsAg阳性信号。结论：新生儿HBV的细胞源性宫内感染可能主要与HBV突变 有前S／S区的基因变异有关，而前C／C区相对比较保守，未见明显相关。